李 瓊,王永紅,劉 淼,張桂玲,陳 瑤,趙晨陽

郴州市第一人民醫(yī)院/湘南學(xué)院第一附屬學(xué)院婦產(chǎn)科,湖南郴州 423000

子癇前期(PE)是臨床常見妊娠并發(fā)癥,全世界范圍內(nèi)PE的發(fā)病率在3%～8%,以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕卣?且常伴有水腫、全身多器官損害,其病理特征為母體全身小血管痙攣、血管內(nèi)皮損傷、胎盤組織缺血[1-2]。PE是導(dǎo)致胎兒生長受限、早產(chǎn)、死胎的主要原因,嚴(yán)重危及母嬰生命健康。目前仍缺乏治療PE的特效藥物,因而探究PE發(fā)病機(jī)制有助于尋找新型治療靶點(diǎn)。內(nèi)分泌腺源性血管內(nèi)皮生長因子(EG-VEGF)是一種新型血管生成因子,主要存在于生殖器官中,定位于合胞體滋養(yǎng)層,可激活受體前動力蛋白1(PROK1)、前動力蛋白2(PROK2),促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲,增強(qiáng)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、趨化能力[3-4]。目前,關(guān)于EG-VEGF、PROKR1、PROKR2水平與PE相關(guān)性的研究較少,本研究主要探討PE患者血清及胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2水平,分析其與PE患者臨床病理特征、病情嚴(yán)重程度、新生兒結(jié)局的相關(guān)性,為PE防治提供新思路及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2022年1月本院收治的100例PE患者作為研究組,依據(jù)病情嚴(yán)重程度[5]分為輕度組和重度組,各50例。另選取同期行剖宮產(chǎn)手術(shù)的健康孕婦50例作為對照組。研究組孕婦年齡20～34歲,平均(27.03±2.10)歲;孕周36～39周,平均(37.71±0.26)周;孕次1～3次,平均(2.31±0.21)次;產(chǎn)次1～3次,平均(2.01±0.11)次;身高155～170 cm,平均(163.01±2.03)cm,體重66～80 kg,平均(73.36±2.12)kg。對照組孕婦年齡19～35歲,平均(26.85±2.06)歲;孕周37～40周,平均(37.75±0.32)周;孕次1～3次,平均(2.28±0.17)次;產(chǎn)次1～3次,平均(1.98±0.10)次;身高157～170 cm,平均(163.32±2.08)cm;體重67～81 kg,平均(74.03±2.18)kg。兩組一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),患者及其家屬知情且簽署知情同意書。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):符合PE診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];單胎妊娠;無其他妊娠期并發(fā)癥;行剖宮產(chǎn)分娩;規(guī)律接受產(chǎn)檢;自然受孕。排除標(biāo)準(zhǔn):既往妊娠過程中有PE史;生殖器官畸形;先天性遺傳疾病;合并甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)等自身免疫性疾病;伴慢性高血壓等心血管疾病;合并糖尿病等代謝性疾病;伴精神障礙或認(rèn)知功能障礙;年齡<19歲或>35歲。

1.3方法

1.3.1采集組織、血液標(biāo)本 剖宮產(chǎn)術(shù)中收集胎盤組織,切取胎盤組織80 mg(2份),取胎盤組織時(shí)應(yīng)避開出血、鈣化灶。將其中一份放入含有RNAlater液(1 mL)的凍存管內(nèi),置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存;另一份用生理鹽水清洗,使用10%中性多聚甲醛固定,過夜后用石蠟包埋,制備厚度約為3 μm的蠟塊。分別于剖宮產(chǎn)前24 h采集兩組空腹外周靜脈血6 mL,3 500 r/min離心5 min留取血清,于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.2熒光定量PCR(qPCR)法檢測血清、胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA水平 取出凍存胎盤組織、血清標(biāo)本,使用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)分別提取組織總RNA,采用miRNeasy Serum/Plasma Kit(上海復(fù)申生物)提取血清總RNA。取1.0 μg RNA標(biāo)本參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化)合成cDNA。取0.2 μg cDNA,按照熒光定量PCR試劑盒說明書(北京天根生化)配制反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2.5 μL,MgSO42.5 μL,dNTPs 2.5 μL,正、反向引物各0.5 μL,RNase-Free ddH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.3免疫組化法檢測胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2蛋白陽性表達(dá)率 取胎盤組織蠟塊,經(jīng)梯度乙醇水化后置于枸櫞酸鹽溶液(10 mmol/L,pH 6.0)中20 min(95～100 ℃),滴加3%過氧化氫溶液孵育25 min(37 ℃),用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,加入山羊血清反應(yīng)15 min,加入EG-VEGF(1∶800,美國Abcam公司)、PROKR1(1∶800、武漢艾美捷科技有限公司)、PROKR2(1∶800、武漢艾美捷科技有限公司)一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜,次日清洗后加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000、美國Abcam公司),37 ℃孵育2 h,棄PBS后加入Max VisionTM免疫組化試劑盒試劑50 μL(上海聯(lián)邁生物工程有限公司),37 ℃孵育15 min,然后滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(江蘇綠葉生物),蘇木素復(fù)染,于1%鹽酸中清洗,使用梯度乙醇脫水,中性樹脂封固,使用CX23光學(xué)顯微鏡觀察(日本奧林巴斯)。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[7]:每張切片隨機(jī)挑選5個(gè)視野(400倍),統(tǒng)計(jì)陽性染色細(xì)胞數(shù)量,具體評分如下。(1)根據(jù)染色程度計(jì)數(shù):未顯色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,深棕色為3分;(2)根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)目:陽性細(xì)胞率<25%為0分,25%≤陽性細(xì)胞率≤50%為1分,50%<陽性細(xì)胞率<75%為2分,陽性細(xì)胞率≥75%為3分。取兩項(xiàng)評分的乘積作為最終得分,≤3分記為陰性,>3分記為陽性。

1.4觀察指標(biāo) (1)比較兩組臨床特征:包括γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、尿酸(UA)、收縮壓、舒張壓、血小板計(jì)數(shù)、新生兒體重、螺旋動脈管壁厚度、螺旋動脈管腔面積、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素氮(BUN)。(2)分析不同組、不同病情嚴(yán)重程度、不同新生兒結(jié)局者血清、胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA水平。(3)分析血清各指標(biāo)與臨床特征相關(guān)性及其對PE診斷價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床特征比較 與對照組比較,研究組收縮壓、舒張壓、血小板計(jì)數(shù)、螺旋動脈管壁厚度增高,GGT、LDH、UA、ALT、AST、MDA水平升高,新生兒體重、螺旋動脈管腔面積降低,BUN、SOD水平降低(P<0.05),見表1。

表1 兩組臨床特征比較

2.2兩組血清、胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA水平比較 與對照組比較,研究組血清、胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清、胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA水平比較

2.3兩組胎盤組織中各指標(biāo)陽性表達(dá)率比較 EG-VEGF、PROKR1、PROKR2蛋白定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì),陽性顆粒呈棕黃色、淺黃色、深棕色,研究組EG-VEGF、PROKR1、PROKR2蛋白陽性表達(dá)率低于對照組(P<0.05),見表3。

表3 兩組胎盤組織中各指標(biāo)陽性表達(dá)率比較[n(%)]

2.4不同病情嚴(yán)重程度患者血清、胎盤組織中各指標(biāo)水平比較 與輕度組患者比較,重度組患者血清、胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 不同病情嚴(yán)重程度患者血清、胎盤組織中各指標(biāo)水平比較

2.5血清中各指標(biāo)與臨床特征、病情嚴(yán)重程度相關(guān)性 血清EG-VEGF、PROKR1、PROKR2水平與新生兒體重、螺旋動脈管腔面積、BUN、SOD呈正相關(guān)(P<0.05),與收縮壓、舒張壓、螺旋動脈管壁厚度、GGT、LDH、ALT、MDA、病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 各指標(biāo)與臨床特征、病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

2.6ROC曲線分析血清中各指標(biāo)對PE的診斷價(jià)值 以研究組100例為陽性標(biāo)本,以對照組50例為陰性標(biāo)本繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,聯(lián)合診斷PE的曲線下面積(AUC)大于單項(xiàng)診斷(P<0.05)。見表6、圖1。

圖1 各指標(biāo)對PE的ROC曲線分析

表6 ROC曲線分析血清中各指標(biāo)對PE的診斷價(jià)值

2.7不同新生兒結(jié)局孕婦血清中各指標(biāo)水平比較 研究組中新生兒不良結(jié)局發(fā)生率為62.00%(62/100),對照組新生兒為足月正常新生兒(50例)。與足月正常新生兒比較,胎盤早剝、巨大兒、胎兒窘迫、早產(chǎn)兒、新生兒窒息等孕婦血清EG-VEGF、PROKR1、PROKR2 mRNA水平降低(P<0.05)。見表7。

表7 不同新生兒結(jié)局孕婦血清中各指標(biāo)水平比較

3 討 論

胎盤組織發(fā)育過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞可分泌激素、細(xì)胞因子,PE可分為2個(gè)階段:第1階段為滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤不足誘發(fā)子宮螺旋動脈重塑障礙,導(dǎo)致母體全身血管阻力增加,血小板聚集增強(qiáng),促使凝血系統(tǒng)異常,致使胎兒缺血缺氧,因而探究其浸潤行為的病理機(jī)制具有重要意義[8-9];第2階段為胎盤因子進(jìn)入母體血液循環(huán),可激活氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng),造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,進(jìn)一步引起生理病理改變[10-11],因而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮障礙、凝血及血管生成的功能是目前治療、預(yù)防PE發(fā)生發(fā)展的主要途徑。

PE患者外周血、胎盤中EG-VEGF水平降低,可抑制下游細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)/基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)信號傳導(dǎo),導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵不足[12]。本研究結(jié)果顯示,研究組血清、胎盤組織中EG-VEGF水平低于對照組,與文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果相似。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),重度患者低于輕度患者,研究組EG-VEGF陽性表達(dá)率低于對照組,表明EG-VEGF表達(dá)下調(diào)與PE發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,血清EG-VEGF水平與新生兒體重呈正相關(guān),而與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),表明血清EG-VEGF水平在一定程度上可反映疾病嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn),血清EG-VEGF水平與LDH呈負(fù)相關(guān),其原因可能為EG-VEGF可調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、胎盤血管生成,其水平降低可引起血管系統(tǒng)內(nèi)皮功能障礙,增加LDH釋放量,同時(shí)還可能與PE患者體內(nèi)存在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、溶血有關(guān)。隨著PE病情加重,胎盤螺旋動脈管腔面積降低,螺旋動脈管壁厚度增加[13]。本研究結(jié)果顯示,血清EG-VEGF水平與螺旋動脈管腔面積呈正相關(guān),而與螺旋動脈管壁厚度呈負(fù)相關(guān),表明EG-VEGF水平降低可能參與胎盤螺旋動脈重鑄過程。EG-VEGF水平降低可能影響內(nèi)皮細(xì)胞生成,誘發(fā)胎盤螺旋動脈生成障礙,引起螺旋動脈灌注不足。氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇是PE發(fā)生的重要病理改變。MDA屬于氧化代謝產(chǎn)物,SOD屬于抗氧化酶,本研究中,研究組MDA水平高于對照組,SOD水平低于對照組,表明PE患者體內(nèi)存在氧化-抗氧化失衡,這與既往研究結(jié)果[14]相似,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),EG-VEGF與SOD呈正相關(guān),而與MDA呈負(fù)相關(guān)。這提示EG-VEGF可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng),但其是否可通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激參與PE發(fā)生發(fā)展過程尚需深入探討。

BUN、GGT、ALT與PE病情相關(guān),可參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、谷胱甘肽代謝,引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,并可能是影響PE發(fā)生的危險(xiǎn)因素[15]。本研究中,研究組GGT、ALT水平高于對照組,BUN水平低于對照組,且EG-VEGF與BUN呈正相關(guān),而與GGT、ALT呈負(fù)相關(guān),表明EG-VEGF水平降低可能引起肝腎功能指標(biāo)異常變化,促使氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇,影響滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵,進(jìn)一步誘發(fā)PE。EG-VEGF與子宮內(nèi)膜脈動指數(shù)(PI)呈正相關(guān),并可作為評估不明原因不孕婦女局部血管生成的標(biāo)志物[16]。EG-VEGF表達(dá)失調(diào)與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]。目前臨床常采用24 h尿蛋白、臨床癥狀等診斷PE,但難以及時(shí)診斷及評估病情進(jìn)展。EG-VEGF診斷PE未能顯示足夠大的AUC,表明該指標(biāo)診斷PE的價(jià)值有限,需與其他指標(biāo)結(jié)合使用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)合成、降解失衡可能誘發(fā)PE,MMPs與絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲有關(guān),EG-VEGF可激活受體PROKR1、PROKR2,促進(jìn)絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)、MMP-9表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移、侵襲[18-19]。PROK1、PROKR2失調(diào)與妊娠并發(fā)癥有關(guān),可調(diào)節(jié)胚胎著床,胎盤/蛻膜血管發(fā)育,并可抑制炎癥細(xì)胞浸潤[20-21]。本研究嘗試性分析PROK1、PROKR2與PE發(fā)生發(fā)展相關(guān)性,結(jié)果顯示研究組血清、胎盤組織中PROKR1、PROKR2水平低于對照組,且與臨床特征、病情嚴(yán)重程度密切相關(guān),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其水平異常變化與新生兒不良結(jié)局有關(guān)。EG-VEGF、PROKR1、PROKR2可能參與PE發(fā)生發(fā)展的機(jī)制:EG-VEGF水平降低導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞入侵不足,致使子宮動脈重建,增加生長因子分泌量;EG-VEGF可能調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,改善胎盤組織缺氧狀況;PROKR1、PROKR2可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),減輕交感神經(jīng)活動程度,改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。本研究結(jié)果顯示,血清EG-VEGF、PROKR1、PROKR2水平聯(lián)合診斷PE的AUC大于單項(xiàng)診斷,表明聯(lián)合檢測血清各指標(biāo)水平可提高PE診斷價(jià)值。

綜上所述,PE患者血清、胎盤組織中EG-VEGF、PROKR1、PROKR2水平降低,且與臨床特征、病情嚴(yán)重程度及新生兒結(jié)局有關(guān),其對PE的診斷具有臨床應(yīng)用價(jià)值,需進(jìn)一步探究其與PE發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相關(guān)性,可為PE的治療提供新方向。