陳甫 劉斌 和帥軍 趙勇 王偉周

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科 （北京 100037）

男性不育問題在現(xiàn)代社會(huì)越來(lái)越普遍，影響眾多夫婦生育健康，了解男性不育患者精液質(zhì)量及其與其他因素之間的關(guān)系，對(duì)于找到潛在治療方法和預(yù)防策略至關(guān)重要。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)，育齡期夫婦有正常性生活超過1 年且沒有任何避孕措施，在排除女方不孕問題情況下，由于男方原因?qū)е屡轿茨軕言蟹Q為男性不育［1］。有研究表示［2］，微量元素雖在人體體內(nèi)含量較少，但對(duì)其各種生物學(xué)功能十分重要，微量元素?cái)z入過量、缺乏等均會(huì)在一定程度上導(dǎo)致人體生理異?；蚣膊“l(fā)生。近年大量研究表明［3］，精液質(zhì)量是評(píng)估男性生育能力的重要指標(biāo)，精漿微量元素與精子質(zhì)量聯(lián)系密切，其可通過參與男性生殖系統(tǒng)多種酶的構(gòu)成與激活，促進(jìn)其合成性激素，進(jìn)而通過精子發(fā)生、成熟等方式影響男性生殖系統(tǒng)的生理功能。外泌體（exosome）作為新型液體活檢指標(biāo)，廣泛存在于人體多種體液中，與疾病發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系密切，可通過運(yùn)輸脂質(zhì)、miRNA、蛋白質(zhì)等信號(hào)分子進(jìn)入受體細(xì)胞，并作用于受體細(xì)胞的靶基因中，影響其功能，參與多種生理、病理過程。而生殖細(xì)胞分泌外泌體可攜帶miRNA 進(jìn)入到受體細(xì)胞中，調(diào)控其基因表達(dá)，導(dǎo)致人體細(xì)胞功能改變以及生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展［4］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-184 靶基因富集于男性生殖系統(tǒng)的發(fā)育中，其細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞分化等與男性生殖、精子產(chǎn)生密切相關(guān)。此外，miR-184 作為miRNA 家族主要的成員，在人體中相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本分子量通常為84 bp，而成熟的miR-184 表達(dá)于男性睪丸組織中，其在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的生理功能，與男性不育聯(lián)系密切［5］。但目前關(guān)于微量元素水平、miR-184 表達(dá)與男性不育關(guān)系報(bào)道較少，因此本研究通過探討男性不育患者精液質(zhì)量與精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 水平的關(guān)系，為之后臨床治療該類疾病提供醫(yī)學(xué)參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取本院2022 年1 月至2023 年7月收治的155 例男性不育患者為不育組，另選取同期155 名體檢正常者為正常組。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），具有可比性，見表1。本次研究開始前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2021-02 號(hào)）。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

組別不育組（n = 155）正常組（n = 155）t值P值年齡（歲）28.11±3.35 27.95±3.64 0.403 0.688體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（kg/m2）25.95±2.26 26.11±2.02 0.657 0.512體質(zhì)量（kg）79.89±6.56 80.11±6.34 0.300 0.764腰圍（cm）92.16±8.56 91.89±8.76 0.274 0.784

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）不育組符合《男性生殖遺傳學(xué)檢查專家共識(shí)》［6］中不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，正常組為健康男性；（2）不育組為性生活正常，未行避孕措施1年以上無(wú)法生育，且排除女方不孕問題，因男方因素導(dǎo)致女方不育者；（3）兩組均簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）存在泌尿道手術(shù)史；（2）存在生殖感染史；（3）家族存在男性生殖功能相關(guān)疾病史；（4）研究前6 個(gè)月應(yīng)用過抗心律失常、溶栓藥物、免疫抑制劑等影響本研究結(jié)果藥物；（5）合并心、肝、腎等臟器異常者；（6）認(rèn)知、精神功能異常者；（7）合并射精管疾病、前列腺等影響測(cè)量精液體積的疾病。

1.4 方法（1）精液質(zhì)量參數(shù)：①標(biāo)本采集：囑禁欲3～7 d，自慰法取精液置于無(wú)菌容器中，存于37 ℃溫育30 min，等待完全液化。②精液質(zhì)量檢測(cè)：嚴(yán)格參考WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》［7］進(jìn)行操作，等待精液完全液化后，使用CASA全自動(dòng)精子分析儀（西班牙MICROPTIC 公司）檢測(cè)精子密度、精子總活力（PR+NP）、前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）、精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、精子平均直線運(yùn)動(dòng)速度、精子平均路徑運(yùn)動(dòng)速度、精子頭部側(cè)向平均振幅（ALH）。（2）精漿微量元素水平檢測(cè)：精液采集2 h 內(nèi)，使用離心機(jī)（SIGMA 公司，型號(hào)：3-15）以3 000 r/min 轉(zhuǎn)速，離心10 min，去除精子細(xì)胞獲得精漿，采用原子吸收分光光度儀（濰坊華盛醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：SK6880 型）檢測(cè)精漿中鋅（Zn）、銅（Cu）、鎂（Mg）、鈣（Ca）、鐵（Fe）、鉛（Pb）水平。（3）精漿外泌體中miR-184 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)：①精漿外泌體提取與鑒定：獲得精漿方式同（2），然后按照ExoQuick-TM 試劑盒（美國(guó)SBI 公司）說(shuō)明書進(jìn)行操作，取100 μL 加入150 μL 磷酸緩沖鹽（PBS）溶液（上海博湖生物科技有限公司，貨號(hào)：BH-6605）稀釋，然后加入63 μL ExoQuick 試劑混勻，離心分離出外泌體，最后使用透射電子顯微鏡（北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司，型號(hào)：Talos F200X S/TEM）鑒定所提取的外泌體的形態(tài)、大小以及微結(jié)構(gòu)。②RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 法：采用美國(guó)Thermo 公司生產(chǎn)的Trizol 試劑提取總RNA，使用One Step Prime Script miRNA c DNA 合成試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)精漿外泌體中的miR-184 水平，應(yīng)用相對(duì)定量法來(lái)計(jì)算miR-184 的相對(duì)表達(dá)量，公式：2-ΔCt值=2-ΔCt值（miR-184）-2-ΔCt（miR-39），miR-39 為外參基因。（4）通過Spearman 秩相關(guān)分析男性不育患者精液質(zhì)量與微量元素水平及外泌體中miR-184 水平的相關(guān)性。r值：0.1 ≤ 低度相關(guān) ≤ 0.3，0.3 ＜ 中度相關(guān)≤ 0.7，0.7 ＜ 高度相關(guān)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法選用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)分析檢驗(yàn)；以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組精液質(zhì)量參數(shù)比較不育組精子濃度、精子總活力（PR+NP）、前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）、精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、精子平均直線運(yùn)動(dòng)速度、精子平均路徑運(yùn)動(dòng)速度、精子頭部側(cè)向平均振幅（ALH）顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組精液質(zhì)量參數(shù)比較Tab.2 Comparison of semen quality parameters between two groups ±s

表2 兩組精液質(zhì)量參數(shù)比較Tab.2 Comparison of semen quality parameters between two groups ±s

精液參數(shù)精子濃度（106/mL）PR+NP（%）PR（%）精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度（μm/s）精子平均直線運(yùn)動(dòng)速度（μm/s）精子平均路徑運(yùn)動(dòng)速度（μm/s）ALH（μm）不育組（n = 155）36.05±6.25 42.56±7.11 35.25±5.23 31.15±4.12 13.19±2.12 15.85±2.12 1.62±0.16正常組（n = 155）45.98±9.56 51.15±6.56 42.65±7.15 40.22±5.85 19.15±3.12 23.45±5.12 2.38±0.21 t值10.824 11.055 10.400 15.782 19.671 17.075 35.840 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 相對(duì)表達(dá)量比較兩組Fe 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），不育組Zn、Mg、Ca 水平顯著低于正常組，Cu、Pb 水平及miR-184 相對(duì)表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見表3。

表3 兩組精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 相對(duì)表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of trace element levels and relative expression levels of miR-184 in seminal plasma exosomes between two groups ±s

表3 兩組精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 相對(duì)表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of trace element levels and relative expression levels of miR-184 in seminal plasma exosomes between two groups ±s

組別不育組（n = 155）正常組（n = 155）t值P值Zn（μmol/L）8.19±2.65 14.26±2.35 21.336 0.000 Cu（μmol/L）41.85±4.05 21.56±2.16 55.035 0.000 Mg（mmol/L）0.87±0.02 0.93±0.11 6.681 0.000 Ca（mmol/L）1.98±0.23 2.36±0.14 17.570 0.000 Fe（mmol/L）8.36±1.12 8.29±1.22 0.526 0.599 Pb（μg/mL）10.95±2.11 5.46±1.05 29.001 0.000 miR-184 1.25±0.19 0.72±0.15 27.258 0.000

2.3 男性不育患者精液質(zhì)量與精漿微量元素水平的相關(guān)性男性不育患者Zn、Cu 元素水平分別與精子濃度、PR+NP、PR 呈正、負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05），Pb 元素水平與ALH 呈負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05），見表4。

表4 男性不育患者精液質(zhì)量與精漿微量元素水平的相關(guān)性Tab.4 Correlation between semen quality and trace element levels in semen of male infertility patients r 值

2.4 男性不育患者精液質(zhì)量與外泌體中miR-184相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性男性不育患者miR-184 相對(duì)表達(dá)量與精子濃度、PR+NP、PR、精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度呈負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05），見表5。

表5 男性不育患者精液質(zhì)量與外泌體中miR-184 相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性Tab.5 Correlation between semen quality and relative expression of miR-184 in exosomes of male infertility patientsr 值

3 討論

Zn、Mg、Ca 等各種微量元素以游離或結(jié)合形式存在于男性精漿中，可作為營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)促進(jìn)其精子成熟，與男性生殖系統(tǒng)發(fā)育、性功能以及性激素水平密切相關(guān)，其中某些元素代謝異?？梢l(fā)男性不育癥［8］。既往研究證實(shí)［9］，外泌體主要由各種不同的細(xì)胞分泌，穩(wěn)定存在于人體體液中，可直接反映其細(xì)胞生理、病理改變。同時(shí)外泌體可攜帶miRNA 等特定功能性分子無(wú)障礙進(jìn)入其受體細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)控受體細(xì)胞的基因表達(dá)。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道［10］，男性精漿中含有外泌體，其所含微囊泡可保護(hù)mRNA，且miRNA 與男性不育聯(lián)系密切，因而檢測(cè)外泌體中miRNA 對(duì)男性不育分子標(biāo)志物研發(fā)具有積極意義，但關(guān)于精漿外泌體中miR-184在男性不育患者表達(dá)變化特征以及價(jià)值報(bào)道頗少。因此本研究觀察男性不育患者精液質(zhì)量與精漿微量元素水平及精漿外泌體中miR-184 水平的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，不育組精子濃度、PR+NP、PR、精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度、精子平均直線運(yùn)動(dòng)速度、精子平均路徑運(yùn)動(dòng)速度、ALH 顯著低于正常組，提示男性不育發(fā)生后，其精子質(zhì)量隨之降低，且精漿外泌體中miR-184 水平和男性不育發(fā)生聯(lián)系密切。有研究［11］指出，男性不育可能與生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能異常有關(guān)，如阻塞性精索靜脈曲張、輸精管堵塞、附睪炎等問題會(huì)導(dǎo)致男性不育患者精子無(wú)法正常到達(dá)射精液中。同時(shí)，睪丸作為男性精子產(chǎn)生地，睪丸損傷、睪丸發(fā)育異常、睪丸炎癥等異常會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量減少或質(zhì)量下降。而睪酮作為主要的男性激素，其分泌異常可影響其精子質(zhì)量［12］。此外，吸煙、飲酒過量、藥物濫用、暴露于有害化學(xué)物質(zhì)或輻射等不良生活方式、環(huán)境因素以及染色體異常、單基因疾病等遺傳疾病也可能導(dǎo)致男性不育和精子質(zhì)量下降［13］。又有研究指出［14-16］，miR-184 表達(dá)于男性睪丸、腦組織以及上皮組織，且睪丸中miR-184 表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腦組織，是睪丸特異性高表達(dá)的miRNA。此外，男性一般出生后，其睪丸組織中miR-184 表達(dá)隨著睪丸的發(fā)育持續(xù)升高，且miR-184 表達(dá)顯著聚集于與精子發(fā)生聯(lián)系密切的睪丸生精細(xì)胞中。因而推測(cè)精漿外泌體中miR-184 可能來(lái)源于睪丸組織中的生精細(xì)胞，男性不育患者由于精子功能發(fā)生改變以及生精細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而導(dǎo)致精漿外泌體miR-184 的水平顯著高于正常男性，與本研究結(jié)果相互印證。

本研究結(jié)果顯示，不育組Zn、Mg、Ca 水平顯著低于正常組，Cu、Pb 水平及miR-184 相對(duì)表達(dá)量高于正常組，男性不育患者Zn 元素水平與精子濃度、PR+NP、PR呈正相關(guān)，Cu元素水平與精子濃度、PR+NP、PR呈負(fù)相關(guān)，Pb元素水平與ALH呈負(fù)相關(guān)，與BARBU 等［17］研究結(jié)論相符。BEIGIHARCHEGANI等［18］研究指出，Zn 不僅是人體不可或缺的微量元素之一，還是男性精液中最關(guān)鍵的微量元素之一，在其男性生殖系統(tǒng)含量較高，能有效緩解男性精子膜脂質(zhì)氧化，保持胞膜結(jié)構(gòu)完整性、穩(wěn)定性。同時(shí)，Zn 元素存在于男性睪丸內(nèi)的睪細(xì)胞中，參與精子生成、獲能、成熟過程以及腦垂體促性腺激素的調(diào)節(jié)，因此當(dāng)男性不育患者精漿中Zn 元素缺乏時(shí)，會(huì)對(duì)其精子發(fā)生、成熟、獲能過程以及性腺內(nèi)分泌功能、生殖功能造成負(fù)面影響，并導(dǎo)致精子功能、性腺內(nèi)分泌功能及生殖功能障礙，影響其活性，降低精子質(zhì)量與活性，最終造成不育［19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，男性不育患者精漿中Cu 元素水平明顯升高，且與其精子密度、PR+NP、PR 呈負(fù)相關(guān)，原因可能是Cu 作為許多酶的特有活性成分，水平增高不僅直接減弱男性不育患者精子活力，還會(huì)通過干擾垂體分泌功能，影響其精子活力，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降［22-23］。此外本研究中男性不育患者Pb 水平較高，Pb 元素水平與精子頭部側(cè)向平均振幅呈負(fù)相關(guān)，主要是由于Pb 對(duì)男性不育患者生殖系統(tǒng)具有毒性作用，含量過多會(huì)過度消耗其體內(nèi)抗氧化物酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致男性生殖功能出現(xiàn)障礙，即使Pb 濃度較低亦會(huì)對(duì)其精子頭部側(cè)向平均振幅造成影響［24-25］。

本研究結(jié)果顯示，男性不育患者miR-184 相對(duì)表達(dá)量與精子濃度、PR+NP、PR、精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度呈負(fù)相關(guān)，提示隨著男性不育患者miR-184相對(duì)表達(dá)量的顯著升高，其精子濃度、PR+NP、PR會(huì)降低，精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度會(huì)減弱。有研究［26］表示，高表達(dá)miR-184 可干擾男性不育患者精子正常發(fā)育和成熟過程，致使精子產(chǎn)生或釋放異常，導(dǎo)致其精子數(shù)量減少、密度降低。同時(shí)，miR-184的高表達(dá)可能與炎癥反應(yīng)和損傷修復(fù)密切相關(guān)，如男性不育患者存在炎癥反應(yīng)或損傷，可導(dǎo)致miR-184表達(dá)增加，進(jìn)而影響到精子數(shù)量和密度［27］。而又有研究［28］表示，miR-184 作為一種微小RNA，在男性不育患者細(xì)胞內(nèi)起著負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的作用，當(dāng)精漿外泌體中miR-184 的表達(dá)量增加時(shí)，其可通過抑制特定基因表達(dá)，影響精子活動(dòng)力相關(guān)基因表達(dá)，從而降低精子活動(dòng)率。同時(shí)，高表達(dá)的miR-184 可干擾男性不育患者精子形態(tài)和結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育，致使其精子運(yùn)動(dòng)能力較弱，無(wú)法有效地前進(jìn)或到達(dá)目標(biāo)地點(diǎn)，懷疑可能與精子形態(tài)異常、精子運(yùn)動(dòng)能力減弱、精子鞭毛缺陷等問題密切相關(guān)［29］。本研究中男性不育患者miR-184 相對(duì)表達(dá)量與精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度呈負(fù)相關(guān)，主要是由于高表達(dá)的miR-184 通過靶向調(diào)控男性不育患者精子運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)基因，干擾精子能量代謝通路和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育，促使其發(fā)生精子鞭毛缺陷、線粒體功能異常等問題，并導(dǎo)致精子存活能力下降，游動(dòng)時(shí)間縮短，進(jìn)而致使精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度降低［30-31］?；谝陨戏治?，證實(shí)微量元素水平及外泌體中miR-184 水平可能為男性不育治療提供參考，故今后治療男性不育可嘗試性指導(dǎo)患者攝入微量元素相關(guān)藥物及針對(duì)miR-184指標(biāo)的相應(yīng)藥物用于改善其精液質(zhì)量。這些措施可能會(huì)對(duì)男性不育患者的治療產(chǎn)生積極影響，但具體效果還需要進(jìn)一步的研究和臨床實(shí)踐來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，男性不育患者精液質(zhì)量與微量元素水平及外泌體中miR-184 水平密切相關(guān)，微量元素水平及外泌體中miR-184 水平可能為男性不育治療提供指導(dǎo)。此外，本研究仍存在一定局限性，如男性不育患者精液質(zhì)量可能受年齡等較多因素影響，本文更多的是觀察微量元素與miR-184指標(biāo)，后續(xù)研究可納入更多相關(guān)臨床指標(biāo)。

【Author contributions】CHEN Fu performed the experiments and wrote the article.LIU Bin performed the experiments.HE Shuaijun and ZHAO Yong revised the article.WANG Weizhou designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.