王子晗，莘裕辰，樓凱，沈方敏，王鈺婷，鮑欣怡，章璐彬，張?jiān)?/p>

（紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江紹興 312000）

氟是自然界中廣泛分布的元素之一，適量的氟化物有益于人和動(dòng)物的生長(zhǎng)。但氟攝入過量可損害腎、肝、心臟、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、腸道系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)［1］。臨床研究表明，過量氟能破壞骨組織，誘發(fā)氟斑牙和氟骨癥等代謝性骨?。?-6］。目前有關(guān)氟骨癥的研究主要集中在氟對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)及功能的調(diào)控［4-6］。低濃度氟化鈉（NaF）1 μmol·L-1可促進(jìn)成骨細(xì)胞的異常增殖和分化，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換障礙和成骨異常［4］；高濃度NaF 0.5 mol·L-1明顯抑制成骨細(xì)胞活性，并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡［6］、骨基質(zhì)鈣化和膠原合成異常，最終造成骨硬化、韌帶鈣化和骨量嚴(yán)重減少。此外，過量攝入氟還會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和骨丟失［7］，增加絕經(jīng)期婦女患骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)。

骨細(xì)胞由成骨細(xì)胞分化而來(lái)，其數(shù)量占骨組織細(xì)胞的90%～95%。骨細(xì)胞能合成和分泌硬骨素和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23 等分子，調(diào)控位于骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動(dòng)而調(diào)節(jié)骨生長(zhǎng)和骨重建［7］。因此，骨細(xì)胞是調(diào)節(jié)骨代謝的主要細(xì)胞，可作為防治骨代謝異常疾病的一種新的靶細(xì)胞。以往研究［8］和我們前期數(shù)據(jù)［9］表明，氟過量可抑制骨細(xì)胞MLO-Y4 活性，誘導(dǎo)骨細(xì)胞凋亡及線粒體自噬。最近，Yang 等［10］研究報(bào)道，氟骨癥大鼠股骨中骨細(xì)胞活性明顯降低，并發(fā)生顯著凋亡。以上研究提示，骨細(xì)胞參與調(diào)控氟骨病的發(fā)生和發(fā)展。目前臨床上治療氟骨癥主要有阿司匹林、吲哚美辛等非甾體抗炎藥物，這些藥物雖然有一定的治療效果，但也存在諸多不良反應(yīng)，不宜長(zhǎng)期服用。

青蒿琥酯（artesunate，Art）源于植物黃花蒿，是一種倍半萜結(jié)構(gòu)的抗瘧藥青蒿素的衍生物。青蒿素具有特異的抗瘧作用，臨床上廣泛應(yīng)用于治療瘧疾［11］。另有研究顯示，Art還具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用［12-14］。此外，Art能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、上調(diào)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，骨鈣素和骨橋蛋白等成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加新骨形成［15］。同時(shí)，Art 還能抑制破骨細(xì)胞的形成，減弱破骨細(xì)胞活性而阻止骨吸收［16］。但是，Art 對(duì)NaF 所致骨細(xì)胞損傷是否具有改善作用目前尚不清楚。本研究建立NaF 誘導(dǎo)骨細(xì)胞MLO-Y4 損傷模型，研究Art 對(duì)NaF 所致骨細(xì)胞損傷的改善作用，并探討其分子調(diào)控機(jī)制，以期為治療氟骨病提供新方法和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

小鼠骨細(xì)胞MLO-Y4 由美國(guó)密蘇里大學(xué)口腔學(xué)院Bonewald 教授饋贈(zèng)；青蒿琥酯（批號(hào)：B20992，純度＞98%）購(gòu)于上海源葉生物技術(shù)有限公司；α-MEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：8123251）、胎牛血清（批號(hào)：2238253）和小牛血清（批號(hào)：2212423）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；MTT（批號(hào)：ST316）、calcein-AM探針（批號(hào)：C2013）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C0016）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號(hào)：S0131S）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性試劑盒（批號(hào)：S0101S）、ATP 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0026）、Hoechst33342（批號(hào)：C1011）、活性氧熒光探針DCFH-DA（批號(hào)：S0033S）、線粒體膜電位熒光探針JC-1（批號(hào)：C2003S）、溶酶體熒光探針Lyso-Tracker（批號(hào)：C1046）和RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）購(gòu)于上海碧云天生物試劑有限公司；線粒體熒光探針MitoTrackerTMGreen（批號(hào)：M7514）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Molecular Probes公司；Annexin-V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A10642）購(gòu)于上海聯(lián)科生物科技有限公司；兔抗小鼠微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC-3）單克隆抗體（批號(hào)：43566S）、鼠抗小鼠Tom20 單克隆抗體（批號(hào)：42406S）、兔抗小鼠P62單克隆抗體（批號(hào)：23214S）、兔抗小鼠E3泛素連接酶蛋白（Parkin）單克隆抗體（批號(hào)：42406S）和兔抗小鼠β 肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（批號(hào)：3700S）購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；兔抗假定激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）單克隆抗體（批號(hào)：A7131）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗小鼠IgG 抗體（二抗）購(gòu)自愛博泰克武漢生物科技有限公司；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液（批號(hào)：1810212）購(gòu)于上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

AB104S 電子分析天平，德國(guó)Sartorius 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific 公司；5430R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf 公司；VersaMax全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀美國(guó)MD 公司；CytoFLEX S 流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman 公司；DMIL 熒光顯微鏡，德國(guó)Leica 公司；LSM900 激光共焦顯微鏡，德國(guó)Carl Zeiss 公司；小型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 骨細(xì)胞MLO-Y4培養(yǎng)

第39代小鼠骨細(xì)胞MLO-Y4加入含有2.5%胎牛血清和2.5%小牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，24 h 后換新的培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞85%鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)加入0.125%胰蛋白酶/0.01% EDTA 消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組

MLO-Y4 細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、NaF 2 mmol·L-1（與細(xì)胞孵育12 或48 h）組及NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組（Art預(yù)孵育2 h 后，加NaF 2 mmol·L-1繼續(xù)孵育12或48 h）。

1.4 MTT法檢測(cè)MLO-Y4細(xì)胞存活率

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1），繼續(xù)孵育4 h，棄上清液后加入200 μL DMSO 避光震蕩5 min。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞的吸光度值（A570nm）。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組A570nm-空白對(duì)照組A570nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A570nm-空白對(duì)照組A570nm）×100%。每組6 復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 calcein-AM染色檢測(cè)MLO-Y4細(xì)胞活性

calcein-AM 是一種低毒性、易透過細(xì)胞膜的活細(xì)胞熒光染料。calcein-AM 進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)后會(huì)被水解為calcein并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。有研究表明，應(yīng)用calcein-AM 染色檢測(cè)細(xì)胞活性的結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)15Cr-釋放法的結(jié)果具有一致性［17］。取1.3分組處理48 h 細(xì)胞，去除上清液經(jīng)PBS 清洗后加入calcein-AM（5 μmol·L-1）室溫、避光孵育30 min，PBS 清洗后置于DMIL 熒光顯微鏡下觀察MLO-Y4 細(xì)胞，以綠色熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞活性。

1.6 化學(xué)比色法檢測(cè)MLO-Y4 細(xì)胞上清液中LDH水平

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，收集各組細(xì)胞上清液，應(yīng)用LDH 試劑盒檢測(cè)上清液中LDH 的水平。每組設(shè)4復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.7 MLO-Y4 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平檢測(cè)

1.7.1 化學(xué)熒光染色法

按照1.3 分組處理12 h 細(xì)胞，去除上清液后各組細(xì)胞分別加入DCFH-DA（10 μmol·L-1）室溫、避光孵育30 min，PBS清洗2次后置于DMIL熒光顯微鏡下ROS水平，綠色熒光強(qiáng)度表示ROS水平。

1.7.2 流式細(xì)胞術(shù)

按照1.3分組處理12 h，去除上清液后收集各組細(xì)胞。PBS清洗后分別加入DCFH-DA（10 μmol·L-1）室溫、避光孵育30 min，PBS 清洗2 次后，流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)MLO-Y4 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。每組4 復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.8 化學(xué)比色法檢測(cè)MLO-Y4 細(xì)胞中MDA 含量和SOD活性

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，按照試劑盒說明書測(cè)定MLO-Y4 細(xì)胞中MDA 含量和SOD 活性變化。每組5復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.9 Hoechst33342染色觀察MLO-Y4細(xì)胞核形態(tài)

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，去除上清液后各組細(xì)胞分別加入Hoechst33342（5 mg·L-1）室溫、避光孵育30 min，PBS 清洗后置于DMIL 熒光顯微鏡下觀察MLO-Y4細(xì)胞核的形態(tài)變化。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MLO-Y4細(xì)胞凋亡率

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，收集細(xì)胞經(jīng)300×g離心10 min。去除上清液后經(jīng)PBS 清洗2次，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL 碘化丙啶，室溫、避光孵育15 min。PBS 清洗后再加入PBS 200 μL 重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MLO-Y4 細(xì)胞凋亡率（%）。每組4復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.11 MLO-Y4 細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）水平檢測(cè)

1.11.1 熒光染色法觀察MLO-Y4細(xì)胞MMP水平

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，去除上清液后各組細(xì)胞分別加入JC-1（10 μmol·L-1）室溫、避光孵育30 min，PBS 清洗2 次后分別應(yīng)用DMIL 熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。其中，MMP 較高時(shí)，JC-1 在線粒體中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；MMP 較低時(shí)，JC-1 為單體，產(chǎn)生綠色熒光。以紅色和綠熒光強(qiáng)度變化反映MLO-Y4細(xì)胞MMP水平的改變。

1.11.2 流式細(xì)胞術(shù)

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，收集細(xì)胞經(jīng)300×g離心10 min。去除培養(yǎng)基經(jīng)PBS 清洗2 次后加入JC-1（10 μmol·L-1）室溫、避光孵育30 min，PBS 清洗后再加入PBS 200 μL 重懸細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)MLO-Y4 細(xì)胞中紅色熒光強(qiáng)度來(lái)定量MMP。每組3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.12 Mito-Tracker 染色觀察MLO-Y4 細(xì)胞中線粒體形態(tài)變化

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，去除上清液后各組細(xì)胞分別與Mito-Tracker Red（1 μmol·L-1）室溫、避光共孵育30 min，PBS 清洗2 次后置于DMIL 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞觀察線粒體形態(tài)改變。

1.13 熒光素酶法檢測(cè)MLO-Y4細(xì)胞內(nèi)ATP含量

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，按ATP 檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP 含量。采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白量，以每mg 蛋白樣品中ATP 含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每組3 復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.14 Western 印跡法檢測(cè)MLO-Y4 細(xì)胞中線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

1.15 Lyso-Tracker觀察自噬泡的形成

取1.3 分組處理48 h 細(xì)胞，去除上清液后各組細(xì)胞分別與Lyso-Tracker（50 nmol·L-1）室溫、避光共孵育30 min，PBS 清洗2 次后置于DMIL 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞觀察自噬泡的形成。

1.16 免疫熒光染色觀察LC-3 在MLO-Y4 細(xì)胞線粒體中表達(dá)

取1.3 分組處理細(xì)胞48 h，去除上清液后各組細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton X-100破膜5 min，10%胎牛血清封閉2 h，加入兔抗小鼠LC-3（1∶200）和小鼠抗小鼠Tom20（1∶300）抗體置于4 ℃孵育過夜。PBS 清洗后加入FITC 或Cy3 標(biāo)記的二抗（稀釋比），室溫、避光孵育2 h。PBS 清洗后置于LSM900 激光共焦顯微鏡下觀察LC-3 和Tom20 的熒光共定位情況，以此來(lái)反映LC-3 在線粒體中的表達(dá)。

1.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用x±s表示，用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較釆用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Art對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞存活率的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組細(xì)胞存活率呈濃度依賴性顯著升高（r=0.9825，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of artesunate（Art）on cell survival in NaF-treated MLO-Y4 cells by MTT. MLO-Y4 cells were pretreated with Art（0.25，0.50 and 1.00 μmol·L-1）for 2 h，and then incubated with NaF（2 mmol·L-1）for 48 h. x±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with NaF group.

2.2 Art對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞活性的影響

calcein-AM 染色結(jié)果（圖2）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞calcein 綠色熒光強(qiáng)度明顯下降，表明NaF 對(duì)MLO-Y4 細(xì)胞活性有明顯的抑制作用；與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4 細(xì)胞calcein 綠色熒光強(qiáng)度顯著增加，提示Art 可減弱NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞活性的降低。

Fig.2 Effect of Art on cell viability in NaF-treated MLO-Y4 cells by calcein-AM staining. See Fig.1 for the cell treatment.

2.3 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞上清液中LDH含量的影響

LDH 檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞上清液中LDH 含量明顯增加（P＜0.01）；與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組上清液中LDH 含量呈濃度依賴性地減少（r=0.9769，P＜0.01）。

Tab.1 Effect of Art on supernatant lactate dehydrogenase（LDH）content in NaF-treated MLO-Y4 cells

2.4 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

DCFH-DA 染色和流式結(jié)果（圖3）所示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞中DCFH-DA 綠色熒光強(qiáng)度顯著升高（P＜0.01），表明NaF處理可顯著增加MLO-Y4細(xì)胞內(nèi)ROS水平。與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4細(xì)胞中DCFH-DA 綠色熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.01）。

由于學(xué)生思維的活躍性，實(shí)際教學(xué)過程中往往會(huì)產(chǎn)生學(xué)生思維與教師預(yù)期結(jié)果大相徑庭的情況。對(duì)教師來(lái)說，應(yīng)當(dāng)鼓勵(lì)這些創(chuàng)新性思維，而并非根據(jù)自身預(yù)期結(jié)果去進(jìn)行一味的否定，有的時(shí)候順從學(xué)生的思維開展教學(xué)，往往能夠取得意想不到的教學(xué)效果。

Fig.3 Effect of Art on level of intracellular ROS in NaF-treated MLO-Y4 cells by DCFH-DA staining using a fluorescence microscope (A) and flow cytometry (B).MLO-Y4 cells were pretreated with Art（0.25，0.50，1.00 μmol·L-1）for 2 h，and then incubated with NaF（2 mmol·L-1）. B was the semi-quantitative result of A. x±s，n=4. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with NaF group。

2.5 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量和SOD活性的影響

表2 顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組MLO-Y4細(xì)胞內(nèi)MDA 含量顯著增加，SOD 活性明顯減少（P＜0.01）。與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量顯著減少，SOD活性明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.2 Effect of Art on malondialdehyde（MDA）content and superoxide dismutase（SOD）activity induced by NaF in MLO-Y4 cells.

2.6 Art 對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞核改變的影響

Hoechst33342 染色結(jié)果（圖4）顯示，細(xì)胞對(duì)照組MLO-Y4 細(xì)胞發(fā)出均勻的藍(lán)色熒光，細(xì)胞核形態(tài)呈圓形或橢圓形，大小均一，無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變；NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞出現(xiàn)核皺縮和核碎裂等凋亡樣特征，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4細(xì)胞核皺縮和核破碎減少。

Fig.4 Effect of Art on nuclear morphology in NaFtreated MLO-Y4 cells. See Fig.1 for the cell treatment. Arrows show nuclear fragmentation.

2.7 Art 對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞凋亡的影響

圖5顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF組MLO-Y4細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與NaF 組比較，NaF+Art 0.50 和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of Art on cell apoptosis in NaF-treated MLO-Y4 cells using flow cytometry. See Fig.1 for the cell treatment. B was the semi-quantitative result of A. x±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with NaF group.

2.8 Art對(duì)NaF誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞MMP水平的影響

JC-1染色結(jié)果（圖6）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度顯著上升，紅色熒光強(qiáng)度明顯下降（P＜0.01），表明NaF可顯著降低MLO-Y4 細(xì)胞MMP 水平；與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4 細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度下降（P＜0.01）。

Fig.6 Effect of Art on mitochondrial membrane potential（MMP） level in NaF-treated MLO-Y4 cells by JC-1 staining using fluorescence microscope（A）and flow cytometry（B）. See Fig.1 for the cell treatment. x±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with NaF group.

2.9 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞內(nèi)ATP 水平的影響

表3 顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組MLO-Y4細(xì)胞內(nèi)ATP 含量明顯減少（P＜0.01）；與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.3 Effect of Art on ATP content in NaF-treated MLO-Y4 cells

2.10 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響

Mito-Tracker 染色結(jié)果（圖7）顯示，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞線粒體明顯被破壞，從相互交聯(lián)的網(wǎng)狀轉(zhuǎn)換為短棒狀或顆粒狀；NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組線粒體破壞明顯被抑制。

Fig.7 Effect of Art on mitochondrial morphology in NaF-treated MLO-Y4 cells. See Fig.1 for the cell treatment.Arrows show mitochondrial rupture.

2.11 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白的影響

Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖8）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞中線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1 和Parkin 表達(dá)顯著上調(diào)，LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉(zhuǎn)換明顯，LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ值升高，而P62表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），表明NaF 可誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬。與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50 和1.00 μmol·L-1組MLO-Y4 細(xì)胞中PINK1 和Parkin 表達(dá)明顯著減少，P62 表達(dá)顯著增加，LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ值顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.8 Effect of Art on expression levels of mitophagyrelated proteins in NaF-treated MLO-Y4 cells by Western blotting. See Fig.1 for the cell treatment. B-E were the semiquantitative results of A. IA：integrated absorbance. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with NaF group.

2.12 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞中自噬泡形成的影響

Lyso-Tracker 染色結(jié)果（圖9）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組溶酶體呈高亮點(diǎn)紅色的MLO-Y4細(xì)胞數(shù)目顯著增加，表明NaF 可促進(jìn)MLO-Y4 細(xì)胞自噬泡的形成；與NaF 組比較，NaF+Art 0.25，0.50和1.00 μmol·L-1組溶酶體呈高亮點(diǎn)紅色的MLO-Y4細(xì)胞數(shù)目明顯減少，提示Art 能抑制NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞中自噬泡的形成，進(jìn)而抑制自噬和線粒體自噬。

Fig.9 Effect of Art on formation of autophagic vacuoles in NaF-treated MLO-Y4 cells by Lyso-Tracker staining. See Fig.1 for the cell treatment.Arrows show the accumulation of autophagic vacuoles.

2.13 Art 對(duì)NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞中LC-3 在線粒體中聚集的影響

免疫熒光染色結(jié)果（圖10）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組比較，NaF 組MLO-Y4 細(xì)胞中損傷線粒體中LC-3（綠色熒光）表達(dá)增加；與NaF 組比較，NaF+Art 1.00 μmol·L-1組MLO-Y4 細(xì)胞中線粒體中的LC-3表達(dá)明顯減少，表明Art 可抑制LC-3 在線粒體中聚集。

Fig.10 Effect of Art on co-localization of microtubule-associated protein 1 light chain 3（LC-3）with Tom20 in NaF-treated MLO-Y4 cells by immunofluorescence staining. See Fig.1 for the cell treatment. Arrows show increased expression of LC-3 in mitochondria.

3 討論

本研究結(jié)果表明，Art 可顯著抑制NaF 誘導(dǎo)的MLO-Y4細(xì)胞氧化損傷，表現(xiàn)為MLO-Y4 細(xì)胞存活率和細(xì)胞活性顯著增加，ROS 和MDA 含量降低，SOD 活性明顯增加，其機(jī)制可能是Art 結(jié)構(gòu)中的酚羥基在體內(nèi)被氧化釋放H+，競(jìng)爭(zhēng)性與MLO-Y4 細(xì)胞中自由基及氧化產(chǎn)物結(jié)合，保護(hù)脂質(zhì)不被氧化，阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而減弱NaF 所致MLO-Y4 細(xì)胞損傷。因此，Art可通過抑制ROS 的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)從而發(fā)揮對(duì)損傷MLO-Y4 細(xì)胞的保護(hù)作用。

研究結(jié)果表明，過量ROS可誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變、破壞呼吸鏈和MMP 崩解［18-19］。后者常被視為細(xì)胞凋亡的早期事件之一［20］。另有報(bào)道，多種病理刺激可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，引起MMP 下降及ATP 合成減少，并促進(jìn)凋亡蛋白Bax 易位進(jìn)入線粒體、細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，啟動(dòng)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)，最后通過激活胱天蛋白酶3/9 等來(lái)執(zhí)行細(xì)胞凋亡［18，21-22］。而抑制MMP水平和ATP 合成的下降能減少NaF 所致MLO-Y4細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，Art能顯著阻止MLO-Y4細(xì)胞中MMP 和ATP 水平的降低，減輕線粒體破壞并減少細(xì)胞凋亡，表明Art 可通過調(diào)節(jié)線粒體功能而阻止NaF誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞凋亡。

線粒體自噬是近年來(lái)在自噬領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。線粒體自噬是通過自噬途徑將多余或受損線粒體的線粒體清除，在維持細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量和維持線粒體正常功能等方面發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)線粒體損傷或MMP 下降時(shí)，PINK1穩(wěn)定在損傷線粒體外膜上并維持其激酶活性，同時(shí)招募原本處于抑制狀態(tài)的Parkin 并使其磷酸化，活化后的Parkin 催化線粒體蛋白泛素化，并介導(dǎo)其與選擇性自噬受體結(jié)合，最后與LC3 連接形成線粒體自噬［22］。病理?xiàng)l件下線粒體自噬水平增加會(huì)破壞骨代謝平衡［18，21-24］，是骨質(zhì)疏松癥和關(guān)節(jié)炎等疾病的重要誘因之一。2014 年Yang 等［25］應(yīng)用去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型研究表明，骨細(xì)胞自噬水平增加可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成和骨丟失。此外，Yuan 等［26］發(fā)現(xiàn)，PINK1 介導(dǎo)的線粒體自噬參與調(diào)控糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)MLO-Y4細(xì)胞合成cathepsin K，后者可促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收。本研究結(jié)果表明，NaF 明顯上調(diào)線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1 和Parkin 等表達(dá)，促進(jìn)LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉(zhuǎn)換，增加線粒體中LC-3的表達(dá)，下調(diào)自噬底物p62的表達(dá)，并增加自噬泡的生成。以上研究結(jié)果提示，NaF 可誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞線粒體自噬，增加自噬和線粒體自噬水平，與我們前期研究結(jié)果一致［9］。Art 可顯著減弱NaF 誘導(dǎo)MLO-Y4 細(xì)胞線粒體自噬，下調(diào)PINK1 和Parkin 表達(dá)，阻止LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ轉(zhuǎn)換，同時(shí)減少LC-3 在損傷線粒體中的表達(dá)。由此推測(cè)，Art 可通過調(diào)控PINK1/Parkin 信號(hào)通路來(lái)減少線粒體自噬水平，從而阻止NaF所致MLO-Y4細(xì)胞損傷。

綜上所述，Art可通過抑制細(xì)胞凋亡和線粒體自噬而發(fā)揮對(duì)NaF 所致MLO-Y4 細(xì)胞氧化損傷的改善作用。但本研究缺乏Art 對(duì)體內(nèi)骨細(xì)胞活動(dòng)影響的相關(guān)研究數(shù)據(jù)，后續(xù)我們將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討Art對(duì)NaF誘導(dǎo)的骨細(xì)胞損傷的改善作用。