李 瑤，熊彩明，張佳樂，馮學(xué)珍，馮書珍,*

（1.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué)理學(xué)院，廣西 柳州 545006）

隨著我國海洋藥物研究的加速發(fā)展和現(xiàn)代提取技術(shù)的應(yīng)用研究，海藻多糖的功能活性及藥食兩用價(jià)值越來越受到關(guān)注和重視[1]。裙帶菜（Undaria pinnatifidaSuringar）作為我國重要的藥用海藻和功能性食品[2]，其多糖已被證實(shí)具有自由基清除能力、降血糖等活性[3-4]，但天然海藻多糖本身生物活性相對(duì)較弱[5]，常通過化學(xué)方法添加修飾以增強(qiáng)多糖活性。多糖化學(xué)修飾主要有磷酸化、硫酸化、羧甲基化、乙?；确椒╗6]，其中，磷酸化修飾在增強(qiáng)多糖生物活性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，如南征[7]研究表明，磷酸化修飾杏鮑菇多糖可顯著提高對(duì)1,1-二苯基-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基（·）、羥自由基（·OH）的清除能力，與硫酸化、羧甲基化、乙?；揎椣啾?，清除能力分別增加72.46%～96.93%、18.64%～20.64%和3.40%～55.63%。

磷酸化修飾可以通過改變多糖結(jié)構(gòu)，包括分子質(zhì)量、空間構(gòu)象、分支度、糖苷鍵等，進(jìn)而改變多糖生物活性[8-9]，但結(jié)構(gòu)特征對(duì)其生物活性的影響卻不盡相同。如王帥等[10]發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量較小的香菇多糖具有較強(qiáng)的自由基清除能力，但Deng Jie等[11]則發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖的分子質(zhì)量與其·OH和·清除能力之間無對(duì)應(yīng)關(guān)系；陳玥彤等[12]研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳多糖經(jīng)磷酸化修飾后出現(xiàn)三股螺旋結(jié)構(gòu)，能夠顯著增強(qiáng)其生物活性。目前，關(guān)于藥食兩用海藻多糖的磷酸化修飾研究處于初級(jí)階段，僅Jiang Nanfang等[13]對(duì)孔石莼多糖進(jìn)行磷酸化修飾，發(fā)現(xiàn)修飾后的多糖自由基清除能力顯著提高，其多糖結(jié)構(gòu)如單糖組成發(fā)生改變。磷酸化修飾對(duì)裙帶菜多糖生物活性的影響及其伴隨的結(jié)構(gòu)變化尚不明確。

本研究采用微波輔助酶法提取裙帶菜多糖，經(jīng)離子交換柱層析和凝膠柱層析分離純化后進(jìn)行磷酸化修飾，綜合運(yùn)用紫外吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、高碘酸氧化及Smith降解法、剛果紅實(shí)驗(yàn)、β-消去反應(yīng)、碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)對(duì)磷酸化裙帶菜多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，評(píng)價(jià)其修飾前后自由基清除能力和降血糖活性及其相關(guān)性，以期為裙帶菜多糖構(gòu)效關(guān)系研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，并為裙帶菜功能性食品的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裙帶菜于2022 年11 月采自廣西北部灣海域（20°54 ′10 ″～21°40 ′30 ″ N，109°05′20″～109°11′35″E）。用清水沖洗除去泥沙、鹽分等雜質(zhì)，靜置至干燥后，研磨密封備用。

透析袋（截留分子質(zhì)量為8～140 kDa）廣州雍儀生物科技有限公司；中性蛋白酶（50 U/mg）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）、甘油、赤蘚醇、NaBH4（分析純）、阿卡波糖（純度99%）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）（純度98%）、α-葡萄糖苷酶（100 U/mg）美國Sigma公司；三聚磷酸鈉、三偏磷酸鈉、VC、鉬酸銨、過氧化氫、磷酸二氫鉀、2,5-二羥基苯甲酸、乙腈、六水氯化鎂、三羥甲基氨基甲烷、高碘酸鈉、碘酸鈉、三氟乙酸、乙二醇、乙酸、剛果紅溶液、碘-碘化鉀試劑等其他試劑與單糖（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝科技生物有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；DEAE-Cellulose 52離子交換柱（2 cm×20 cm）美國Whatman 公司；Sephadex G-100凝膠色譜柱（2 cm×20 cm）美國Pharmacia公司；UV-2600紫外分光光度計(jì)、GC2014氣相色譜儀 日本Shimadzu公司；Multiskan GO全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀上海萊?？茖W(xué)儀器有限公司；Autoflex speed TOF/TOF MALDI-TOF-MS儀 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 裙帶菜多糖的提取、分離與純化

參照李瑤等[3]的方法，采用微波輔助酶法提取裙帶菜多糖，后經(jīng)30%過氧化氫進(jìn)行脫色，純水透析、減壓濃縮、冷凍干燥即得裙帶菜粗多糖（Undaria pinnatifidaSuringar polysaccharide，UPP）。UPP經(jīng)DEAE-Cellulose 52型陰離子交換樹脂分離，依次用蒸餾水、0.05、0.10、0.25、0.50 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，采用苯酚硫酸法繪制洗脫曲線，收集洗脫樣品。根據(jù)洗脫曲線收集多糖，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、減壓濃縮后，透析2 d，濃縮、冷凍干燥，得到1 個(gè)洗脫部分的多糖UPP1。再經(jīng)Sephadex G-100凝膠色譜柱純化，用2 mL去離子水洗脫，得到UPP1a。

1.3.2 磷酸化裙帶菜多糖的制備

參照Duan Zhen等[14]的方法，略作修改。稱取3.5 g三聚磷酸鈉和3.5 g三偏磷酸鈉溶解于100 mL超純水中，與1 mL 0.1 g/mL的UPP1a溶液混合，加入0.05 g/mL碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，在55 ℃條件下反應(yīng)4.5 h，期間不斷攪拌。反應(yīng)結(jié)束后，向混合溶液中加入4 倍體積的95%乙醇反應(yīng)8 h，將樣液置于透析袋中透析48 h，濃縮凍干即得磷酸化裙帶菜多糖（UPP1a-P）。

1.3.3 UPP1a-P的結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.3.1 取代度的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用鉬藍(lán)比色法[15]：準(zhǔn)確稱取200 mg六水氯化鎂和6 g三羥甲基氨基甲烷溶于300 mL超純水，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，制得Tris緩沖液。量取不同體積的0.1 mg/mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中并補(bǔ)充超純水至5 mL，依次加入3 mL Tris緩沖液和定磷試劑（0.05 mol/L VC水溶液、3 mol/L硫酸溶液和0.03 g/mL鉬酸銨溶液），混合均勻，在45 ℃條件下反應(yīng)30 min，冷卻后于580 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以磷酸根濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取0.01 g UPP1a-P于試管中，依次加入1 mL的濃硫酸、濃硝酸，加熱至冒煙。冷卻后加入1 mL 0.3 g/mL過氧化氫溶液，再緩慢加熱，重復(fù)上述操作直至不再冒煙。冷卻后加入1 mL 6 mol/L鹽酸溶液，并用超純水定容至50 mL。取5 mL定容液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中磷酸根含量，取代度按照式（1）計(jì)算[16]。

式中：P為樣品中的磷酸根含量/%。

1.3.3.2 紫外光譜測(cè)定

稱取一定量的UPP1a與UPP1a-P分別配制成1 mg/mL溶液置于比色皿中，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描[17]。

1.3.3.3 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

采用溴化鉀壓片法，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)對(duì)UPP1a、UPP1a-P進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描。

1.3.3.4 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用MALDI-TOF-MS法[18]測(cè)定磷酸化前后裙帶菜多糖的相對(duì)分子質(zhì)量：向100 μL乙腈-水-三氟乙酸（體積比50∶50∶1）中分別加入1 mg的UPP1a、UPP1a-P、2,5-二羥基苯甲酸，混合均勻，使其溶解，得到10 mg/mL的UPP1a、UPP1a-P、2,5-二羥基苯甲酸基質(zhì)溶液。分別吸取2 μL樣品溶液和基質(zhì)溶液，充分混勻。取1 μL混合溶液滴加在樣品靶上，晾干后，將點(diǎn)樣板送入離子源中進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)掃描信號(hào)得到UPP1a及UPP1a-P相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.3.5 高碘酸氧化及Smith降解反應(yīng)

高碘酸氧化反應(yīng)參照陳光靜[19]的方法，略作修改。將30 mmol/L高碘酸鈉和碘酸鈉溶液按照不同的比例混合，取0.2 mL混合液，稀釋到50 mL后于紫外分光光度計(jì)223 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以混合后的高碘酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制高碘酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。取15 mg UPP1a-P，溶于30 mmol/mL高碘酸溶液中，混合均勻后于4 ℃下避光反應(yīng)，間歇振蕩，當(dāng)吸光度基本保持不變時(shí)，計(jì)算高碘酸鈉的消耗量。加入2 mL乙二醇停止反應(yīng)，于25 ℃下反應(yīng)30 min。取2 mL反應(yīng)液，加入0.01 g/mL酚酞溶液，用0.066 mol/mL氫氧化鈉溶液滴定，計(jì)算甲酸生成量。

Smith降解反應(yīng)參照Liao Wenzhen等[20]的方法，略作修改。取上述高碘酸氧化產(chǎn)物置于試管中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸溶解，120 ℃水解2 h。冷卻至室溫后多次加入少量甲醇，45 ℃減壓蒸發(fā)去除殘余的三氟乙酸，加水溶解，再加入70 mg的NaBH4避光放置24 h，用0.5 mol/L乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥得到降解產(chǎn)物。降解產(chǎn)物采用糖腈乙酰化的方法經(jīng)衍生處理后進(jìn)行氣相色譜（gas chromatography，GC）分析[21]。

1.3.3.6 剛果紅實(shí)驗(yàn)

參照楊東達(dá)[22]的方法，準(zhǔn)確配制1 mg/mL UPP1a、UPP1a-P溶液，取1 mL多糖溶液與1 mL 50 mmol/L剛果紅溶液于試管中混勻，后分別加入3 mL不同濃度的NaOH水溶液，混勻，使溶液中NaOH濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L。在400～600 nm波長(zhǎng)范圍，采用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，測(cè)定溶液的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.3.7β-消去反應(yīng)

取10 mg UPP1a-P，加入3 mL 0.2 mol/L NaOH水溶液，于45 ℃下放置3 h，冷卻至室溫后用紫外分光光度計(jì)于190～400 nm波長(zhǎng)掃描。另取10 mg UPP1a-P，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液，置于45 ℃下3 h，冷卻后于190～400 nm波長(zhǎng)掃描。

1.3.3.8 碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)

分別取4 mL 1 mg/mL的UPP1a、UPP1a-P溶液，與2.4 mL碘-碘化鉀試劑（含0.000 2 g/mL I2的0.002 g/mL KI溶液），混勻后，在300～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描[23]。

1.3.4 UPP1a-P的生物活性測(cè)定

1.3.4.1 自由基清除能力測(cè)定

參照馮書珍等[24]的方法，將UPP1a和UPP1a-P樣品溶于超純水，分別配制成不同質(zhì)量濃度（0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 mg/mL）的溶液，以VC作為陽性對(duì)照，測(cè)定UPP1a及UPP1a-P對(duì)DPPH自由基、O2-·和·OH的清除能力并計(jì)算半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。自由基清除率與IC50分別按式（2）、（3）計(jì)算。

式中：A樣品為樣品組吸光度；A對(duì)照為對(duì)照組吸光度；A空白為空白組吸光度。

式中：Xm為最大濃度的對(duì)數(shù)；I為最大濃度/相鄰濃度的對(duì)數(shù)；P為自由基清除率之和/%；Pm為最大自由基清除率/%；Pn為最小自由基清除率/%。

1.3.4.2 降血糖活性測(cè)定

參照馮學(xué)珍等[25]的方法，將UPP1a和UPP1a-P樣品分別配制成不同質(zhì)量濃度（3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL）的溶液，以阿卡波糖作為陽性對(duì)照，測(cè)定UPP1a及UPP1a-P對(duì)α-葡萄糖苷酶（底物pNPG）的抑制活性并計(jì)算IC50。酶活性抑制率和IC50分別按式（4）、（3）計(jì)算：

式中：A1為藥物反應(yīng)組（樣品+酶+底物）吸光度；A2為藥物對(duì)照組（樣品+磷酸緩沖液+底物）吸光度；A3為空白反應(yīng)組（磷酸緩沖液+酶+底物）吸光度；A0為空白對(duì)照組（磷酸緩沖液+磷酸緩沖液+底物）吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均平行測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 25.0、Jupyter Notebook軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用GraphPad Prism 9和Origin 2022軟件繪圖。磷酸化前后裙帶菜多糖自由基清除能力和降血糖活性用方差分析（analysis of variance，ANOVA）和S-N-K（Student-Newman-Keuls）多重比較進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），采用熵值法計(jì)算磷酸化前后裙帶菜多糖對(duì)自由基清除能力的綜合評(píng)價(jià)值[3]，并用ANOVA和S-N-K多重比較進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 裙帶菜多糖的分離純化

由圖1A可知，從20 g裙帶菜中得到UPP約2.53 g，提取率為12.65%。UPP經(jīng)DEAE-Cellulose 52型陰離子交換樹脂分別用蒸餾水、NaCl溶液洗脫分離后，得到1 個(gè)多糖組分（UPP1），產(chǎn)率為21.20%，為0.05 mol/L NaCl溶液洗脫組分。UPP1再經(jīng)Sephadex G-100凝膠層析柱進(jìn)一步純化，呈現(xiàn)單個(gè)對(duì)稱的洗脫峰，記為組分UPP1a（圖1B），其產(chǎn)率為55.91%。

圖1 UPP的DEAE-52柱層析洗脫圖（A）和UPP1組分的Sephadex G-100柱層析洗脫圖（B）Fig.1 Elution curve of UPP on DEAE-52 anion-exchange column (A),and elution curve of UPP1 on Sephadex G-100 column (B)

2.2 UPP1a的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 取代度及紫外光譜

采用磷酸鹽法對(duì)UPP1a進(jìn)行磷酸化修飾，得到裙帶菜多糖磷酸根的取代度為9.26。由圖2可知，UPP1a及UPP1a-P在260、280 nm波長(zhǎng)處均無明顯吸收峰，說明磷酸化修飾前后的裙帶菜多糖的核酸和蛋白質(zhì)含量均相對(duì)較低。裙帶菜多糖經(jīng)磷酸化修飾后形成了化學(xué)鍵束縛，導(dǎo)致修飾后裙帶菜多糖紫外吸收強(qiáng)度有所減弱，峰值降低。

圖2 UPP1a和UPP1a-P的紫外掃描圖譜Fig.2 UV absorption spectra of UPP1a and UPP1a-P

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

由表1和圖3可知，裙帶菜多糖修飾前后主體結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變，UPP1a-P和UPP1a在3 670～3 220、3 000～2 800、1 700～1 400、1 200～1 000 cm-1均顯示出多糖的特征吸收峰[26]；與UPP1a相比，UPP1a-P分別在1 216、886 cm-1出現(xiàn)P＝O、P—O—C鍵的吸收峰[27]，均提示存在磷酸基團(tuán)，說明多糖磷酸化修飾成功。

表1 UPP1a和UPP1a-P官能團(tuán)的傅里葉變換紅外光譜分析Table 1 FTIR analysis of functional groups in UPP1a and UPP1a-P

圖3 UPP1a和UPP1a-P的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of UPP1a and UPP1a-P

UPP1a-P在1 094 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是吡喃環(huán)的醚鍵和羥基的共振吸收峰，由C—O—C不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起[28]，890 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰由C—H的變角振動(dòng)引起，是吡喃葡聚糖和β-型糖苷鍵連接的特征吸收峰[29-30]，771 cm-1為吡喃糖對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)[31]，在N—H的變角振動(dòng)范圍內(nèi)有1 643 cm-1吸收峰，為蛋白質(zhì)吸收峰，說明磷酸化修飾后的裙帶菜多糖UPP1a-P是一種由β-糖苷鍵連接的吡喃型葡聚糖。

2.2.3 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

通過MALDI-TOF-MS可知，UPP1a和UPP1a-P的相對(duì)分子質(zhì)量均分布在5×103～8×104。其中，UPP1a的最大相對(duì)分子質(zhì)量為77.3×103，修飾后的UPP1a-P相對(duì)分子質(zhì)量增大，在5×103～1.8×104區(qū)間峰較明顯，最大相對(duì)分子質(zhì)量為94.4×103。

2.2.4 高碘酸氧化和Smith降解法分析

通過高碘酸氧化實(shí)驗(yàn)，在223 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，得到高碘酸消耗量標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝10.568 0x-0.001 1（R2＝0.999 1）。UPP1a-P能被高碘酸氧化，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到144 h時(shí)，吸光度趨于平穩(wěn)，反應(yīng)結(jié)束（圖4）。UPP1a-P經(jīng)高碘酸氧化后，平均每摩爾糖殘基消耗高碘酸0.507 mmol，并生成0.002 mmol甲酸。此過程中，高碘酸氧化產(chǎn)生了少量甲酸，說明UPP1a-P中存在1→6糖苷鍵。高碘酸消耗量大于甲酸生成量的2 倍，說明UPP1a-P結(jié)構(gòu)中存在只消耗高碘酸而不生成甲酸的1→2,1→4糖苷鍵，還存在既不消耗高碘酸也不產(chǎn)生甲酸的1→3糖苷鍵。

圖4 UPP1a-P的高碘酸氧化反應(yīng)曲線Fig.4 Curve of periodic acid in oxidation of UPP1a-P

UPP1a-P經(jīng)Smith降解后，檢測(cè)出甘油、木糖、乙二醇和半乳糖（表2），說明UPP1a-P的多糖組分中存在1→6、1→2,1→4型糖苷鍵[32]。進(jìn)一步結(jié)合高碘酸氧化實(shí)驗(yàn)可知，UPP1a-P的主要連接方式為1→2、1→3、1→4和1→6，即UPP1a-P結(jié)構(gòu)中存在0.504 mmol的1→2,1→4糖苷鍵、0.002 mmol的1→6糖苷鍵和0.494 mmol的1→3糖苷鍵。

表2 UPP1a-P的Smith降解產(chǎn)物GC分析結(jié)果Table 2 GC analysis results of Smith degradation products of UPP1a-P

2.2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn)分析

由圖5可知，隨著NaOH濃度不斷增大，UPP1a和UPP1a-P的最大吸收波長(zhǎng)均顯著大于剛果紅。其中，UPP1a在0～0.5 mol/L濃度范圍內(nèi)最大吸收波長(zhǎng)沒有明顯下降趨勢(shì)，說明NaOH對(duì)UPP1a的結(jié)構(gòu)未造成破壞，不存在三股螺旋結(jié)構(gòu)。UPP1a-P在NaOH濃度為0.0～0.5 mol/L時(shí)最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，說明UPP1a-P分子間作用力發(fā)生變化，具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖5 不同NaOH濃度下UPP1a-P、UPP1a和剛果紅紫外-可見光最大吸收波長(zhǎng)變化Fig.5 Changes in maximum absorption wavelengths of UPP1a-P+Congo red,UPP1a+Congo red and Congo red at different NaOH concentrations

2.2.6β-消去反應(yīng)分析

由圖6可知，經(jīng)NaOH處理后的UPP1a-P在240 nm波長(zhǎng)處吸光度明顯增大，表明UPP1a-P中含有—O—型糖肽鍵。

圖6 UPP1a-P經(jīng)NaOH作用前后的紫外吸收光譜Fig.6 UV absorption spectrum of UPP1a-P

2.2.7 碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)分析

由圖7可知，UPP1a-P與KI-I2反應(yīng)物的最大吸收峰在300 nm附近，而在565 nm波長(zhǎng)處無最大吸收，說明UPP1a-P具有較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支。

圖7 UPP1a-P與碘-碘化鉀反應(yīng)的紫外吸收光譜Fig.7 UV absorption spectrum of UPP1a-P after reaction with KI-I2

2.3 UPP1a的生物活性分析

2.3.1 自由基清除能力

由圖8和表3可知，UPP1a-P和UPP1a對(duì)DPPH自由基、·和·OH的清除作用均隨質(zhì)量濃度的增加而增加，磷酸化后的裙帶菜多糖自由基清除能力顯著高于磷酸化前（P＜0.05），具體表現(xiàn)為：在0～5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，UPP1a-P對(duì)3 種自由基清除率的IC50均顯著低于UPP1a。其中，UPP1a-P對(duì)3 種自由基清除率的IC50分別為（1.19±0.43）、（2.24±1.63）、（1.11±0.13）mg/mL，UPP1a分別為（118.00±0.74）、（5.14±0.62）、（335.60±0.39）mg/mL（P＜0.05）。在5 mg/mL質(zhì)量濃度下，與UPP1a相比，UPP1a-P對(duì)DPPH自由基、·和·OH的清除率顯著提高34.76%、12.30%、76.05%。

表3 UPP1a-P和UPP1a對(duì)DPPH自由基、·、·OH和α-葡萄糖苷酶的IC50及自由基清除能力綜合評(píng)價(jià)值Table 3 IC50 and comprehensive evaluation values for free radical scavenging activity and α-glucosidase inhibitory activity of UPP1a-P and UPP1a

表3 UPP1a-P和UPP1a對(duì)DPPH自由基、·、·OH和α-葡萄糖苷酶的IC50及自由基清除能力綜合評(píng)價(jià)值Table 3 IC50 and comprehensive evaluation values for free radical scavenging activity and α-glucosidase inhibitory activity of UPP1a-P and UPP1a

注：同行小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

圖8 UPP1a-P和UPP1a的自由基清除能力Fig.8 Radical scavenging capacity of UPP1a-P and UPP1a

2.3.2 降血糖活性

由圖9和表3可知，UPP1a-P和UPP1a對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用均隨質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，UPP1a-P和UPP1a對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為95.40%、91.70%，UPP1a-P較UPP1a抑制率提高3.70%；在0～20 mg/mL，UPP1a-P對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50顯著低于UPP1a（P＜0.05），分別為（0.07±0.05）、（2.31±0.60）mg/mL，表明磷酸化修飾可以增強(qiáng)裙帶菜多糖的降血糖活性。

圖9 UPP1a-P和UPP1a對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of UPP1a-P和UPP1a on α-glucosidase

2.3.3 自由基清除能力與降血糖活性相關(guān)性分析

將自由基清除能力綜合評(píng)價(jià)值及其各自由基清除能力分別與降血糖活性進(jìn)行相關(guān)性分析，由圖10、11可知，磷酸化修飾前后裙帶菜多糖對(duì)自由基的清除能力與其降血糖活性間存在高度顯著正相關(guān)（P＜0.001），其中，DPPH自由基、·的清除作用顯著影響降血糖活性（P＜0.05），但·OH的清除作用與降血糖活性間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

圖10 自由基清除能力綜合評(píng)價(jià)值與降血糖活性的相關(guān)性分析Fig.10 Correlation analysis between comprehensive evaluation values of free radical scavenging capacity and hypoglycemic activity

圖11 各自由基清除能力與降血糖活性的相關(guān)性熱圖Fig.11 Heatmap of correlation between free radical scavenging capacity and hypoglycemic activity

3 討論

與程浩[33]對(duì)磷酸化修飾顯著提升·OH清除能力、降低·清除能力的研究結(jié)果不同，磷酸化修飾均顯著增強(qiáng)裙帶菜多糖DPPH自由基、·、·OH的清除能力；與金明枝[34]對(duì)磷酸化修飾顯著降低大球蓋菇多糖降血糖活性的研究結(jié)果不同，磷酸化修飾后的裙帶菜多糖降血糖活性顯著高于修飾前，說明磷酸化修飾適用于改善裙帶菜多糖生物活性。同時(shí)，降血糖活性與自由基清除能力間存在一定相關(guān)性，王秋丹等[35]研究表明，DPPH自由基、·OH的清除能力可顯著影響葛根多糖的降血糖活性，但裙帶菜多糖的降血糖活性與DPPH自由基、·的清除作用具有顯著相關(guān)性，與·OH清除能力無顯著相關(guān)性，分析原因可能與裙帶菜多糖對(duì)·和DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)、·OH清除能力相對(duì)較弱有關(guān)（表3）[36-37]。

磷酸化修飾后裙帶菜多糖活性的增強(qiáng)可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。多糖最佳生物活性的發(fā)揮有賴于其相對(duì)分子質(zhì)量的大小[38]，與邵淑宏[39]對(duì)烏龍茶多糖的研究一致，相對(duì)分子質(zhì)量較大的UPP1a-P具有更高的自由基清除能力和降血糖作用，這可能是由于相對(duì)分子質(zhì)量較低時(shí)，多糖上所帶的活性基團(tuán)太少而無法形成有效的活性空間結(jié)構(gòu)，多糖生物活性相對(duì)較弱[40]。三股螺旋結(jié)構(gòu)是多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)中最具活性的空間構(gòu)型[41]，與王夢(mèng)繞[42]對(duì)修飾前后羅漢果多糖三股螺旋結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變結(jié)果不一致，引入磷酸基團(tuán)后，裙帶菜多糖出現(xiàn)三股螺旋結(jié)構(gòu)，使多糖能夠與三股螺旋結(jié)構(gòu)中的1→3糖苷鍵結(jié)合，提高其自由基清除能力和降血糖活性。此外，UPP1a-P具有較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支結(jié)構(gòu)，且單糖之間的連接方式主要為1→3、1→2,1→4、1→6型糖苷鍵。劉袆帆[43]、商婷婷[44]等研究表明，分支較多、支鏈較長(zhǎng)的多糖生物活性高，同時(shí)，多糖以1→3、1→4、1→6糖苷鍵連接時(shí)具有更高的自由基清除能力和降血糖能力[45-46]。

4 結(jié)論

裙帶菜多糖經(jīng)磷酸化修飾后出現(xiàn)磷酸基團(tuán)的特征吸收峰，修飾后裙帶菜多糖的最大相對(duì)分子質(zhì)量為94.4×103，具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，是一種由β-糖苷鍵連接的吡喃型葡聚糖。其中，多糖與氨基酸主要通過—O—型糖肽鍵相連，單糖之間主要由0.494 mmol的1→3型、0.504 mmol的1→2,1→4型和0.002 mmol的1→6型糖苷鍵連接，且具有分支結(jié)構(gòu)。磷酸化修飾前后的裙帶菜多糖均具有一定的自由基清除能力及降血糖活性，其中，UPP1a-P對(duì)DPPH自由基、·和·OH的清除率及α-葡萄糖苷酶的抑制率均顯著強(qiáng)于裙帶菜多糖，表現(xiàn)出更優(yōu)的自由基清除能力和降血糖活性。此外，自由基的清除能力與降血糖活性間顯著正相關(guān)，且DPPH自由基和·是影響裙帶菜多糖降血糖活性的主要因素。裙帶菜多糖經(jīng)磷酸化修飾后，化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，生物活性顯著增強(qiáng)，可考慮采用磷酸化修飾方法制備具有自由基清除能力和降血糖活性的裙帶菜多糖，具有廣闊的應(yīng)用前景，但磷酸化修飾裙帶菜多糖的構(gòu)效關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。