摘要：為探討以枸櫞酸、蘋果酸、氨基磺酸、甲酸等為主要成分的恒凈酸殺菌效果和對小鼠腸道微生物菌群的影響，采用懸液定量殺菌試驗等方法觀察恒凈酸對大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和非洲豬瘟病毒的殺菌效果；采用14 d最大給藥量法觀察恒凈酸的急性毒性反應；通過觀察不同稀釋度恒凈酸對HEK293T細胞形態(tài)的影響確定其對細胞的安全濃度；采用高通量測序技術分析恒凈酸對小鼠腸道細菌群落結構多樣性的影響。結果表明，0.1 g·L-1恒凈酸溶液2 min 內可有效殺滅大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌；1.56 g·L-1恒凈酸溶液5 min后可有效滅活非洲豬瘟病毒。恒凈酸為實際無毒級物質，對細胞的安全濃度為≤1.56 g·L-1。與對照組相比，恒凈酸處理顯著提高了擬桿菌門的相對豐度，提高了擬桿菌門/厚壁菌門的比例。綜上，恒凈酸是一種可有效殺滅病原微生物的新型消毒劑，能改善小鼠的腸道菌群組成，且安全無毒。

關鍵詞：恒凈酸；殺菌效果；腸道菌群

水是畜禽生長過程中需求量最大的物質，為采食量的2.0倍～2.3倍，畜禽對礦物質與微量元素的需求很大一部分來源于水。此外，畜禽在患病或應激時會停止采食，僅靠飲水維持基本的生命活動[1]，因此，在集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖模式下，飲用水成為比飼料、藥品更具有決定性的控制生長因素。目前，很多養(yǎng)殖場容易忽略畜禽飲水質量的重要性，飲水水源污染、水線污染和終端污染都比較嚴重。例如水環(huán)境是非洲豬瘟防控的最大漏洞，中小規(guī)模養(yǎng)殖場飲用水的二次污染問題特別嚴重[1-4]。不潔飲水會引起畜禽腹瀉、營養(yǎng)吸收障礙和其他多種疾病，從而導致畜禽生長緩慢和生產能力下降甚至是死亡。為了杜絕經水傳染疾病的發(fā)生和流行，保證畜禽健康，養(yǎng)殖場應定期將水源和水線進行消毒，使用化學消毒劑是最為常用的方法[5]。酸化劑作為一種綠色、環(huán)保型添加劑備受青睞，不僅可以對水進行消毒，還可以對動物飼料和飲用水酸化處理以減少禁抗帶來的各種問題[6-8]。酸化劑按照使用方式分為飲水型和飼糧型，飲水型酸化劑具有廣譜、高效的抗菌作用，對動物飲水起到消毒、防霉作用，且能有效提高動物的生產性能、減少消化道疾病，表現出良好的正效應[8-10]。目前，人們的研究多集中在飼糧型酸化劑，關于飲水型酸化劑的研究較少。飲水型酸化劑主要應用在肉雞和蛋雞生產中。如任方奎等[11]的研究表明液體酸化劑能很好地酸化水質、降低水的硬度、抑制大腸桿菌的繁殖，酸化水可以提高肉雞的生長性能；于睿等[12]研究表明在飲水中添加飲水型酸化劑能夠提高蛋重、蛋殼厚度和蛋殼強度，且有利于維持蛋雞輸卵管健康。本研究通過探討飲水型酸化劑對畜禽養(yǎng)殖中常見微生物（如大腸桿菌、沙門氏菌、非洲豬瘟病毒等）的殺菌效果及對腸道微生物菌群的影響，為飲水型酸化劑在集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖廠水源和水線消毒中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酸化劑 恒凈酸由四川恒通動保生物科技有限公司生產提供，主要成分包括枸櫞酸、蘋果酸、氨基磺酸、甲酸等；速可凈購于韓國RNL科技公司，主要成分是枸櫞酸和蘋果酸；欄舍康購于湖南五指峰生化有限公司，主要成分枸櫞酸和DL蘋果酸。

1.1.2 動物及菌種

健康成年昆明種小鼠，體重（20±1）g，SPF級，由斯貝福（北京）生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0010。大腸桿菌（Escherichia coli 8099）、白色念珠菌（Candida albicans ATCC 10231）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CMCC（B） 26003）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442）由四川恒通動保生物科技有限公司購買。非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）和HEK293T細胞由中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.1.3 主要設備

倒置熒光顯微鏡X51，奧林巴斯公司；T100TM PCR儀，Bio-Rad公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計，賽默飛世爾科技公司；MISEQ測序儀、Illumina高通量測序儀，Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 不同復合酸化劑產品的殺菌效果測定

參照GB 15979－2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》附錄C4溶出性抗（抑）菌產品抑菌性能試驗方法［13］，取1∶500和1∶1 000濃度的恒凈酸、速可凈和欄舍康3種酸化劑分別作用2，5，10和20 min。調查對大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的殺菌效果。

1.2.2 模擬浸泡消毒方式評價恒凈酸對ASFV的殺滅效果

將恒凈酸與無菌水按1∶640（g·mL-1）的比例配制溶液，并過0.22 μm除菌過濾器。將配制的恒凈酸溶液進行二倍梯度稀釋：1∶640～1∶5 120。將1.0×102 ，1.0×103，1.0×104和1.0×105 TCID50·mL-1的ASFV懸液分別與4個濃度（1∶640，1∶1 280，1∶2 560和1∶5 120）的恒凈酸溶液按50 μL等體積均勻混合，在4，25和37 ℃條件下分別作用5，15和30 min，再加入中和劑（0.5%硫代硫酸鈉）作用10 min，并將中和后的產物加入到融合率達90%以上的HEK293T細胞培養(yǎng)板中，每個濃度3個重復孔，同時設置中和劑對照組、陽性對照組（rASFV-HLJ/2018-EGFP）和陰性對照組（RPMI 1640培養(yǎng)基），置入37 ℃ 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，5 d后觀察熒光并統(tǒng)計試驗結果。

1.2.3 模擬噴霧消毒方式評價恒凈酸對ASFV的殺滅效果

取直徑為2 cm的圓形無菌濾紙片分別滴加50 μL的1.0×102 ，1.0×103和1.0×104 TCID50·mL-1的rASFV-HLJ/2018-EGFP，取接種3個濃度rASFV-HLJ/2018-EGFP的濾紙片各3片加入細胞維持液中作為陽性對照，其余已加rASFV-HLJ/2018-EGFP的紙片用4個濃度（1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120）的恒凈酸進行噴霧法消毒處理，采用高壓氣霧噴瓶噴3次，每次間隔2 s，濾紙?zhí)幱谕耆珴駶櫱也坏嗡疇顟B(tài)，在4，25和37 ℃條件下分別作用5，15和30 min。同時設未rASFV-HLJ/2018-EGFP的濾紙片作為陰性對照，取直徑為2 cm的圓形無菌濾紙片3片，滴加50 μL的無菌水，用裝有無菌水高壓氣霧噴瓶噴3次，每次間隔 2 s，濾紙?zhí)幱谕耆珴駶櫱也坏嗡疇顟B(tài)。將所有紙片放入400 μL中和劑中浸泡10 min，然后旋渦震蕩10 s，加入到融合率達90%以上的HEK293T細胞培養(yǎng)板中，每個濃度重復3孔，置入37 ℃ 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，5 d后觀察熒光并統(tǒng)計試驗結果。

1.2.4 恒凈酸對ASFV殺滅結果判定標準 在陽性對照組，孔內細胞熒光陽性率90%以上，陰性對照組孔內無熒光信號成立前提條件下，若消毒劑組孔內無熒光信號證明病毒被消毒劑完全滅活；若消毒劑組孔內有明顯熒光信號證明病毒未被消毒劑完全滅活。

1.2.5 恒凈酸對小鼠的急性毒性結果 參照中華人民共和國國家標準《急性毒性試驗：GB 15193.3-2014》的試驗方法[14]，將恒凈酸按照5 000 mg·kg-1（體重）單次經口給藥，14 d內每天觀察小鼠皮表、黏膜、分泌物和排泄物是否正常，同時記錄小鼠的一般表現、中毒表現以及死亡情況。試驗結束后稱重，處死小鼠并解剖。

1.2.6 恒凈酸對HEK293T細胞的毒性試驗 將恒凈酸用無菌水倍比稀釋后，接種到融合率達90% 以上的HEK293T細胞培養(yǎng)板上，置入37 ℃ 5% CO2溫箱中培養(yǎng)8 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。并按照CCK-8細胞增殖-毒性試劑盒說明書操作，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置入37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，根據說明書計算消毒劑處理后的細胞活性并分析結果。

1.2.7 小鼠糞便采集 小鼠按體重隨機分成5組，每組 12 只。分組如表 1 所示。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～27 ℃，相對濕度 50%～70%，12 h明暗交替，每天上午9：00稱量與添加飼料、計算飲水量并更換飲水瓶，清洗托盤，即時清除糞便等。飼養(yǎng)21 d后，每天更換飲水瓶后，將小鼠放入高壓滅菌代謝籠，收集各組小鼠糞便，稱量糞便質量、計數糞便粒數，新鮮糞便于60 ℃烘箱中烘干后計算糞便含水率。同時，無菌收集10粒新鮮糞便，分裝于2個滅菌EP管中，放入-80 ℃的冰箱保存，連續(xù)收集10 d，每個組10份糞便樣品。

1.2.8 小鼠糞便DNA提取和16S rRNA基因PCR擴增 小鼠糞便中微生物群落總DNA的提取、16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)的PCR擴增及PCR產物回收均參照文獻[15]。

1.2.9 小鼠腸道微生物群落結構的高通量測序分析 構建PE 300文庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。使用fastp（https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.19.6）軟件對雙端原始測序序列進行質控，使用FLASH（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.11）軟件進行拼接。使用UPARSE v7.1軟件（http：//drive5.com/uparse/），根據97%的相似度對質控拼接后的序列進行操作分類單元OTU（Operational taxonomic unit） 聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier （http：//rdp.cme.msu.edu/，version 2.11） 比對Silva 16S rRNA基因數據庫（v138）進行OTU物種分類學注釋，置信度閾值為70%，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。

1.2.10 數據分析

所有試驗重復3次，數據以平均值表示。小鼠腸道微生物測序數據分析均在美吉生物云平臺（https：//cloud.majorbio.com）上進行，具體如下：采用Mothur軟件（http：//www.mothur.org/wiki/Calculators）計算Alpha多樣性知識Chao 1、Shannon指數等，并采用Wilcoxon秩和檢驗進行Alpha多樣性的組間差異分析；用LEfSe分析（Linear discriminant analysis Effect Size）（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/LEfSe）（LDAgt;2，Plt;0.05）確定不同組間從門到屬水平豐度顯著差異的細菌類群。使用基于距離的冗余分析（distance-based redundancy analysis，db-RDA）用來調查酸化劑對腸道細菌群落結構的影響。線性回歸分析用于評估db-RDA分析中確定酸化劑對微生物Alpha多樣性指數的影響?；赟pearman相關性|r| gt;0.6，Plt;0.05 挑選物種進行相關性網絡圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同酸化劑的殺菌效果

由表2可知，恒凈酸、速可凈和欄舍康3種酸化劑在1∶1 000濃度下對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌作用2 min的殺滅率均達到了99.00%以上；3種酸化劑在1∶1 000濃度下對白色念珠菌作用2 min的殺滅率分別為96.53%、99.99%和95.14%，說明恒凈酸、速可凈和欄舍康均具有顯著殺滅大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞白色念珠菌的作用。

2.2 恒凈酸對ASFV的殺滅效果

由表3可知，當ASFV的滴度為1.0×102 和1.0×103 TCID50·mL-1時，在浸泡消毒和噴霧消毒過程中，在4，25和37 ℃條件下，1∶5 120、1∶2 560、1∶1 280、1∶640濃度的恒凈酸均只需作用5 min即可完全殺滅病毒。當ASFV的滴度為1.0×104" TCID50·mL-1時，在浸泡消毒過程中，在4和25 ℃條件下，1∶2 560濃度、1∶1 280濃度的恒凈酸分別需要作用30 和15 min才能完全滅活ASFV，1∶640濃度的只需作用5 min就能完全滅活ASFV；在37 ℃條件下，1∶5 120和1∶2 560濃度恒凈酸作用30 min才能完全滅活ASFV，1∶1 280濃度的作用15 min才能完全滅活ASFV，1∶640濃度的作用5 min就能完全滅活ASFV;在噴霧消毒過程中，在4 ℃條件下，1∶5 120和1∶2 560濃度恒凈酸作用30 min才能完全滅活ASFV，1∶1 280和1∶640濃度恒凈酸作用15 min能完全滅活ASFV；在25 ℃條件下，1∶5 120濃度恒凈酸作用30 min才能完全滅活ASFV，1∶2 560和1∶1 280濃度的作用15 min才能完全滅活ASFV，1∶640濃度的作用5 min就能完全滅活ASFV;在37 ℃條件下，噴霧方式對ASFV滅活效果與浸泡方式的滅活效果相同。當ASFV的滴度為1.0×105 TCID50·mL-1時，在浸泡消毒過程中，在4，25和37 ℃條件下僅有1∶640濃度的恒凈酸能完全滅活ASFV，需要作用的時間分別是30，15和5 min；在噴霧消毒過程中，在25和37 ℃條件下1∶1 280、1∶640濃度的恒凈酸均需作用30 min才能完全滅活ASFV。綜上，恒凈酸對非洲豬瘟病毒具有良好的殺滅作用，隨著溫度提高和作用時間延長，殺滅效果更顯著。

2.3 恒凈酸對小鼠急性毒性試驗結果

給予受試物后，小鼠大小便正常，肛門無分泌物，體重正常增長，精神狀態(tài)良好，鼻、眼、口腔無異常分泌物，觀察期內未見死亡。由表4可知，在試驗1，7和14 d時，受試物組小鼠的體重與同期的陰性對照組相比無顯著性差異（Pgt;0.05），且受試物組中雌、雄小鼠之間也無顯著性差異（Pgt;0.05）。試驗期結束后將小鼠處死并解剖檢查肝、脾、心、腎、腸、胃、肺、腦等，與對照組小鼠比較，均未發(fā)現異常情況。結果說明，酸化劑對小鼠急性經口最大耐受劑量（Maximum Tolerated Dose，MTD）值大于5 000 mg·kg-1（體重），按急性毒性分級標準[16-17]，恒凈酸屬于無毒級物質。

2.4 恒凈酸對HEK293T細胞的毒性試驗結果

由圖1可知，不同濃度的恒凈酸溶液對細胞影響較大，1∶320濃度的恒凈酸可使細胞崩解、聚集、脫落，隨著濃度的降低，對細胞形態(tài)的影響逐漸減弱，濃度為1∶320時的細胞活性為20%左右，濃度為1∶640及其以下時細胞的活性均在75%以上，結果表明，恒凈酸對細胞的安全濃度為1∶640或更低濃度。

2.5 小鼠腸道微生物OTU比較

通過16S rRNA測序，共得到2 074 249條有效序列，序列長度從401 bp到440 bp不等，平均序列長度為419 bp。對獲得的序列經聚類分析后，CK組、L組、M組、H組和S組分別獲得569，567，579，580和558個代表性的菌群OTU，表明隨著恒凈酸濃度的增加，OTU數目逐漸升高。CK組、L組、M組、H組和S組共有OTU為435個，而特有的OTU分別為11，8，7，6和9個（圖 2）。

2.6 小鼠腸道細菌門水平菌群組成分析

由圖3可知，處理組與對照組小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes），兩個門細菌數量均占各組腸道細菌總量的87.26%以上，其中，L組、M組和H組的占比分別為91.58%、90.32%和90.95%。與對照組比較，L組、M組、H組和S組小鼠腸道菌的擬桿菌門豐度占比均有所增加，僅有L組和H組存在顯著性差異（Plt;0.05）；厚壁菌門豐度占比有所下降，但不存在顯著性差異（Pgt;0.05）。 對照組中擬桿菌門與厚壁菌門相對豐度的比值

為0.78，L組、M組、H組和S組中擬桿菌門與厚壁菌門相對豐度的比值增至1.75，1.29，1.54和0.93，與對照組相比，L組、M組、H組比值增加顯著（Plt;0.05）。

2.7 小鼠腸道細菌屬水平菌群組成分析

在屬水平，處理組與對照組小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群為未分類的Muribaculaceae屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬、毛螺菌科NK4A136組和未分類的毛螺菌科（圖4）。與對照組比較，L組、M組和S組小鼠腸道菌中的未分類的Muribaculaceae屬豐度占比有所增加，但不存在顯著性差異（Pgt;0.05）；L組、M組和S組小鼠腸道菌中的擬桿菌屬豐度占比有所增加，H組有所下降，均不存在顯著性差異（Pgt;0.05）。

3 討論

規(guī)?；B(yǎng)殖場中，封閉的飲水線中存在著大量的大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌等病原微生物，這些微生物會對動物的健康成長產生巨大威脅[7，18]。恒凈酸、速可凈和欄舍康等酸化劑的加入可將飲水的pH降至 3.5～4.1，其中，恒凈酸在1∶20 000倍稀釋時pH能達到3.54（純水條件下），可有效減少大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞白色念珠菌等有害微生物在飲水中的數量，這與何紀塏等［19］的實驗結果相一致。此外，恒凈酸在常溫條件下對ASFV均有良好的殺滅效果，1∶640濃度下作用5 min可完全滅活1.0×10 TCID50·mL-1的ASFV，可作為防控ASF 的有效消毒劑。因此，恒凈酸不僅可以用于動物飲水的消毒，也可以用于養(yǎng)殖場設備、車輛、地面等的消毒[20]。

恒凈酸有效成分為枸櫞酸、蘋果酸、氨基磺酸、甲酸等，均為食品級有機酸。研究結果也表明恒凈酸屬于無毒級物質，且對細胞的安全濃度為1∶640或更低濃度。因此，恒凈酸在用于動物飲水的消毒時，安全性高，刺激性極小，且豬只長期飲用不會傷其腸胃；在用于養(yǎng)殖場設備、車輛、地面等的消毒時，不會殘留有毒有害物質，不著色、不過敏、不水腫。此外，恒凈酸組方為復方有機酸并且采用了獨特的緩沖增效組方，1∶1 000倍稀釋就可達到非常好的殺菌效果，可有效降低使用成本。

恒凈酸和速可凈都能增加小鼠腸道擬桿菌門菌群的豐度，擬桿菌菌群則是一類參與糖類代謝與運輸的菌群，為宿主提供能量，進而促進宿主的生長[21]。恒凈酸和速可凈還能有效改變小鼠腸道菌群組成，如增加了Lachnospiraceae_NK4A136_group、norank_f_Muribaculaceae等益生菌的豐度，這不僅可以提高機體免疫能力，還能夠改變腸道消化酶活性，促進營養(yǎng)物質吸收[21-22]。這也驗證了前人的結論，酸化劑添加到動物飲水中不但能對飲水進行消毒從而防止通過飲水傳播疾病，而且通過飲水攝入動物體內的酸化劑還會對動物產生很好的生物效能[9-10]。此外，酸化劑具有降低胃腸道pH的作用，有利于有益菌的生長[23]，這為酸化劑與不同益生菌組合使用奠定了理論基礎，但益生菌種類繁多，優(yōu)化益生菌與酸化劑配合使用方案值得深入探究。

4 結論

由枸櫞酸、蘋果酸、氨基磺酸、甲酸等制成恒凈酸在0.1 g·L-1濃度時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞白色念珠菌均具有快速、完全殺滅效果。1.56 g·L-1濃度的恒凈酸對非洲豬瘟病毒作用5 min后可達到完全殺滅效果。恒凈酸屬實際無毒級物質，對皮膚無刺激，無致突變作用；對細胞的安全濃度為≤1.56 g·L-1，細胞存活率高于75%，且形態(tài)正常。此外，恒凈酸可以提高腸道中擬桿菌門的豐度，改善腸道菌群，提升免疫力?？偟膩碚f，恒凈酸對環(huán)境中病毒有很好的滅活作用，可以在集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖廠中進行應用。

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Antibacterial Efficacy of Hengjingsuan and Its Impact on Intestinal Flora in Mice

LIU Qijun ZHANG Zhiyang XU Kuan ZHANG Yue ZHANG Nan2

Abstract：To observe the bactericidal efficacy of Hengjingsuan mainly composed of citric acid， malic acid， sulfamic acid and formic acid and its impact on the intestinal microbiota in mice. Suspension quantitative bactericidal test was used to evaluated the bactericidal efficacy of Hengjingsuan on Escherichia coli 8099， Candida albicans ATCC 10231， Staphylococcus aureus CMCC（B） 26003， Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 and African Swine Fever Virus （ASFV）. The acute toxicity test of Hengjingsuan in mice were was carried out by 14 days maximum dose method and the safe concentration of Hengjingsuan was determined by observing the effect of disinfectant on cell morphology of HEK293T cells and calculating the cell activity. The effect on community structure diversity of intestinal bacteria was analyzed by using high-throughput sequencing technology.The results showed that Hengjingsuan solution at the concentration of 0.1 g·L-1 could kill E. coli 8099， C. Albicans ATCC 10231， S. aureus CMCC（B） 26003， P. aeruginosa ATCC 15442 effectively within 2 minutes， and it could kill ASFV effectively at 1.56 g·L-1 within 5 minutes. Hengjingsuan was an actual non-toxic substance， and its safe concentration for the cell was ≤ 1.56 g·L-1. Compared with normal group， the abundance of bacteroidetes significantly increased in mice treated with Hengjingsuan， meanwhile the abundance ratio of bacteroidetes to Firmicutes also increased. Therefore， Hengjingsuan was a new type of disinfectant， which was safe， non-irritating and had great bactericidal efficacy on target pathogenic microorgan.

Keywords：Hengjingsuan; bactericidal efficacy; intestinal flora

收稿日期：2023-10-17

基金項目：內江市科學技術局科技支撐計劃項目（NJKJ21-001）；內江師范學院成果轉化項目（2021ZH02）。

第一作者：劉起軍（1983－），男，博士，高級工程師，從事獸藥研發(fā)與生產工作。E-mail：nan25000@163.com。

通信作者：張楠（1980-），男，博士，副教授，從事應用微生物學研究。E-mail：zhangnan@njtc.edu.cn。