陳瑋瑋，田虎，金娜，張秋燕，黃勇樺，丁馮玲

1.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院（普洱 665000）；2.武漢糖智藥業(yè)有限公司（武漢 430073）

橡膠樹[Hevea brasiliensis（Willd.ex A.Juss.）Müll.Arg.]是我國(guó)栽培的重要經(jīng)濟(jì)樹種，也是一種蜜汁十分豐富的蜜源植物[1]。橡膠樹同時(shí)具有花蜜腺和花外蜜腺，泌蜜以其小葉柄先端上方的花外蜜腺為主[2]。橡膠蜂蜜是蜜蜂采集橡膠樹蜜腺中的原蜜后，經(jīng)工蜂充分釀造、儲(chǔ)存在蜂房中的天然甜物質(zhì)，是云南的特色蜜種，已成為云南產(chǎn)量最大的商品蜜[3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)橡膠蜂蜜的研究主要集中在橡膠蜂蜜與各類蜂蜜理化性質(zhì)的比較分析上，研究表明，橡膠蜂蜜中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類，包括多酚類化合物、黃酮類化合物、淀粉酶、礦物質(zhì)、葡萄糖、果糖等[3-6]，但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量如總酚含量、黃酮類化合物含量、總糖含量均比其他蜂蜜品種要低[7]。

蜂蜜酒是世界上最古老的酒精飲料[8]，也是最常見的發(fā)酵蜂蜜產(chǎn)品[9]，其以蜂蜜為原料，加水稀釋后經(jīng)過酵母發(fā)酵得到[10]。研究表明，蜂蜜的高糖含量讓其成為發(fā)酵產(chǎn)酒精的良好原料[11]，通過發(fā)酵可以提高蜂蜜產(chǎn)品的功能性如抗氧化活性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和口感等[9,12]，還可以進(jìn)一步提高蜂蜜中氨基酸、維生素、酶類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)等生物活性成分的含量[13-14]。不同的蜂蜜由于其營(yíng)養(yǎng)成分不同，發(fā)酵成蜂蜜酒的工藝參數(shù)也有一定區(qū)別[15-16]。李敏杰等[17]通過優(yōu)化得到發(fā)酵攀枝花土蜂蜜酒的最佳參數(shù)，即pH 4.36、發(fā)酵溫度27.8 ℃、酵母菌添加量3.59%。史晶亮等[13]通過試驗(yàn)確定棗花蜂蜜酒發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，即起始糖度22%、接種量0.25%、阿米諾酶添加量0.15%、起始pH 4.0，28 ℃發(fā)酵10 d，得到的蜂蜜酒風(fēng)味獨(dú)特。試驗(yàn)以橡膠蜂蜜為原料釀造橡膠蜂蜜酒，對(duì)橡膠蜂蜜酒的釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)價(jià)不同發(fā)酵溫度、起始糖度、酵母添加量等因素對(duì)橡膠蜂蜜酒感官品質(zhì)的影響，探索橡膠蜂蜜酒發(fā)酵工藝流程，開發(fā)新的蜂蜜酒品類，為深化橡膠蜂蜜加工路徑、提高橡膠蜂蜜的經(jīng)濟(jì)附加值提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橡膠蜂蜜（云南省臨滄市耿馬縣孟定鎮(zhèn)）；葡萄酒果酒專用酵母（SY，安琪酵母股份有限公司）；檸檬酸（食品級(jí)，盛達(dá)食品添加劑有限公司）；碳酸氫鈉（食品級(jí)，河南六月初八食品有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

LT501電子天平（常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司）；DK-9-IIA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；BG-50隔水式培養(yǎng)箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；LDZM-40KCS-11立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；WYT手持糖度計(jì)（成都光學(xué)廠）；FE28-Standard pH計(jì)（梅特勒-托利多）。

1.3 方法

1.3.1 橡膠蜂蜜酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

橡膠蜂蜜→礦泉水稀釋→調(diào)節(jié)糖度→調(diào)節(jié)pH→巴氏殺菌（80 ℃，10 min）→接種酵母菌→密封發(fā)酵→離心、陳釀→滅菌→冷卻→成品

稱取一定量的橡膠蜂蜜，加入礦泉水稀釋成蜂蜜發(fā)酵液，使用手持糖度計(jì)調(diào)節(jié)蜂蜜發(fā)酵液的糖度，加入檸檬酸或碳酸氫鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH。調(diào)節(jié)好的蜂蜜發(fā)酵液在80 ℃條件下水浴1 min進(jìn)行殺菌，殺菌后冷卻至室溫，冷卻后接種一定量的酵母菌，放至恒溫培養(yǎng)箱中密封發(fā)酵8 d。發(fā)酵結(jié)束后在4 000 r/min條件下離心10 min，以除去橡膠蜂蜜酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的沉淀，離心后取上清液的酒體，在4 ℃的環(huán)境中靜置48 h進(jìn)行陳釀。陳釀后的橡膠蜂蜜酒恢復(fù)至室溫，裝瓶，并于沸水中水浴20 min滅菌，冷卻至室溫后得到成品橡膠蜂蜜酒。

1.3.2 橡膠蜂蜜酒發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 起始糖度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

橡膠蜂蜜加入礦泉水稀釋，起始糖度分別調(diào)節(jié)為20，22，24，26，28和30 °Brix，調(diào)節(jié)pH 5.0，酵母菌接種量1.0 g/L，將調(diào)配好的橡膠蜂蜜發(fā)酵液置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，密封發(fā)酵8 d。發(fā)酵結(jié)束后，離心、陳釀、滅菌、冷卻后對(duì)橡膠蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)定，并檢測(cè)其酒精度。

1.3.2.2 酵母接種量對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

橡膠蜂蜜加入礦泉水稀釋，調(diào)節(jié)起始糖度28 °Brix，調(diào)節(jié)pH 5.0，酵母菌接種量分別調(diào)節(jié)為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 g/L，將調(diào)配好的橡膠蜂蜜發(fā)酵液置于32℃恒溫培養(yǎng)箱中，密封發(fā)酵8 d。發(fā)酵結(jié)束后，離心、陳釀、滅菌、冷卻后對(duì)橡膠蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)定，并檢測(cè)其酒精度。

1.3.2.3 起始pH對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

橡膠蜂蜜加入礦泉水稀釋，調(diào)節(jié)起始糖度28 °Brix，分別調(diào)節(jié)pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0，調(diào)節(jié)酵母菌接種量1.0 g/L，將調(diào)配好的橡膠蜂蜜發(fā)酵液置于32℃恒溫培養(yǎng)箱中，密封發(fā)酵8 d。發(fā)酵結(jié)束后，離心、陳釀、滅菌、冷卻后對(duì)橡膠蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)定，并檢測(cè)其酒精度。

1.3.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

橡膠蜂蜜加入礦泉水稀釋，調(diào)節(jié)起始糖度28 °Brix，調(diào)節(jié)pH 5.0，酵母菌接種量1.0 g/L，將調(diào)配好的橡膠蜂蜜發(fā)酵液分別置于26，28，30，32和34 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，密封發(fā)酵8 d。發(fā)酵結(jié)束后，離心、陳釀、滅菌、冷卻后對(duì)橡膠蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)定，并檢測(cè)其酒精度。

1.3.3 橡膠蜂蜜酒發(fā)酵條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以起始糖度（A）、酵母接種量（B）、起始pH（C）、發(fā)酵溫度（D）為考察因素，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，對(duì)橡膠蜂蜜酒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見表1。

表1 橡膠蜂蜜酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 感官評(píng)定方法

采用描述分析法對(duì)橡膠蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)分，根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]，并參考孫洪浩等[19]的方法，制定橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，滿分100分，其中外觀20分、香氣30分、口感40分、風(fēng)格10分。由10位感官品評(píng)人員對(duì)橡膠蜂蜜酒進(jìn)行評(píng)定。橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 橡膠蜂蜜酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 橡膠蜂蜜酒理化指標(biāo)檢測(cè)方法

橡膠蜂蜜酒酒精度測(cè)定參照GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測(cè)定》[20]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)值統(tǒng)計(jì)和計(jì)算，采用Origin 9.1進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 起始糖度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

起始糖度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響見圖1。結(jié)果表明，起始糖度對(duì)橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分存在一定影響。在試驗(yàn)設(shè)置范圍內(nèi)，隨著起始糖度的增加，橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分逐漸增加，起始糖度28 °Brix時(shí)，蜂蜜酒的感官風(fēng)味最佳，起始糖度超過28 °Brix以后，橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分開始下降。同時(shí)，在一定范圍內(nèi)，隨著起始糖度的增加，橡膠蜂蜜酒的酒精度也逐漸增加，起始糖度28 °Brix時(shí)，蜂蜜酒的酒精度達(dá)9.6%vol，隨后和感官評(píng)分一樣，開始下降。這種趨勢(shì)可能與酵母的生長(zhǎng)繁殖有關(guān)，起始糖度升高時(shí)，蜂蜜酒發(fā)酵液的滲透壓隨之升高，不利于酵母的生長(zhǎng)[21]。因此，在橡膠蜂蜜酒的發(fā)酵中，綜合考慮感官評(píng)分和酒精度，起始糖度在26～30 °Brix比較合適。

圖1 起始糖度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

2.1.2 酵母接種量對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

酵母接種量對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響見圖2。結(jié)果表明，酵母接種量對(duì)橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分存在一定影響。在試驗(yàn)設(shè)置范圍內(nèi)，隨著酵母接種量的增加，橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，酵母接種量1.0 g/L時(shí)，橡膠蜂蜜酒的感官風(fēng)味最佳。而在試驗(yàn)設(shè)置范圍內(nèi)，橡膠蜂蜜酒的酒精度呈逐漸下降趨勢(shì)，這可能是由于酵母接種量過大時(shí)，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)成分被用于菌種繁殖，從而導(dǎo)致產(chǎn)酒精能力下降，而酵母菌生長(zhǎng)前期產(chǎn)生的其他代謝產(chǎn)物的積累，最終導(dǎo)致橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分較低。綜合考慮，在橡膠蜂蜜酒的發(fā)酵過程中，酵母接種量在0.5～1.5 g/L比較合適。

圖2 酵母接種量對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

2.1.3 起始pH對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

起始pH對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響見圖3。結(jié)果表明，起始pH對(duì)橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分存在一定影響。在試驗(yàn)設(shè)置范圍內(nèi)，隨著起始pH的增加，橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分也逐漸增加。起始pH達(dá)到5.0時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到80.6分，隨后開始下降。值得注意的是，在起始pH 3.5和4.0的條件下，橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分分別為72.3分和74.0分，差異不大，但此時(shí)的酒精度從5.0%vol增加到6.6%vol，而隨著起始pH增加到4.5，5.0甚至6.0，橡膠蜂蜜酒的酒精度增加卻不明顯，這可能與酵母菌喜歡在弱酸性環(huán)境中生長(zhǎng)有關(guān)，pH 3.5不太適合所用的酵母菌菌株生長(zhǎng)。綜合考慮感官評(píng)分和酒精度的影響，在橡膠蜂蜜酒的發(fā)酵過程中，最適起始pH為4.5～5.5。

圖3 起始pH對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響見圖4。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對(duì)橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分存在一定影響。發(fā)酵溫度26～32 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的增加，橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分逐漸增加，此時(shí)酒精度也呈增加趨勢(shì)，可能是在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酵母菌的酒精發(fā)酵能力也逐漸升高。發(fā)酵溫度達(dá)到32℃時(shí)，蜂蜜酒的感官評(píng)分達(dá)到84.4分，此時(shí)酒精度也達(dá)到8.7%vol，說(shuō)明酒精發(fā)酵相對(duì)徹底。溫度高于32 ℃時(shí)，橡膠蜂蜜酒的感官評(píng)分和酒精度都下降，可能是溫度升高導(dǎo)致部分酵母菌的活力受到限制，影響了酒精發(fā)酵。由于發(fā)酵溫度26 ℃和34 ℃時(shí)橡膠蜂蜜酒酒精度較低，綜合考慮，確定最佳發(fā)酵溫度在28～32 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)橡膠蜂蜜酒品質(zhì)的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取起始糖度（A）、酵母接種量（B）、起始pH（C）、發(fā)酵溫度（D）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)表1中相應(yīng)因素及水平對(duì)橡膠蜂蜜酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表3。

表3 橡膠蜂蜜酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，影響橡膠蜂蜜酒發(fā)酵的因素主次順序?yàn)镃＞A＞B＞D，即起始pH＞起始糖度＞酵母接種量＞發(fā)酵溫度。橡膠蜂蜜酒最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A1B1C2D3。即起始糖度26 °Brix，酵母添加量0.5 g/L，起始pH 5.0，發(fā)酵溫度32 ℃。該組合未出現(xiàn)在正交表的9組試驗(yàn)中，需要對(duì)A1B1C2D3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，比較該組合的感官評(píng)分值，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

橡膠蜂蜜酒A1B1C2D3的感官評(píng)分明顯高于正交試驗(yàn)4號(hào)，A1B1C2D3組蜂蜜酒的口感、風(fēng)味更佳。2組蜂蜜酒的酒精度差異不大，A1B1C2D3組的酒精度為10.4%vol，試驗(yàn)號(hào)4的酒精度為10.8%vol。李從軍等[22]采用洋槐蜂蜜為原料釀造的一款桂花蜂蜜酒，其酒精度為11.6%vol。東莎莎等[23]以槐花蜜為原料釀造的番茄蜂蜜酒，其酒精度為9.0%vol，其他學(xué)者釀造的蜂蜜酒酒精度大多在5.0%vol～13.0%vol范圍內(nèi)[24-26]，酒精度與蜂蜜中可發(fā)酵糖含量以及酵母菌代謝發(fā)酵產(chǎn)乙醇情況有關(guān)[14]，綜合來(lái)看，采用葡萄酒果酒專用酵母（SY）發(fā)酵橡膠蜂蜜得到的蜂蜜酒酒精度處在平均水平，對(duì)于中低酒精度，兼具獨(dú)特風(fēng)味的蜂蜜酒受眾來(lái)說(shuō)是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

2組蜂蜜酒的感官評(píng)分雷達(dá)圖見圖5。

圖5 橡膠蜂蜜酒A1B1C2D3組與試驗(yàn)號(hào)4的感官評(píng)分雷達(dá)圖

結(jié)果表明，2組蜂蜜酒在外觀得分上無(wú)差異，A1B1C2D3組在香氣、口感、風(fēng)格上優(yōu)于試驗(yàn)號(hào)4組。直接影響蜂蜜酒外觀得分的是蜂蜜酒的顏色，而蜂蜜酒的顏色與蜂蜜原料中的酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)和礦物質(zhì)含量有關(guān)[10]，總體而言，2組橡膠蜂蜜酒的外觀都清亮有光澤，呈現(xiàn)誘人的金黃色，比較容易吸引消費(fèi)者，而A1B1C2D3組酒香和蜂蜜香氣更協(xié)調(diào)，口感更醇厚協(xié)調(diào)，橡膠蜂蜜酒的獨(dú)特風(fēng)格更突出，參與感官評(píng)價(jià)的人員對(duì)A1B1C2D3組的接受程度更高。因此，橡膠蜂蜜酒的最佳發(fā)酵工藝組合為起始糖度26 °Brix，酵母添加量0.5 g/L，起始pH 5.0，發(fā)酵溫度32 ℃。

3 結(jié)論

以橡膠蜂蜜為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝生產(chǎn)橡膠蜂蜜酒，優(yōu)化后的橡膠蜂蜜酒最佳發(fā)酵工藝為起始糖度26 °Brix、酵母添加量0.5 g/L、起始pH 5.0、發(fā)酵溫度32 ℃。在此優(yōu)化工藝條件下，釀造的橡膠蜂蜜酒酒精度10.4%vol，感官評(píng)分94.5分，橡膠蜂蜜酒酒體色澤金黃、清亮透明、酒香醇厚，具有橡膠蜂蜜酒的獨(dú)特風(fēng)格。橡膠蜂蜜酒的研發(fā)，符合當(dāng)今酒類生產(chǎn)消費(fèi)的發(fā)展趨勢(shì)，提高了橡膠蜂蜜加工產(chǎn)品的附加值，豐富傳統(tǒng)中國(guó)釀造酒的風(fēng)味口感及品類。