黃 蓉,段小女,芮勇宇△

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東廣州 510000;2.廣州市番禺區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科,廣東廣州 511490

全基因組測(cè)序是近年來(lái)發(fā)展很快的一種基因檢測(cè)技術(shù)[10],此技術(shù)可對(duì)菌株的遺傳信息進(jìn)行分析,進(jìn)一步檢測(cè)耐藥基因、毒力基因等,并能夠預(yù)測(cè)未知的潛在的耐藥基因和毒力基因。目前,全基因組測(cè)序應(yīng)用較廣的是二代測(cè)序和三代測(cè)序,二代測(cè)序單堿基檢測(cè)準(zhǔn)確率高,但讀長(zhǎng)短,拼接和擴(kuò)增過(guò)程易引入錯(cuò)配堿基,三代測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng),但單堿基錯(cuò)誤率很高,因此,本研究將二代和三代測(cè)序技術(shù)結(jié)合起來(lái),以實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的組裝和測(cè)序[11]。本研究擬分析多重耐藥CF的質(zhì)粒,探討質(zhì)粒所含的耐藥基因與毒力基因、分子遺傳與傳播方式等,為CF感染的防控提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年7月至2019年6月南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院檢驗(yàn)科413例就診者的413份糞便剩余標(biāo)本。將標(biāo)本分別接種于含2 μg/mL美羅培南的MH培養(yǎng)基(自配)對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物美羅培南不敏感的革蘭陰性桿菌進(jìn)行初篩,共篩選出5株耐碳青霉烯類(lèi)細(xì)菌(CRE),篩選出的菌株經(jīng)純培養(yǎng)后采用紙片法凍存于-80 ℃冰箱。

1.2儀器與試劑 BD PhoenixTM全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、PhoenixTMPMIC/ID革蘭陽(yáng)性菌鑒定/藥敏復(fù)合板(美國(guó)BD公司);美羅培南(北京索萊寶科技有限公司);MH瓊脂粉(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司);替加環(huán)素E-test[天康信 (北京) 科技有限公司];Ezup柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司);PCR儀(德國(guó) Eppendorf 公司);核酸蛋白分析儀 Nanodrop 2000(美國(guó) Thermo 公司);QIAGEN細(xì)菌全基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(北京天康信科技有限公司);PCR、測(cè)序試劑(上海生工生物工程股份有限公司、深圳海一時(shí)代基因科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株的鑒定和藥敏試驗(yàn) 復(fù)蘇保存的5株CRE,純培養(yǎng)活化后配制成0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?使用BD PhoenixTM全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)和PhoenixTMPMIC/ID 革蘭陰性菌鑒定/藥敏復(fù)合板進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)獲得最低抑菌濃度(MIC),并加做替加環(huán)素E-test藥敏試驗(yàn),篩選出多重耐藥的CF 1株。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。試驗(yàn)操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)和標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(SOP)操作。

1.3.2質(zhì)粒耐藥基因的檢測(cè) 用QIAGEN細(xì)菌質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒后,對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行碳青霉烯類(lèi)耐藥基因的特異性PCR擴(kuò)增,獲取常見(jiàn)碳青霉烯酶基因擴(kuò)增檢測(cè)常見(jiàn)碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaSPM、blaOXA-48和常見(jiàn)的ESBL基因blaCTX-M、blaTEM、blaSHV。

當(dāng)然，生命觀念的形成離不開(kāi)科學(xué)思維和科學(xué)探究，學(xué)生在形成生命觀念、進(jìn)行科學(xué)思維和探究科學(xué)探究的過(guò)程中，最終會(huì)形成一定的社會(huì)責(zé)任和義務(wù)。因此，在生命觀念培育過(guò)程中，教師要利用生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)4個(gè)要素的相互關(guān)系，充分挖掘教學(xué)內(nèi)容背后的生命觀念，要利用4個(gè)生命觀念之間的關(guān)系，針對(duì)不同的教學(xué)內(nèi)容采取不同的培育策略，多方面多途徑幫助學(xué)生樹(shù)立并發(fā)展生命觀念，不斷提高學(xué)生的生物學(xué)核心素養(yǎng)。

1.4菌株的全基因組分析

1.4.1二代測(cè)序法檢測(cè)菌株耐藥基因 使用Ezup 柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒提取該細(xì)菌DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,Nanodrop檢測(cè)DNA純度分析。將DNA送公司測(cè)序,并通過(guò)細(xì)菌多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)CF進(jìn)行同源性分型;使用BLAST軟件,把目標(biāo)基因輸入CARD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲取相關(guān)耐藥基因并注釋耐藥信息。

1.4.2質(zhì)粒全基因組測(cè)序、組分與功能分析 將質(zhì)粒DNA結(jié)合二代、三代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行全基因組測(cè)序、質(zhì)粒組裝,使用Unicycler、Circos、SSPACE-LongRead等軟件分析并注釋基因信息。

1.4.3質(zhì)粒的比較基因組分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載KP765744.1(泄殖腔腸桿菌菌株質(zhì)粒ECN49)、MH917283.1(肺炎克雷伯菌菌株質(zhì)粒pA575-NDM)、JN247852質(zhì)粒(肺炎克雷伯菌質(zhì)粒pIncX-SHV)的全基因組序列,與本質(zhì)粒pNFYY061進(jìn)行比較及基因組學(xué)分析,主要有共線性分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測(cè)、注釋InDel檢測(cè)及共有和特有基因分析、基因家族分析、物種進(jìn)化分析和同源性分析。

1.5質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 利用肉湯法將篩選出的CF作為供體菌、EJ53為受體菌進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移。首先,將供體菌和受體菌分別接種于含有 2 μg/mL 美羅培南的 MH 平板上和含 150 μg/mL 疊氮化鈉的 MH 平板上,置于 35 ℃,5% CO2的恒溫孵箱中過(guò)夜培養(yǎng)后,挑取供體菌和受體菌的單個(gè)純菌落分別接種于已高壓滅菌的5 mL LB肉湯中,置于35 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床中16～18 h;第二步,分別吸取肉湯培養(yǎng)的供體菌和受體菌各0.5 mL 菌懸液,分別再接種4.5 mL 新鮮 LB 肉湯培養(yǎng)基中,供體菌靜止培養(yǎng)4 h、受體菌搖床培養(yǎng)4 h;第三步,混合培養(yǎng):將供體菌和受體菌各0.5 mL菌懸液加入至 4 mL LB 肉湯中,靜止培養(yǎng)18 h;第四步,取100 μL接合前和接合后原菌液,以及稀釋10倍、100倍菌液均勻涂布于含抗菌藥物的 MH 瓊脂平板上( 2 μg/mL 美羅培南和 150 μg/mL 的疊氮化鈉),35 ℃ 孵箱過(guò)夜培養(yǎng);第五步,挑取單個(gè)菌落接種于篩選平板,純化后保存菌種;第六步,進(jìn)行接合菌的鑒定及藥敏試驗(yàn),將接合菌純菌落制備成0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?使用BD PhoenixTM全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定及藥敏試驗(yàn);第七步,PCR法進(jìn)行接合菌耐藥基因的檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1鑒定結(jié)果 413份糞便標(biāo)本中篩選出的5株CRE,檢出率為1.21%(5/413),5株CRE分別來(lái)源于不同科室,其中肺炎克雷伯菌2株,大腸埃希菌2株,耐碳青霉烯類(lèi)CF(CRCF)1株。

2.2藥敏結(jié)果 BD PhoenixTM上機(jī)結(jié)果、K-B法以及E-test顯示,5株CRE對(duì)頭孢菌素類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物、復(fù)方磺胺甲噁唑均耐藥,對(duì)氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素等抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥,其中,鑒定為CF菌的菌株對(duì)阿米卡星敏感,但對(duì)以上抗菌藥物均耐藥。見(jiàn)表1。

表1 供體菌CF對(duì)10種抗菌藥物的MIC及藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3質(zhì)粒耐藥基因檢測(cè) 經(jīng)特異性PCR法檢測(cè)該菌株質(zhì)粒上耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥相關(guān)基因有blaNDM-1、blaSHV-12。

2.4CF菌株DNA測(cè)序和MLST分型 經(jīng)MLST分型該菌株屬于ST22型,共含有5 412個(gè)基因,注釋CARD的耐藥基因一共有367個(gè)。其中,碳青霉烯酶類(lèi)耐藥基因、AmpC酶基因、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因、喹諾酮類(lèi)耐藥基因等。見(jiàn)表2。

表2 CF的耐藥基因攜帶情況

2.5質(zhì)粒全基因組測(cè)序、組分與功能分析

2.5.1質(zhì)粒組裝結(jié)果 樣品組裝后得到1條成環(huán)質(zhì)粒NFYY061和1個(gè)質(zhì)粒片段NFYY061-P1seg。見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)粒組裝結(jié)果

2.5.2基因組分與功能分析結(jié)果 成環(huán)質(zhì)粒pNFYY061共預(yù)測(cè)到69個(gè)編碼基因,有耐藥基因2個(gè),為金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)基因 blaNDM-1和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因blaSHV-12,其他致病相關(guān)基因15個(gè);NFYY061還預(yù)測(cè)到2個(gè)基因島:GIs01長(zhǎng)10 506 bp,包括13個(gè)基因,此島上有如blaSHV12、熱休克蛋白家族HSP60的伴侶蛋白GroEL等一些耐藥和毒力相關(guān)的基因;GIs02長(zhǎng)7 793 bp,包含15個(gè)基因,只注釋到了一個(gè)起始密碼子,其余都是假設(shè)蛋白。質(zhì)粒片段NFYY061-P1seg共預(yù)測(cè)到65個(gè)編碼基因,其中耐藥基因0個(gè),毒力相關(guān)的基因有30個(gè),這個(gè)質(zhì)粒片段上也預(yù)測(cè)到了2個(gè)基因島:GIs01長(zhǎng)7 319 bp,含9個(gè)蛋白,主要編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白,有2個(gè)致病相關(guān)基因;GIs02長(zhǎng)9 737 bp,含14個(gè)基因,主要編碼致病相關(guān)的汞離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

2.6比較基因組分析結(jié)果

2.6.1共線性分析結(jié)果 CF質(zhì)?；蚪M與參考質(zhì)粒JN247852、KP765744.1、MH917283.1基因組之間均具有較強(qiáng)的共線性關(guān)系。

2.6.2SNP檢測(cè)及InDel檢測(cè)結(jié)果 與參考質(zhì)粒比較,耐藥基因blaSHV2上有11個(gè)SNP位點(diǎn),5個(gè)InDel位點(diǎn)。

2.6.3共有和特有基因分析結(jié)果 通過(guò)比較質(zhì)粒pNFYY061基因組和參考質(zhì)?；蚪M的蛋白序列,構(gòu)建了基因組間的Core和Pan基因集,質(zhì)粒pNFYY061基因組和參考質(zhì)粒JN247852、KP765744.1、MH917283.1基因組的共有和特有基因關(guān)系見(jiàn)Venn圖(圖1)。

注:每個(gè)橢圓表示一個(gè)樣品,每個(gè)區(qū)域上的數(shù)據(jù)表示在且僅在此區(qū)域的樣品中出現(xiàn)的cluster的個(gè)數(shù),一個(gè)cluster表示一組具有大于40%相似性、序列長(zhǎng)度差異低于0.4的基因集。

根據(jù)非共有基因在不同樣品中的分布繪制熱圖,見(jiàn)圖2。由此可知,非共有基因在質(zhì)粒pNFYY061中的分布與參考質(zhì)粒KP765744.1、MH917283.1較近,與參考質(zhì)粒JN247852較遠(yuǎn)。

注:圖片下方對(duì)應(yīng)每個(gè)樣品ID,左方為非共有基因的聚類(lèi)樹(shù),上方為樣品的聚類(lèi)樹(shù),中間為基因覆蓋度熱圖,不同覆蓋度以不同顏色表示,顏色與覆蓋度的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖例。

2.6.4物種進(jìn)化分析結(jié)果 基于質(zhì)粒pNFYY061和參考質(zhì)粒JN247852、KP765744.1、MH917283.1的31個(gè)共有基因的進(jìn)化樹(shù)。見(jiàn)圖3。

注:分支上的數(shù)字表示分支可信度,值越接近100表示可信度越高;分支長(zhǎng)度表示進(jìn)化距離的大小,進(jìn)化距離以平均每個(gè)核苷酸的替換次數(shù)來(lái)計(jì)算。

2.6.5同源性分析結(jié)果 比較pNFYY061的基因組和參考質(zhì)粒KP765744.1、MH917283.1基因組之間的同源性關(guān)系,其同源性結(jié)果見(jiàn)表4。由此可知,質(zhì)粒pNFYY061和參考質(zhì)粒KP765744.1、MH917283.1間的同源性較高(ANI>95%)。

表4 pNFYY061同源性分析結(jié)果(%)

2.7質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 陽(yáng)性接合子經(jīng)PCR法可檢測(cè)到blaNDM-1、blaSHV-2,且藥敏試驗(yàn)顯示對(duì)美羅培南的MIC大于2 μg/mL,對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥。

3 討 論

CF為條件致病菌,機(jī)體抵抗力下降時(shí)可引起腹瀉和腸道外感染如腦膜炎癥,敗血癥、泌尿道、呼吸道以及創(chuàng)傷感染等[12],盡管新生兒和免疫功能低下患者感染枸櫞酸桿菌的風(fēng)險(xiǎn)已引起了臨床的關(guān)注[13],但相較于其他腸桿菌,枸櫞酸桿菌的發(fā)病率較低。近年來(lái),枸櫞酸桿菌引起的感染逐漸增加,呈現(xiàn)出多重耐藥的特性,但據(jù)中國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示,其發(fā)病率僅占腸桿菌感染的3%～6%,占所有革蘭陰性感染的0.8%[14],遠(yuǎn)低于肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等常見(jiàn)致病性的腸桿菌,所以CF的感染仍然不受臨床重視。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)枸櫞酸桿菌尤其是CF的相關(guān)研究報(bào)道仍然比較少。本研究從大量患者糞便標(biāo)本中分離鑒定獲得CF,并進(jìn)行菌株藥敏試驗(yàn)、菌株與質(zhì)粒DNA耐藥基因檢測(cè)和測(cè)序、MLST分型、質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)、質(zhì)粒全基因組測(cè)序來(lái)對(duì)多重耐藥的CF進(jìn)行全基因組分析。

本研究中顯示,413份臨床糞便標(biāo)本中,只分離出了1株CRCF,表明CRCF在人群中的定植率比較低。該CF菌株藥敏結(jié)果顯示,該菌株以多重耐藥為主要特點(diǎn),對(duì)臨床常用抗菌藥物高度耐藥;檢測(cè)到的耐藥基因與藥敏結(jié)果基本相符; 該菌株攜帶的多種耐藥基因,包括β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)(ESBLs、AmpC和碳青霉烯類(lèi))耐藥基因、喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)耐藥基因等,與報(bào)道的肺炎克雷伯菌的耐藥模式相似[15];但由于該CF對(duì)阿米卡星敏感,阿米卡星可能是治療多耐藥CF的一種有效藥物。在 2017 年《廣泛耐藥革蘭陰性菌感染的實(shí)驗(yàn)診斷、抗菌治療及醫(yī)院感染控制中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》中明確提出,廣泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌感染常采用2 種或 3 種藥物聯(lián)合治療,即以替加環(huán)素及多黏菌素為基礎(chǔ)的聯(lián)合其他類(lèi)藥物的治療方式來(lái)治療。

本研究采用MLST 的方法對(duì)CF進(jìn)行分型,結(jié)果顯示該CF 菌株為ST22型,與最近報(bào)道的全球流行型CF菌株結(jié)果一致[16]。經(jīng)過(guò)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn),該CF菌株上存在多種β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)基因,其中B類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶基因blaCMY-48和blaCMY-49同時(shí)出現(xiàn)在該CF菌株上。

本研究對(duì)這株多重耐藥CF的質(zhì)粒進(jìn)行了全基因組分析,發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒為incX3型,質(zhì)粒環(huán)上同時(shí)攜帶blaNDM-1和blaSHV12,這2個(gè)基因同時(shí)存在于CF質(zhì)粒上,接合實(shí)驗(yàn)中,可檢測(cè)到陽(yáng)性接合子blaNDM-1和blaSHV-12,且表達(dá)出對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥,表明耐藥基因位于質(zhì)粒上,有水平轉(zhuǎn)移的可能。且該質(zhì)粒與MH917283.1(肺炎克雷伯菌菌株質(zhì)粒pA575-NDM)處于同一進(jìn)化樹(shù)分支上,表明該質(zhì)粒與肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)的攜帶NDM-1的質(zhì)粒有較近的親緣關(guān)系,同時(shí),該質(zhì)粒與泄殖腔腸桿菌菌株ECN49質(zhì)粒和肺炎克雷伯菌菌株質(zhì)粒pA575-NDM有極高的同源性,說(shuō)明可能該質(zhì)?？稍诰N間橫向轉(zhuǎn)移。

人體腸道是包括耐藥菌的多種細(xì)菌的主要儲(chǔ)存庫(kù),也是重要的抗性基因庫(kù),CF是腸道常見(jiàn)的定植菌和環(huán)境菌,這些CF本身毒力不高,但是容易累積耐藥基因,尤其當(dāng)宿主暴露在抗菌藥物下或長(zhǎng)期住院時(shí)[17],除了耐藥基因,它們還是累積基因捕獲和傳播的手段,如整合子、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等,且CF對(duì)表面活性劑、化學(xué)消毒劑、紫外線照射等具有一定抵抗作用,常規(guī)消殺不易將其從醫(yī)療設(shè)備上清除干凈,這些累積的基因,可以轉(zhuǎn)移至毒力更高的菌株上,有可能促成細(xì)菌病原體的進(jìn)化[18]。因此,呼吁相關(guān)部門(mén)要加強(qiáng)對(duì)此類(lèi)細(xì)菌的防控,防止暴發(fā)流行。