趙廣西　劉志梅

摘 要：目的：建立高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的N-二甲基亞硝胺。方法：樣品前處理粉碎后經(jīng)乙腈提取，低溫離心除去油脂，QuEChERS凈化，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定。結(jié)果：N-二甲基亞硝胺校準(zhǔn)曲線在2.0～200.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998 5，方法檢出限和定量限分別為0.5 μg·kg-1和3.0 μg·kg-1，回收率為86.8%～90.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.2%～3.1%。結(jié)論：該方法取樣量少，試劑消耗量少，提取和凈化流程簡(jiǎn)便，定性和定量準(zhǔn)確度好，可用于檢測(cè)動(dòng)源性食品中N-二甲基亞硝胺。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；QuEChERS；N-二甲基亞硝胺；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)

Determination of N-Dimethylnitrosamine in Food of Animal Origin by QuEChERS Combined with LC-MS/MS

ZHAO Guangxi1， LIU Zhimei2

（1.Qinhuangdao Municipal Food and Drug Inspection Center， Qinhuangdao 066000， China; 2.Qinhuangdao Administration of Market Regulation， Qinhuangdao 066000， China）

Abstract： Objective： To establish a high performance liquid chromatography-mass spectrometry method for the quantitative determination of N-dimethylnitrosamine in animal derived food. Method： The sample was extracted by acetonitrile after pretreatment and grinding， and the oil was removed by low temperature centrifugation， purified by QuEChERS， and determined by multi-reaction monitoring mode. Result： The calibration curve of N-dimethylnitrosamine had a good linear relationship in the range of 2.0～200.0 ng·mL-1， and the correlation coefficient was 0.998 5. The detection limit and quantitative limit of the method were 0.5 μg·kg-1 and 3.0 μg·kg-1， respectively. The recovery rate was 86.8%～90.8%， and the relative standard deviation was 2.2%～3.1%. Conclusion： This method has the advantages of less sampling， less reagent consumption， simple extraction and purification process， good qualitative and quantitative accuracy， and can be used to detect N-dimethylnitrosamine in animal-derived food.

Keywords： high performance liquid chromatography-mass spectrometry; QuEChERS; N-dimethylnitrosamine; multiple reaction monitoring

肉、魚等食品中富含蛋白質(zhì)和脂肪，在煎、炸、烤等熱處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生較多的胺類化合物，易與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺類化合物，其中主要是N-亞硝基二甲胺。N-亞硝胺類化合物具有基因毒性，能夠直接或間接損傷細(xì)胞DNA。實(shí)驗(yàn)證明，該類化合物有強(qiáng)致癌性，小劑量長(zhǎng)期接觸或較大劑量沖擊都可引發(fā)癌癥[1-4]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)在1987年將亞硝胺列為2A級(jí)致癌物。多國(guó)對(duì)食品中N-亞硝胺類化合物限量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，美國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定食品中總揮發(fā)性亞硝胺限量為10 μg·kg-1；我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》（GB 2762—2022）規(guī)定，肉制品中N-二甲基亞硝胺限量為3.0 μg·kg-1，水產(chǎn)品中限量為4.0 μg·kg-1[5-6]。

亞硝胺在食品中含量極微，一般在μg·kg-1水平，且檢測(cè)過(guò)程中易受復(fù)雜背景基質(zhì)的干擾。前處理是整個(gè)分析檢測(cè)過(guò)程的關(guān)鍵和難點(diǎn)環(huán)節(jié)，影響分析的各項(xiàng)指標(biāo)。樣品前處理技術(shù)主要有固相萃取、固相微萃取、凝膠滲透色譜以及QuEChERS等技術(shù)[7-8]。亞硝胺檢測(cè)方法主要有氣相色譜-熱能分析聯(lián)用法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏度和普適性較好的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品中亞硝胺的檢測(cè)[9-10]。

本研究建立了一種基于大氣壓化學(xué)電離源的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定動(dòng)物源性食品中N-二甲基亞硝胺的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可用于普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同動(dòng)物源性食品中亞硝胺的快速檢測(cè)，為食品安全提供實(shí)際參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC 20A液相色譜儀（島津）；AB5500三重四極桿質(zhì)譜（AB）；氮吹儀（安譜）；高速冷凍離心機(jī)（Sigma）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（泰斯特）。

甲醇（色譜純，TEDIA）；乙腈（色譜純，TEDIA）；甲酸（色譜純，Sigma）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（Millipore）；N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)液（CAS：62-75-9，濃度1 000 μg·mL-1，壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）。

1.2 樣品前處理

稱取5 g（精確到0.01 g）干制品于50 mL離心管中（鮮樣品稱取10 g，精確到0.01g），加入10 mL水，振蕩10 min，加入乙腈5 mL，渦旋振蕩3 min，于-18 ℃冷凍60 min，加入5 g硫酸鎂和2 g氯化鈉，渦旋振蕩2 min，2 ℃、9 000 r·min-1冷凍離心10 min，移取上清液。

稱取150 mg HLB，100 mg無(wú)水硫酸鎂粉末于15 mL離心管中，加入上清液渦旋振蕩2 min，置于冷凍離心機(jī)，9 000 r·min-1、2 ℃離心5 min。取2 mL上清液，轉(zhuǎn)入試管中，控制氮吹溫度在15 ℃低速氮吹至0.9 mL，準(zhǔn)確定容至1.0 mL，0.25 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 色譜/質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters UPLC BEH C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，以0.1%甲酸的水溶液（A）、0.1%甲酸的甲醇溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下正離子模式定量分析。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，10%B；3.0～6.0 min，95%B；6.0～7.0 min，95%B；7.0～9.0 min，10%B；9.0～10.0 min，10%B。具體質(zhì)譜條件見表1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

準(zhǔn)確移取N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容，得到濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液；再次用二氯甲烷稀釋成濃度分別為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1及200 ng·mL-1的N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 提取液的選擇

提取溶劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大影響。在空白樣品中加入100 ng N-二甲基亞硝胺，分別考察乙腈、二氯甲烷、正己烷3種提取溶劑對(duì)空白樣品提取效果的影響。試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明，乙腈的提取效果最佳；其次是二氯甲烷；正己烷的提取效果較差，難以滿足定量要求。

2.1.2 氮吹水浴溫度的選擇

N-二甲基亞硝胺的相對(duì)分子質(zhì)量較小、性質(zhì)不穩(wěn)定，氮吹水浴溫度直接影響目標(biāo)化合物的回收率。在加標(biāo)量為20 ?g·kg-1的條件下，采用加標(biāo)回收試驗(yàn)的方式，對(duì)10 ℃、15 ℃、20 ℃、30 ℃4個(gè)溫度條件進(jìn)行考察。由表2可知，當(dāng)?shù)邓囟葹?5 ℃時(shí)，氮吹的時(shí)間較短，回收率最大。當(dāng)?shù)邓囟刃∮?5 ℃時(shí)，回收率雖然較大，但氮吹時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；當(dāng)?shù)邓囟却笥?5 ℃時(shí)，隨著水浴溫度的升高，目標(biāo)化合物的揮發(fā)較快，導(dǎo)致回收率下降。

2.1.3 儀器條件的優(yōu)化

（1）洗脫條件的優(yōu)化。為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與其他干擾物質(zhì)的良好分離，對(duì)儀器流動(dòng)相洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用某空白加標(biāo)樣品作為測(cè)試樣，分別考察不同洗脫條件（0.1%甲酸水溶液 - 甲醇、0.1%甲酸水溶液-0.1% 甲酸甲醇、0.2%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈）下的洗脫效果。結(jié)果表明，0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)，分離度良好，洗脫效率高。

（2）色譜柱的優(yōu)化。對(duì)Waters XBridge C18、Waters Atlantis T3、Waters UPLC BEH C18 3種色譜柱的分離效果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，當(dāng)采用Waters XBridge C18柱時(shí)，目標(biāo)化合物分離好，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，能滿足定量檢測(cè)要求。因此，最終選擇Waters XBridge C18色譜柱。N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖如圖1所示。

2.2 方法學(xué)考察

以目標(biāo)化合物峰面積比為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為2.0～200.0 ng·mL-1，線性回歸方程為y=7 575.77x+6 345.784 3，相關(guān)系數(shù)為0.998 5，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。信噪比為3時(shí)，檢出限為0.5 μg·kg-1；信噪比為10時(shí)，定量限為3.0 μg·kg-1。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選取熏煮火腿作為樣品，添加N-二甲基亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1 3個(gè)加標(biāo)水平，每個(gè)水平6個(gè)平行，按1.2處理后進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，不同加標(biāo)濃度下，N-二甲基亞硝胺的平均回收率為86.8%～90.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%～3.1%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確高，穩(wěn)定性好。

2.4 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)本地區(qū)2種不同來(lái)源的肉制品（香腸、腌魚），共16個(gè)樣品進(jìn)行分析。部分樣品中檢出N-二甲基亞硝胺留，含量為0～16.4 μg·kg-1，表明樣品中有一定量的N-二甲基亞硝胺殘留。

3 結(jié)論

本研究建立了一種QuEChERS結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法篩查、定性確證與定量動(dòng)物源食品中N- 二甲基亞硝胺的方法。本方法在2.0～200.0 ng·mL-1具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為3.0 μg·kg-1，回收率在86.8%～90.8%，優(yōu)化了前處理?xiàng)l件，省去了蒸餾、萃取、旋蒸等復(fù)雜的前處理步驟，簡(jiǎn)化了提取和凈化過(guò)程，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，方法簡(jiǎn)單高效，為N-二甲基亞硝胺測(cè)定提供了一種新的可靠的方法。

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作者簡(jiǎn)介：趙廣西（1979—），男，河北秦皇島人，碩士，副高級(jí)工程師。研究方向：食品安全檢測(cè)。