桂文龍，蘇治國，劉運鎮(zhèn)，馬潤澤

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

牛膝多糖（Achyranthes bidentata Polysaccharides，ABPS）是一種從莧科植物牛膝中提取的小分子化合物（陳輝，2018）。植物牛膝是莧科多年生草本植物，具有 “補肝腎，強筋骨，逐瘀通經(jīng)，引血下行” 等功效（王長斌等，2020）。牛膝多糖作為牛膝的主要功能成分之一，具有水溶性好、相對分子質(zhì)量小、易吸收和抗原性好等優(yōu)點（歐淑琦等，2018）。從植物牛膝中提取得到的牛膝多糖具有增強機體免疫功能、抑制腫瘤生長和提高白細胞活性等生理功能（歐淑琦等，2019）。目前，世界各國多項研究表明，在動物飼料中添加一定量的中藥或其活性成分具有促進動物生長，增強機體免疫力，防病、抗病等功能。為此，本試驗研究牛膝多糖對雛雞免疫功能的影響，為臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 試驗動物 1 日齡健康雛雞（120 只），由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實驗動物房提供。

1.2 試驗材料 牛膝多糖（目數(shù)：80 ～120 目，規(guī)格：10 ∶1 20 ∶1）購于寧夏香草生物技術(shù)有限公司；MTT 試劑盒（型號：M1020，規(guī)格：500T）購于上海科艾博生物技術(shù)有限公司；ELISA 試劑盒（型號：LM-0068E，規(guī)格：48T）購于上?？祈樕锟萍加邢薰?；Griess 試劑（型號：SY6046，規(guī)格：10g）購于上海源葉生物科技有限公司；PHA（聚羥基脂肪酸酯）（型號：P0028，規(guī)格：5mg）購于上海寶曼生物科技有限公司。

1.3 常規(guī)飼料 本試驗常規(guī)飼料主要組成及營養(yǎng)水平如下表1。

表1 常規(guī)飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9082MBE）、電子天平（HZF-A+300）、高速離心機（TGL-16gR）、冰箱（BCD-238S）、壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX-400）酶標(biāo)儀（MB16-414）等，均由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院傳染病實驗室提供。

2 試驗方法

2.1 試驗動物分組與處理 將120 只1 日齡雛雞隨機分為4 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 只雛雞（公母各半）。分別在4 組常規(guī)飼料中添加不同劑量的牛膝多糖，低劑量組添加100 mg/kg ；中劑量組添加150 mg/kg ；高劑量組添加200 mg/kg ；對照組未添加牛膝多糖。將所有試驗雛雞連續(xù)飼喂30 日齡，每組取10 只進行取樣。

2.2 血清樣品采集 利用頸靜脈采血法采集血量10 mL/ 只，將采集的血液以3000 r/min 的速度離心10 min，制備血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 免疫器官指數(shù) 將試驗雛雞禁食12 h 后稱重，頸靜脈放血處死，剖解取出胸腺、脾臟和法氏囊，用生理鹽水清洗，去除表面多余羽毛等雜物，用吸水紙吸干表面水分。電子天平稱量各免疫器官的重量，計算免疫器官指數(shù)，具體公式如下：

2.4 T 細胞增殖活性 無菌采集試驗雛雞的胸腺、脾臟，去除表面包膜，將其剪碎，用胰酶消化，使紅細胞裂解，RPMI-1640 調(diào)節(jié)細胞濃度為5×106/mL。取96 孔反應(yīng)板，每孔加入100μL，每個測試做3 個重復(fù)，并設(shè)空白對照，加含PHA的RPMI-1640，每 孔100μL，37 ℃恒 溫 培 養(yǎng)68 h，每孔棄去100μL 上清液，按照MTT 試劑盒說明書對T 細胞增殖活性進行測定，并于酶標(biāo)儀570 nm 處讀取各孔A 值，計算T 細胞增殖率，具體計算公式如下：

2.5 巨噬細胞釋放NO 能力 將脾細胞濃度調(diào)整至1×107個/mL，于24 孔反應(yīng)板中每孔加入1 mL；再加入含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液1 mL，37℃細胞培養(yǎng)2 h 使其貼壁；用PBS洗細胞2 次，每孔加入細胞培養(yǎng)液0.5 mL，培養(yǎng)24 h ；將上清液收集于96 孔反應(yīng)板，每孔加入100μL，每個樣品3 個重復(fù)；在96 孔反應(yīng)板中加入不同濃度的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)品，每孔100μL；各孔加入Griess 試劑100μL，室溫下靜置10 min，在酶標(biāo)儀550 nm 處讀取A 值。

2.6 血清總IgG 按魏婧瑤等（2018）報道的步驟操作，測定雛雞血清中總IgG 的水平。酶標(biāo)板中先后加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或樣品100μL/ 孔、抗體稀釋液50μL/ 孔，封板，振蕩孵育3 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白100μL/ 孔，封板后室溫孵育30 min，棄液洗板，在各孔依次加入顯色劑底物TMB 和終止液，30 min 內(nèi)讀取吸光值，測定血清中總IgG 的水平。所有試劑在使用前均先平衡至室溫，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均需做3 個重復(fù)，且每次分析均做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 將所有試驗數(shù)據(jù)錄入SPSS 24.0 進行單因素方差分析，采取SNK 法進行兩兩比較，結(jié)果以 “平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差” 表示，P＜0.05 表示組間差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 對免疫器官指數(shù)的影響 由表2 可知，各試驗組牛膝多糖對雛雞胸腺指數(shù)存在明顯差別，中劑量組和高劑量組胸腺指數(shù)與低劑量組和對照組差異顯著（P＜0.05），中劑量組和高劑量組之間差異不顯著（P＞0.05）；中劑量組和高劑量組法氏囊指數(shù)與低劑量組和對照組差異顯著（P＜0.05），中劑量組和高劑量組相比差別不顯著（P＞0.05）；各試驗組雛雞脾臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

表2 牛膝多糖對雛雞免疫器官指數(shù)的影響

3.2 對T 細胞增殖活性的影響 由表3 可知，各試驗組雛雞T 細胞增殖活性A 值與對照組差異顯著（P＜0.05），各試驗組之間的差異不顯著（P＞0.05）。

表3 牛膝多糖對雛雞T 細胞增殖活性A 值的影響

3.3 對巨噬細胞釋放NO 能力的影響 由表4 可知，各試驗組雛雞的巨噬細胞釋放NO 水平上，高劑量組與對照組和低劑量組差異顯著（P＜0.05），中劑量組與高劑量組、中劑量組與低劑量組和對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表4 牛膝多糖對雛雞巨噬細胞釋放NO 能力的影響

3.4 對血清總IgG 的影響 由表5 可知，各試驗組雛雞血清總IgG 水平與對照組差異不顯著（P＞0.05），高劑量組與低劑量組之間、各試驗組之間差異顯著（P＜0.05）。

表5 牛膝多糖對雛雞血清總IgG 水平的影響

4 討論

4.1 牛膝多糖對雛雞免疫器官指數(shù)的影響 動物機體的自身免疫系統(tǒng)包括自身的免疫器官、免疫細胞及免疫分子，禽類免疫器官主要是胸腺、脾臟及法氏囊等。其中胸腺作為T 淋巴細胞在機體內(nèi)產(chǎn)生的基礎(chǔ)部位，主要參與機體的細胞免疫；法氏囊是B 淋巴細胞產(chǎn)生和分化的部位，主要參與體液免疫；脾臟則是禽類最大的外周免疫器官，是免疫應(yīng)答的重要場所，也是產(chǎn)生抗體和效應(yīng)細胞的重要場所（張瀟等，2021）。免疫器官指數(shù)是衡量動物免疫器官發(fā)育狀況、體質(zhì)量變化進而間接反映動物應(yīng)對外界應(yīng)激能力的重要指標(biāo)（Wu等，2018）。

本試驗可知，牛膝多糖可使雛雞胸腺、脾臟和法氏囊的指數(shù)增長，增強機體抵抗病原能力。這與其他學(xué)者的研究相似，如雷莉輝等（2017）將不同劑量的香菇多糖添加在肉仔雞飼料中，其免疫器官指數(shù)顯著高于對照組。方磊涵等（2018）報道，中藥復(fù)方多糖組的胸腺指數(shù)與對照組差異顯著或極顯著。

4.2 牛膝多糖對雛雞T 細胞增殖活性的影響淋巴細胞是動物機體最重要的免疫細胞，淋巴細胞的增殖和分化是機體在免疫應(yīng)答過程中最重要的階段，其增殖程度是反映機體細胞免疫水平的一個重要指標(biāo)（朱軼鋒等，2018）。T 細胞主要介導(dǎo)細胞免疫，其增殖分化的能力越強，對侵入機體病原的抵抗能力就越強。

本試驗發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖可有效提高雛雞T 細胞的生長和增殖活性。張萍等（2015）報道，靈芝多糖既可以單獨促進雞外周血淋巴細胞增殖，也可以與ConA 共同促進雞外周血淋巴細胞增殖。

4.3 牛膝多糖對雛雞巨噬細胞釋放NO 能力的影響 在動物免疫系統(tǒng)中，巨噬細胞參與了機體的特異性免疫和非特異性免疫，并通過吞噬機體各種有害物質(zhì)、遞呈各種類型的抗原及其分泌細胞因子等方式來發(fā)揮其免疫調(diào)控作用，NO 的自我分泌也是巨噬細胞生長和活化的主要特點之一。

本試驗發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖可促進巨噬細胞釋放NO，更好地發(fā)揮抗菌作用。崔小珍等（2020）試驗結(jié)果表明，松針多糖可促進巨噬細胞iNOS 的表達，提高NO 的生成，進而促進巨噬細胞的吞噬能力。

4.4 牛膝多糖對雛雞血清總IgG 的影響 IgG 是動物體內(nèi)的主要抗體之一，含量最高，可以通過血管壁滲透到組織中去，具有廣泛的抗傳染作用，還具有調(diào)理、凝集和沉淀抗原的能力。

從本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛膝多糖可以提升雛雞血清總IgG 水平。Li 等（2020）研究表明，飼料中添加鷹山玄武綠茶多糖可增加胸腺和法氏囊的重量和血清中IgA 和IgG 的濃度。

5 結(jié)論

綜上所述，在雛雞常規(guī)飼料中添加不同水平的牛膝多糖在一定程度上能提高機體免疫器官指數(shù)、T 細胞增殖活性、巨噬細胞釋放NO 能力和血清總IgG 水平，對增強雛雞免疫功能有一定作用。在本試驗條件下，牛膝多糖的最適添加量為150 mg/kg。