周馳，闞洪爽，楊雅元，孟祥雯，歐陽昌漢，楊曉松

（湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北咸寧 437100）

心肌纖維化會導(dǎo)致心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)重塑，舒張功能障礙，是心衰的重要誘因。心肌成纖維細胞分化為肌成纖維細胞是心肌纖維化的主要病理特征之一，該過程誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)，如Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）和Col Ⅲ持續(xù)性分泌，顯著改變心肌的力學(xué)微環(huán)境（基質(zhì)硬度增加），進一步促進心肌成纖維細胞分化［1-2］。

成纖維細胞激活蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）是一種膜整合性脯氨酸特異性絲氨酸蛋白酶，常在傷口修復(fù)、心肌纖維化和腫瘤纖維化中高表達，參與組織重塑、炎癥、纖維化、腫瘤增殖和骨質(zhì)疏松癥等重要病理生理調(diào)控過程［3］。但FAP 在人或小鼠的正常成纖維細胞、正?；驉盒陨掀ぜ毎约傲夹陨掀つ[瘤間質(zhì)中卻低表達，甚至檢測不到［4-5］。最新研究表明,FAP 促進腦鈉肽（brain natriuretic peptide,BNP）降解是其促進心肌損傷的重要原因［3］。目前，已有多項研究探討FAP作為腫瘤纖維化和心肌纖維化診斷的重要生物標(biāo)志物，甚至作為免疫治療的重要靶點［5-7］。

心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，目前的臨床藥物僅能延緩心肌纖維化進程，治療效果非常有限，而聯(lián)合用藥治療往往會帶來一定的不良反應(yīng)。因此，進一步開發(fā)新的心肌纖維化防治藥物尤為重要。而在藥物開發(fā)過程中，一種簡單、高通量和重復(fù)性好的藥物篩選方法是關(guān)鍵。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)是目前分析基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的有效手段，具有簡便、靈敏和重復(fù)性好等優(yōu)點［8］。

本研究通過體外合成啟動子FAP基因片段，并克隆至雙熒光素酶報告質(zhì)粒psiCHECK2 上以替換HSV-TK 啟動子而獲得新的雙熒光素酶報告質(zhì)粒psiCHECK2-FAP，建立psiCHECK2-FAP 雙熒光素報告系統(tǒng)來分析抗心衰藥物達格列凈（dagaliazine，Dapa）的干預(yù)對轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）和棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)的心肌成纖維細胞中熒光素酶活性的變化，進一步驗證該系統(tǒng)的有效性，為心肌纖維化防治藥物的研發(fā)提供策略。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器

小鼠心肌成纖維細胞（mouse cardiac fibroblast，MCF）（批號：BNCC340098），商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。質(zhì)粒psiCHECK2，金開瑞生物科技有限公司；限制性內(nèi)切核酸酶Hind Ⅲ（批號：1060S）、NotⅠ（批號：1166S）、ApaⅠ（批號：1005S）和T4 DNA連接酶（批號：2011A），北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；Dapa（批號：BMS-512148），美國MCE 公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號：MA0555）、EDTA 胰酶消化液（批號：MA0233）、優(yōu)級胎牛血清（批號：PWL001）、PA（批號：MB7088）、RIPA 裂解液（批號：MA0151）、苯甲基磺酰氟（批號：MA0001）、蛋白酶抑制劑混合物（批號：MB2678）和飛克特超敏ECL 發(fā)光液（批號：MA0186），大連美侖生物技術(shù)有限公司；青霉素-鏈霉素溶液（批號：C0222），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒（批號：D6915），美國Omega Biotek 生物科技有限公司；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑（批號：SL100499），SignaGen 生物科技有限公司；TGF-β1（批號：P01137），深圳欣博盛生物科技有限公司；Ang Ⅱ（批號：D11178），北京沃凱生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號：KR0008）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（批號：KR-0368R-HRP），武漢科瑞生物技術(shù)有限公司；8%PAGE 凝膠快速制備試劑盒（批號：20324ES62），上海翌圣生物科技股份有限公司；脫脂奶粉（批號：RM00014）、ColⅠ（批號：A5786）、ColⅢ（批號：A3795）和微管蛋白（tubulin）（批號：AC007），武漢愛博泰克生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號：DL101），南京諾唯贊生物科技股份有限公司。多功能Synergy2 酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；NanoDrop2000分光光度計，美國賽默飛世爾公司；ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.2 psiCHECK2-FAP重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切核酸酶NotⅠ與ApaⅠ雙酶切psiCHECK2 質(zhì)粒獲得線性化載體；PCR 合成FAP基因啟動子片段（在其5’端補齊載體上被切掉的hRluc基因的poly（A）尾序列，總長約573 bp）；T4 DNA 連接酶連接片段與線性化的載體形成重組質(zhì)粒psiCHECK2-FAP，大腸桿菌DH5α 轉(zhuǎn)化，篩選陽性菌落，抽提質(zhì)粒。用HindⅢ消化重組質(zhì)粒并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目標(biāo)條帶是否符合預(yù)期，同時將質(zhì)粒送至武漢生工生物工程有限公司測序。

1.3 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

將MCF 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3 復(fù)孔。待細胞融合度為70%時，將psiCHECK2-FAP瞬時轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)24 h 后更換新的完全培養(yǎng)基，分別給予TGF-β1（5 μg·L-1），Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）或PA（100 μmol·L-1）處理0，12，24 和48 h，收集細胞檢測熒光素酶活性；或者質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞24 h 后，先用Dapa（1 μmol·L-1）預(yù)處理1 h，再分別給予TGF-β1（5 μg·L-1），Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）或PA（100 μmol·L-1）處理24 h，檢測熒光素酶活性與ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表達。

1.4 Western 印跡法檢測MCF 細胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表達

取1.3 制備的細胞，PBS 洗滌，加入RIPA 裂解液（含1% PMSF 與蛋白酶抑制劑），冰上靜置5 min，于4 ℃，12 000×g離心15 min 收集上清液，BCA 法定量蛋白。將30 μg 蛋白樣品經(jīng)8% SDSPAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗（ColⅠ和Col Ⅲ均1∶1000）4 ℃搖床孵育過夜；1×TBST 洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶10 000）中37 ℃搖床孵育孵育1 h；1×TBST 洗膜3 次，經(jīng)ECL底物顯影，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件進行半定量分析。用目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測熒光素酶活性

按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明步書進行檢測。取1.3 制備的細胞，用PBS 緩沖液洗滌細胞后，每孔加入1×細胞裂解緩沖液500 μL，置于脫色搖床上裂解10 min 使細胞完全裂解，收集細胞裂解液離心（12 000×g, 30 s）收集上清液。將細胞上清液以每孔20 μL加入黑色酶標(biāo)板中，每組設(shè)3復(fù)孔；隨后加入熒光素酶底物工作液100 μL置于酶標(biāo)儀中立即讀取螢火蟲熒光素酶活性值；再加入海腎熒光素酶底物工作液100 μL，立即讀取海腎熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用±s表示，用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒psiCHECK2-FAP的構(gòu)建和鑒定

圖1所示，HindⅢ將重組質(zhì)粒psiCHECK2-FAP切成2 個片段4200 和1760 bp，條帶大小符合預(yù)期；質(zhì)粒測序結(jié)果與理論序列完全一致。

Fig.1 Construction and identification of recombinant plasmid psiCHECK2-FAP. A：construction flowchart of recombinant plasmid psiCHECK-FAP；B：identification of plasmid psiCHECK-FAP digested by Hind Ⅲ. FAP：fibroblast activation protein；Lane 1：the product of digestion of plasmid psiCHECK2-FAP by Hind Ⅲ；Lane 2：plasmid psiCHECK2-FAP；M：DNA maker.

2.2 Dapa 干預(yù)對TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 分別誘導(dǎo)MCF細胞中ColⅠ和Col Ⅲ蛋白水平影響

圖2所示，與空白對照組相比，TGF-β1，AngⅡ和PA均能顯著提高ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）；分別與TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 組相比，Dapa 干預(yù)后能夠顯著降低ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.2 Effect of dagaliazine（Dapa）on protein expression levels of CollagenⅠ（Col Ⅰ）and CollagenⅢ（Col Ⅲ）in mouse cardiac fibroblast（MCF）cells induced by transforming growth factor-β1（TGF-β1）(A) or angiotensin Ⅱ（Ang Ⅱ）（B）or palmitic acid（PA）（C）by western blotting. MCF cells were pretreated with Dapa（1 μmol·L-1）for 1 h，and continually treated with TGF-β1（5 μg·L-1）or Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）or PA（100 μmol·L-1）for 24 h. A2, B2 and C2 were the semi-quantitative result of A1,B1 and C1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with TGF-β1，Ang Ⅱor PA group.

2.3 TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 對MCF 細胞中FAP 啟動子活性的影響

圖3所示，相比于0 h，TGF-β1，AngⅡ和PA 分別處理12，24和48 h均顯著提高熒光素酶活性（P＜0.05），24 h 達峰值；24 h 后熒光素酶活性略有下降，但與0 h相比仍顯著增加（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of TGF-β1（A）or Ang Ⅱ（B）or PA（C）on activity of FAP gene promoter in MCF cells evaluated based on luciferase activity. MCF cells were treated with TGF-β1（5 μg·L-1），Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）or PA（100 μmol·L-1）for 0，12，24 and 48 h. Then, the cells were lysed by cell lysis buffer for 10 min, the supernatants of lysates were measured for firefly luciferases activity（F-luc）and renilla luciferases activity（R-luc）according to the instructions of Dual Luciferase Reporter Assay Kit.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with 0 h group.

2.4 Dapa 干預(yù)對TGF-β1，AngⅡ和PA 分別誘導(dǎo)MCF細胞中FAP啟動子活性的影響

圖4所示，與空白對照組相比，Dapa組熒光素酶活性無明顯變化，TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 組熒光素酶活性則明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；分別與TGF-β1，AngⅡ或PA 組相比，Dapa 干預(yù)后熒光素酶活性明顯下降（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of Dapa intervention on FAP promoter activity induced by TGF-β1（A），Ang Ⅱ（B）or PA（C）in MCF cells evaluated based on luciferase activity. See Fig.2 for the cells treatment and see Fig.3 for the analysis of luciferases activity.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group；#P＜0.05，compared with TGF-β1，Ang Ⅱor PA group.

3 討論

本研究以FAP基因啟動子為響應(yīng)靶點，聯(lián)合雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，建立了簡單有效的心肌纖維化藥物篩選系統(tǒng)。心肌成纖維細胞在維持心臟正常結(jié)構(gòu)及功能中發(fā)揮重要作用，因其在心肌纖維化過程中大量合成和分泌纖維化所需基質(zhì)成分而起重要作用，其中，ColⅠ和Col Ⅲ合成的增加是心肌纖維化的典型特征。既往研究報道，TGF-β1/Smad 和腎素/血管緊張素/醛固酮系統(tǒng)等信號通路的激活與心肌纖維化密切相關(guān)，TGF-β1與Ang Ⅱ分別是2 者發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵分子［9］。游離脂肪酸是高血脂引發(fā)心血管疾病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是心肌纖維化的重要危險因素［10］。Dapa 是一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2 受體抑制劑，因其能夠通過降低葡萄糖的重吸收，增加腎排泄而控制血糖，在臨床上用于糖尿病的治療。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)，Dapa 對糖尿病、心肌肥厚和高血脂引起的心肌纖維化均有改善作用［11-13］，表明Dapa 具有抗心肌纖維化的作用。本研究表明，用促心肌纖維化細胞因子TGF-β1，AngⅡ和PA 分別刺激MCF 細胞，均能顯著促進細胞中ColⅠ和Col Ⅲ的表達，而Dapa 的干預(yù)能夠顯著抑制促心肌纖維化因子誘導(dǎo)ColⅠ和Col Ⅲ的合成。以上結(jié)果表明，體外誘導(dǎo)心肌纖維化細胞模型建立成功。

肌成纖維細胞活化標(biāo)志物FAP 是纖維化病理特征的重要標(biāo)志物。已有研究報道，F(xiàn)AP 表達可作為心臟正電子發(fā)射斷層顯像檢測［14］，心臟磁共振顯像檢測的重要標(biāo)志物［15］。近期也有研究報道，將FAP 作為心肌纖維化治療的靶點，表現(xiàn)出非常好的治療潛能［16-17］。本研究將FAP基因啟動子作為響應(yīng)靶點，聯(lián)合雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)而建立的心肌纖維化藥物篩選系統(tǒng)，在促纖維化因子的刺激下，F(xiàn)AP基因啟動子控制下的熒光素酶活性隨著時間的增加而增強，24 h 達峰值，隨后熒光素酶活性略有下降；當(dāng)采用Dapa 干預(yù)后，促纖維化因子誘導(dǎo)的FAP基因啟動子控制下的熒光素酶活性顯著下降。該結(jié)果進一步提示，該藥物篩選系統(tǒng)靈敏且有效。

綜上所述，本研究構(gòu)建了以FAP基因啟動子作為響應(yīng)靶點，聯(lián)合雙熒光素酶檢測系統(tǒng)的心肌纖維化藥物篩選系統(tǒng)，通過促纖維化因子的誘導(dǎo)和抗纖維化藥物Dapa 的干預(yù)，進一步確證了該系統(tǒng)在促纖維化應(yīng)答過程中的靈敏性和有效性，為心肌纖維化藥物的研發(fā)提供了快速且高效的篩選策略。