劉永 程曉雷 崔香麗 唐顥 陳還珍

1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系（太原 030012）；2南京鼓樓醫(yī)院（南京 210008）；3國(guó)家心血管病中心華中分中心（鄭州 450003）；4山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院（太原 030001）

腫瘤和心血管疾病是目前全球發(fā)病率和病死率最高的兩大類疾?。?-2］。隨著腫瘤治療藥物和方法的日益精進(jìn)，與腫瘤治療相關(guān)的心血管疾病對(duì)患者的生存率與生存質(zhì)量的影響愈發(fā)凸顯出來(lái)，化療藥物可對(duì)動(dòng)脈血管的功能產(chǎn)生長(zhǎng)期的負(fù)面影響，使其功能發(fā)生紊亂，引起一系列血管并發(fā)癥［3-4］。其中，以化療相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化（athero?sclerosis， AS）最具代表性，嚴(yán)重威脅腫瘤患者的生存健康與生存質(zhì)量［5］。以順鉑為代表的常規(guī)化療藥物的應(yīng)用與化療相關(guān)AS 聯(lián)系最為密切［6］。此外，蒽環(huán)類化療藥物可引起血管功能損傷，增加心血管事件風(fēng)險(xiǎn)［7-8］。這表明常規(guī)化療藥物的應(yīng)用與腫瘤患者的AS 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。

AS 是膽固醇代謝紊亂衍生的疾病。巨噬細(xì)胞吞噬富含膽固醇的氧化低密度脂蛋白或其他修飾的脂蛋白后成為泡沫細(xì)胞，隨后沉積于內(nèi)皮下形成“脂質(zhì)條紋”，是AS 早期病變的標(biāo)志［9］。因此，維持膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài)，對(duì)延緩泡沫細(xì)胞形成及AS 病變的發(fā)展至關(guān)重要。

巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積是刺激巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)變的直接原因［10］。巨噬細(xì)胞的膽固醇代謝過(guò)程主要涉及以下環(huán)節(jié)：膽固醇攝取、內(nèi)源合成、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、酯化與外排等。其中類固醇受體激活物（steroid receptor activator， SR-A）、B 類Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptor class B member 1，SRB1）等清道夫受體介導(dǎo)膽固醇的攝?。?1］；C 型1 類尼曼-匹克（Niemann-Pick type C1， NPC1）蛋白介導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)［12］；固醇?；D(zhuǎn)移酶1 和2（sterol O-acyltransferase 1/2， SOAT1/SOAT2）介導(dǎo)膽固醇酯化［13］；而24-脫氫膽固醇還原酶（24-dehydrocho?lesterol reductase， DHCR24）是膽固醇合成的關(guān)鍵酶［14］；細(xì)胞內(nèi)中性膽固醇酯水解酶（neutral choles?teryl ester hydrolases， NCEHs）可水解膽固醇酯［15］；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cas?sette transporters A1， ABCA1）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ATP-binding cassette transporters G1，ABCG1）介導(dǎo)膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)，將膽固醇排出胞外［16］。在本研究中，我們利用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 探討了化療藥物（阿霉素和順鉑）對(duì)其膽固醇代謝和泡沫化的影響，并在此基礎(chǔ)上，借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段篩查細(xì)胞在化療應(yīng)激情況下的基因表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7和人胚胎腎細(xì)胞HEK293T購(gòu)自于美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心（american type culture collection，ATCC）。用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)皿、載玻片及蓋玻片購(gòu)于BIOFIL 公司，高糖DMEM 培養(yǎng)基、蛋白酶抑制劑及胎牛血清購(gòu)于DiNing 公司，PEI 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Polysciences 公司，ECL 發(fā)光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol 試劑及Q-PCR 試劑盒購(gòu)于南京Vazyme公司，DHCR24、ABCG1、ROBO3 抗體購(gòu)于Protein?tech 公司。RIPA 裂解液及組織細(xì)胞脂質(zhì)水平測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司，oxldl及dil-oxldl 購(gòu)于廣州奕元生物有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、蛋白Marker 及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司；VICTOR Nivo 酶標(biāo)儀購(gòu)于珀金埃爾默公司，油紅O 染液購(gòu)于南京建成科技有限公司。

1.3 RNA 測(cè)序（RNA?seqence） 所有RNA-seq 實(shí)驗(yàn)均至少2 次生物重復(fù)。細(xì)胞在化療藥物（DOX-0.2 μmol/L 或CPT- 5 μmol/L）處理24 h 后，加入Trizol 試劑（Life Technologies）提取和純化RNA。用DnaseI（Sigma）進(jìn)一步處理RNA，然后用RNeasy mini 試劑盒（Qiagen）純化。NEBNext rRNA Deple?tion Kit（New England BioLabs）和NEBNext Ultra II Directional RNA Kit（New England BioLabs）分別用于去除核糖體RNA 和制備RNA-seq 文庫(kù)。文庫(kù)匯集后在HiSeq 平臺(tái)（Illumina）上測(cè)序，每端讀長(zhǎng)配置為150 bp。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建 PHBLV-shCtrl-ZsGreen-puro 質(zhì)粒購(gòu)于漢恒生物公司，將目的片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中。shROBO3 的引物序列如下：Forward primer（5'-3'）：GATCCGGGGAAGAGCTACAGACC?TTTTCAAGAGAAAGGTCTGTAGCTCTTCCCTTTTT?TC；Reverse primer （5'-3'）：ATTGAAAAAAGGGAA?GAGCTACAGACCTTTCTCTTGAAAAGGTCTGTAGC?TCTTCCCCG，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.5 病毒包裝與感染 病毒包裝骨架質(zhì)粒PSPAX2，PMD2G和PHBLV-shROBO3-ZsGreen-puro或PHBLVshCtrl-ZsGreen-puro 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，48 h 后，收集細(xì)胞上清的病毒顆粒，隨后感染RAW 264.7 細(xì)胞，48 h 后用嘌呤霉素藥物進(jìn)行篩選，細(xì)胞密度達(dá)到80% ~ 90%時(shí)進(jìn)行傳代，建立ROBO3穩(wěn)定敲低細(xì)胞株（shROBO3 細(xì)胞）和對(duì)照細(xì)胞株（shCtrl 細(xì)胞）。

1.6 油紅O 染色實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞鋪種于細(xì)胞爬片上，并進(jìn)行相應(yīng)處理；PBS 清洗細(xì)胞后，用4 %多聚甲醛固定細(xì)胞20 min；雙蒸水清洗細(xì)胞后，加入提前配制好的油紅O 染液，染色10 ~ 15 min；雙蒸水洗去染色液后用蘇木素復(fù)染液細(xì)胞核；雙蒸水洗去復(fù)染液后，滴加水性封固劑，用細(xì)胞爬片進(jìn)行封片；顯微鏡下進(jìn)行拍攝。

1.7 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平測(cè)定 收取一定數(shù)量細(xì)胞，加入10 倍細(xì)胞壓積的裂解液，震蕩混勻，靜置10 min。轉(zhuǎn)移上清到離心管中，70 ℃加熱10 min，室溫2 000g離心5 min，取上清進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot） 收集細(xì)胞到離心管中，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解，高速離心，收集上清于新的離心管，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液后98 ℃變性10 min，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC 膜上，以5 %的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，加入對(duì)應(yīng)一抗后于4 ℃搖床過(guò)夜孵育，之后TBST 洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗膜，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量Q?PCR 收集細(xì)胞，用Triol 試劑提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以ACTIN 作為內(nèi)參校正，以3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均結(jié)果作為結(jié)果，本文Q-PCR 引物序列見(jiàn)表1，PCR 儀反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸30 s（共35 個(gè)循環(huán)）。以2-△△Ct法計(jì)算相應(yīng)基因的mRNA 表達(dá)水平。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Tab.1 Primer sequence in study

1.10 脂質(zhì)吸附和內(nèi)吞實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)參考以往的研究［18-19］，將細(xì)胞接種至預(yù)先鋪細(xì)胞爬片的12 孔板，進(jìn)行相應(yīng)誘導(dǎo)，用PBS 清洗細(xì)胞后，加入含dil-oxldl（20 μg/mL）的培養(yǎng)基進(jìn)行孵育，分別在4 ℃孵育2 h（檢測(cè)脂質(zhì)與巨噬細(xì)胞膜的結(jié)合，binding）或37 ℃孵育4 h（檢測(cè)脂質(zhì)的內(nèi)吞，uptake），PBS 清洗后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS 清洗后加入DAPI 染液染核10 min，共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行鏡檢及拍攝。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 8.0 軟件完成，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的基礎(chǔ)上進(jìn)行Tukey 檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化療藥物導(dǎo)致巨噬細(xì)胞泡沫化水平增加 使用兩種常規(guī)化療藥物：阿霉素（DOX）和順鉑（CPT）分別處理RAW264.7，48 h 后，進(jìn)行油紅O 染色評(píng)估巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積水平，結(jié)果顯示，與未處理組相比，化療藥物處理組的細(xì)胞胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增加（圖1A、1C），統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1B 和1D 所示，脂滴含量分別增加了2.270 ± 0.098 和2.271 ±0.164 倍（P< 0.01 和P< 0.05）。隨后，我們測(cè)定了各組細(xì)胞胞內(nèi)的甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和膽固醇酯（CE）的水平，結(jié)果如圖所示，化療藥物處理后，巨噬細(xì)胞中TG、TC 和CE 的水平顯著高于對(duì)照組，其中，DOX 處理組的TG、TC 和CE 的水平分別增加了1.948 ± 0.948（P< 0.01）、1.628 ± 0.627（P< 0.01）和1.492 ± 0.492 倍（P< 0.05）（圖1E），CPT 處理組則分別增加了4.336 ± 0.252（P< 0.01）、1.817 ± 0.022（P< 0.01）和2.617 ± 1.617倍（P< 0.001）（圖1F）。以上結(jié)果說(shuō)明，巨噬細(xì)胞經(jīng)阿霉素或順鉑類化療藥物處理后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)水平明顯增加，泡沫化加劇。

圖1 化療藥物加劇巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞泡沫化Fig.1 Chemotherapeutic drugs exacerbated macrophage foaminess in RAW264.7

DOX處理RAW264.7細(xì)胞48 h后加入20 μg/mL的熒光標(biāo)記的oxldl （dil-oxldl），并分別在4 ℃孵育2 h（檢測(cè)oxldl 與巨噬細(xì)胞的膜結(jié)合能力）或37 ℃孵育4 h（檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)oxldl 的內(nèi)吞能力），隨后使用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，化療藥物處理組dil-oxldl 與細(xì)胞膜的結(jié)合以及細(xì)胞胞內(nèi)dil-oxldl 的水平并沒(méi)有顯著差異（圖2A-D）。以上結(jié)果提示，化療藥物對(duì)巨噬細(xì)胞的膽固醇攝入過(guò)程無(wú)影響。

圖2 化療藥物處理對(duì)RAW264.7 的脂質(zhì)結(jié)合和吞噬無(wú)影響Fig.2 Chemotherapeutic drugs did not affect lipid binding and uptake in RAW264.7

綜上所述，化療藥物刺激可加劇巨噬細(xì)胞泡沫化，但化療藥物引起的胞內(nèi)脂滴蓄積與胞內(nèi)膽固醇攝取過(guò)程無(wú)關(guān)。

2.2 探索化療藥物引起巨噬細(xì)胞泡沫化的效應(yīng)靶標(biāo) 利用化療藥物（DOX 或CPT）處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，24 h 后提取RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以log2倍數(shù)變化≥ 5 和P值< 0.05 作為基因表達(dá)顯著上調(diào)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，并將DOX 和CPT 處理后顯著上調(diào)的基因進(jìn)行交互分析，結(jié)果如圖3A 所示，篩出12 個(gè)共同顯著上調(diào)的基因，基因信息在表2 中展示。差異基因火山圖顯示，軸突導(dǎo)向因子受體3（ROBO3）在兩種化療藥處理后表達(dá)升高最為顯著（圖3B）。

圖3 化療藥物處理RAW264.7 后ROBO3 水平明顯增高Fig.3 ROBO3 levels increased in chemotherapeutic drug-treated RAW264.7

表2 RAW264.7 經(jīng)過(guò)DOX 或CPT 處理后共同表達(dá)變化的基因Tab.2 Co-altered genes in RAW264.7 treated with DOX and CPT

2.3 ROBO3 在化療誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中表達(dá)水平先增高后降低 分別用DOX 和CPT 處理RAW264.7，在0、12、24、48、72 h 收集細(xì)胞，Western blot 檢測(cè)ROBO3 的蛋白表達(dá)水平變化。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致，ROBO3 的表達(dá)水平于DOX 和CPT 刺激24 h 內(nèi)均表達(dá)增高；然而，在兩種化療藥物誘導(dǎo)48 h 之后，ROBO3 則均出現(xiàn)表達(dá)缺陷（圖4A、B）。ROBO3 的表達(dá)改變是否參與調(diào)控化療引起的巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程，值得進(jìn)一步探討。

圖4 ROBO3 的表達(dá)在化療藥物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中先增高后降低Fig.4 ROBO3 was increased and then decreased during chemotherapy-induced macrophage foaminess

2.4 沉默ROBO3 加劇巨噬細(xì)胞膽固醇蓄積 利用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定敲低ROBO3 的RAW264.7 細(xì)胞，Western blot 驗(yàn)證ROBO3 敲低效果（圖5A），隨后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)水平，結(jié)果顯示，沉默ROBO3 后胞內(nèi)甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）和膽固醇酯（CE）水平在正常情況下并沒(méi)有明顯改變，但在氧化性低密度脂蛋白（oxldl）的刺激下，上述指標(biāo)顯著增高（shCtrl+oxldlvs.shROBO3+oxldl，TG：1.554 ± 0.089vs.2.104 ±0.157，P< 0.05；TC：1.784 ± 0.102vs.2.258 ± 0.122，P< 0.05；FC：1.507 ± 0.058vs.2.258 ± 0.122，P<0.01；CE：1.382 ± 0.071vs.1.994 ± 0.191，P< 0.05）（圖5B）。同時(shí)，油紅O 結(jié)果顯示，正常情況下沉默ROBO3，胞內(nèi)脂滴蓄積并沒(méi)有明顯差異；而在加入oxldl 刺激后，沉默ROBO3 胞內(nèi)脂滴蓄積顯著增加，相較對(duì)照組，沉默ROBO3 增加1.799 ± 0.084 倍（圖5C、D，P< 0.05）。以上結(jié)果提示，沉默ROBO3可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，ROBO3或在維持巨噬細(xì)胞膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

圖5 沉默ROBO3 加劇RAW264.7 細(xì)胞脂質(zhì)蓄積Fig.5 Silencing of ROBO3 exacerbated lipid accumulation in RAW264.7

給予dil-oxldl 刺激，檢測(cè)干預(yù)ROBO3 后對(duì)巨噬細(xì)胞膽固醇攝取能力的影響，結(jié)果表明，沉默ROBO3，dil-oxldl 與細(xì)胞膜的結(jié)合及內(nèi)吞均沒(méi)有顯著差異（圖6A、D）。以上說(shuō)明，ROBO3 缺陷引起的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇蓄積不依賴于細(xì)胞對(duì)膽固醇的攝取。

圖6 沉默ROBO3 不影響RAW264.7 細(xì)胞的脂質(zhì)結(jié)合和吞噬Fig.6 Knockdown of ROBO3 did not affect the lipid binding and uptake of RAW264.7

綜上所述，ROBO3 表達(dá)缺陷加劇了巨噬細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇蓄積和泡沫化進(jìn)程，但并不影響膽固醇攝取過(guò)程，這與化療藥物刺激引起的巨噬細(xì)胞泡沫化所觀察到的現(xiàn)象一致。因此，需要進(jìn)一步探討ROBO3 是否通過(guò)影響膽固醇代謝的其他過(guò)程來(lái)調(diào)控化療誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化。

2.5 ROBO3 調(diào)控膽固醇代謝關(guān)鍵基因 在沉默ROBO3 表達(dá)的RAW264.7 細(xì)胞中，用Q-PCR 手段篩選參與膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果如圖7A 所示，SRA、SRB1、SOAT1、SOAT2、NPC1、NCEH1 和ABCA1 均沒(méi)有變化，而與膽固醇合成相關(guān)基因DHCR24 mRNA 水平明顯增高（1.686 ±0.088，P< 0.01），同時(shí)，負(fù)責(zé)膽固醇外排相關(guān)基因ABCG1 的mRNA 水平顯著下降（0.364 7 ± 0.015，P< 0.001）。進(jìn)一步，用Western blot 檢測(cè)沉默ROBO3 后DHCR24 和ABCG1 的蛋白水平表達(dá)變化，結(jié)果顯示，沉默ROBO3 后，DHCR24 表達(dá)水平升高，ABCG1表達(dá)水平降低（圖7B）。隨后，在DOX處理的RAW264.7 細(xì)胞中檢測(cè)DHCR24 和ABCG1的表達(dá)情況，結(jié)果表明，DHCR24 的表達(dá)隨著化療藥物的處理時(shí)間先降低后升高的同時(shí)，ABCG1的蛋白表達(dá)水平先增高后降低，兩者的變化趨勢(shì)與ROBO3 對(duì)其調(diào)控的趨勢(shì)一致（圖7C），說(shuō)明ROBO3-DHCR24/ABCG1 調(diào)控軸參與調(diào)節(jié)化療引起的巨噬細(xì)胞泡沫化。

圖7 ROBO3 調(diào)控脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因Fig.7 ROBO3 regulated key genes of lipid metabolism

以上結(jié)果表明，ROBO3 可抑制DHCR24 表達(dá)和促進(jìn)ABCG1 的表達(dá)。在化療藥物刺激早期，ROBO3 先應(yīng)激反應(yīng)性升高，下調(diào)DHCR24 并上調(diào)ABCG1 表達(dá)，抑制膽固醇合成的同時(shí)促進(jìn)膽固醇流出，以抵御化療引起的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇擾動(dòng)；在化療藥物持續(xù)刺激下，ROBO3 難抵胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)持續(xù)失衡而逐漸表現(xiàn)為表達(dá)缺陷，最終DHCR24 表達(dá)不再受到抑制而ABCG1 表達(dá)缺陷，導(dǎo)致膽固醇合成增加、流出受阻，胞內(nèi)膽固醇蓄積，加速巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程。見(jiàn)圖8。

圖8 機(jī)制圖Fig.8 Graphic abstract

3 討論

巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。既往有相關(guān)研究［20］顯示，嗅覺(jué)受體（olfactory receptors， OLFRS）在巨噬細(xì)胞的膽固醇代謝及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)揮中調(diào)控作用。ROBO3 作為一種在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)的受體，在控制軸突生長(zhǎng)、生長(zhǎng)錐引導(dǎo)和軸突束化的環(huán)行交叉等方面的重要功能已被闡釋，然而其是否參與到巨噬細(xì)胞膽固醇代謝，尚未可知。而本研究聚焦于ROBO3 對(duì)血管的應(yīng)激保護(hù)調(diào)節(jié)功能，致力于闡明ROBO3 在化療相關(guān)巨噬細(xì)胞泡沫化中的調(diào)控作用及其調(diào)控靶點(diǎn)。在研究過(guò)程中，我們使用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，在細(xì)胞水平上進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)探索。結(jié)果顯示，阿霉素和順鉑類化療藥物可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程，而在該過(guò)程中，ROBO3 的表達(dá)在前期應(yīng)激反應(yīng)性升高，而隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，ROBO3 的表達(dá)水平又逐漸降低；同時(shí)在ROBO3 缺陷的RAW264.7 細(xì)胞中，其胞內(nèi)膽固醇蓄積明顯增加；但膽固醇攝取的能力并沒(méi)有明顯變化，這說(shuō)明ROBO3 參與了巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中，但并不影響其膽固醇攝取能力。在進(jìn)一步探討過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)沉默ROBO3 使得巨噬細(xì)胞中的DHCR24 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了膽固醇的合成，同時(shí)抑制ABCG1 的表達(dá)使得胞內(nèi)膽固醇排除受阻，膽固醇在細(xì)胞內(nèi)聚集增加。至此，我們首次發(fā)現(xiàn)了ROBO3 對(duì)化療藥物刺激下的巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程具有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)調(diào)控DHCR24和ABCG1 的表達(dá)，在抑制膽固醇的合成的同時(shí)，促進(jìn)膽固醇外排，實(shí)現(xiàn)了對(duì)化療相關(guān)巨噬細(xì)胞泡沫化的保護(hù)作用；我們的研究拓展了ROBO3 的功能和理解，為臨床干預(yù)化療相關(guān)血管事件奠定了理論基礎(chǔ)，提供了新思路。

雖然我們的研究已基本闡明了ROBO3 調(diào)控DHCR24與ABCG1對(duì)化療促泡沫細(xì)胞生成的影響，但是，在體內(nèi)條件下ROBO3是否同樣調(diào)控DHCR24和ABCG1 并影響巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。值得注意的是，有研究［21］顯示DHCR24負(fù)調(diào)控ABCA1 與ABCG1 的表達(dá)，但在本研究中發(fā)現(xiàn)，ROBO3 表達(dá)缺陷時(shí)，DHCR24 升高，ABCG1的表達(dá)水平降低，沒(méi)有觀察到ABCA1 表達(dá)水平的變化，這其中隱藏的生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。此外巨噬細(xì)胞的膽固醇代謝過(guò)程，涉及多種酶、受體及轉(zhuǎn)運(yùn)體的參與，本研究中并未涵蓋到所有的膽固醇代謝相關(guān)基因，鑒于此，ROBO3是否還調(diào)控其他基因而進(jìn)一步參與到巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中，還有待探討。而RNA 測(cè)序結(jié)果中，在DOX 及CPT 的刺激下，除ROBO3 外，尚有其他基因的表達(dá)也在RAW264.7 細(xì)胞中發(fā)生著較大的變化，這些基因的生物學(xué)功能和意義也仍有待探討。

【Author contributions】LIU Yong performed the experiments and wrote the article. CHENG Xiaolei performed the experiments designed the study. CUI Xiangli and CHEN Huanzhen revised the article. TANG Hao designed the study and wrote the article. All authors read and ap?proved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.