江曉倩 張玉琴 滕海英

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院,福建省福州市 350003; 2 福建中醫(yī)藥大學(xué)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變、滑膜炎癥反應(yīng)、關(guān)節(jié)間室變窄和關(guān)節(jié)繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病理特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病,是臨床常見的骨科疾病之一。KOA好發(fā)于40歲以上中老年人[1],隨著我國進(jìn)入老齡化社會,KOA的發(fā)病人數(shù)也在與日俱增,總患病人數(shù)可高達(dá)3 000萬[2]。KOA在中醫(yī)學(xué)屬“痹證”“痿證”等范疇,國家中醫(yī)藥管理局將其命名為“膝痹”[3]。中醫(yī)痹病理論始于《內(nèi)經(jīng)》,《素問·痹論》首次提出骨痹、筋痹、脈痹的概念,中醫(yī)理論將其病因病機(jī)概括為肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)、氣血不足、風(fēng)寒濕邪痹阻所致,具有本虛標(biāo)實的特點[4]。

中藥外敷法是中醫(yī)骨傷科臨床治療膝骨關(guān)節(jié)炎診療指南中推薦的藥物療法之一,具有不良反應(yīng)小、減輕關(guān)節(jié)疼痛效果明顯等優(yōu)勢。目前臨床常用的外敷方功效多以活血化瘀、通絡(luò)止痛為主,將藥劑貼敷于患處或穴位肌膚具有增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活力、促進(jìn)其增殖、抑制炎癥和組織水腫、降低骨內(nèi)壓、緩解疼痛等作用[5]。“鹽敷方”為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院外用經(jīng)驗方,其主藥成分有:乳香、沒藥、制吳茱萸、丁香、紫蘇子、炒萊菔子、大青鹽。本方具有活血行氣、祛寒止痹、通絡(luò)止痛的功效,與大青鹽合用可引藥入腎,攜藥滲透入里,從而增強(qiáng)藥效,在臨床上取得了較好的療效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展為探究中藥方劑的活性成分和潛在作用機(jī)制提供了一種新思路。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的分子作用機(jī)制進(jìn)行探討,為后期鹽敷方作用機(jī)制的研究提供了理論參考。

1 方法

1.1 鹽敷方有效成分收集及藥物靶點預(yù)測 以乳香、沒藥、制吳茱萸、丁香、紫蘇子、炒萊菔子作為檢索詞在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫[6](https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索,獲得這6味中藥的化學(xué)成分信息,將篩選條件設(shè)置為生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL值)≥0.18[7],篩選出鹽敷方中符合條件的活性成分。再通過Uniprot(https://www.Uniprot. org/) 數(shù)據(jù)庫[8]對搜集的六味中藥活性成分所對應(yīng)的靶點進(jìn)行名稱校正。

1.2 構(gòu)建膝骨關(guān)節(jié)炎—靶點基因預(yù)測 在Disgenet(https://www.disgenet.org)[9]與Drugbank(https://go.drugbank.com)數(shù)據(jù)庫[10]中以“knee osteoarthritis” “osteoarthritis,knee”為關(guān)鍵詞,種屬選擇“Homo sapiens”篩選與疾病相關(guān)的靶點,將兩數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果合并去重,獲得疾病靶點基因。

1.3 獲取交集基因及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

1.3.1 構(gòu)建鹽敷方成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖。運用cytoscape3.10.0軟件導(dǎo)入鹽敷方中各組分的化學(xué)成分及所對應(yīng)的靶點基因,構(gòu)建鹽敷方成分—靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3.2 構(gòu)建鹽敷方—膝骨關(guān)節(jié)炎共同靶點網(wǎng)絡(luò)。將鹽敷方活性成分作用靶點和膝骨關(guān)節(jié)炎靶點基因取交集,獲得鹽敷方與膝骨關(guān)節(jié)炎的共同靶點。

1.4 構(gòu)建蛋白相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(PPI) 將獲得的共同靶點導(dǎo)入 String 數(shù)據(jù)庫[11](https://string-db.org),物種設(shè)定為“Homo sapiens”,其他篩選條件選擇默認(rèn)參數(shù),從而構(gòu)建鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎共同靶點蛋白可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO富集分析及KEGG富集分析 將“鹽敷方—膝骨關(guān)節(jié)炎”中共同靶點導(dǎo)入到 Metascape(https://metascape.org)[12]中進(jìn)行通路富集分析。在Metascape的基因面板中粘貼基因列表,將物種限定設(shè)置為人類(Homo sapiens),后進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。富集條件設(shè)置為P<0.01,重疊值(Overlap)≥3,富集值(Enrichment)≥1.5。GO分析的過程主要包括三個方面:生物過程分析(BP)、細(xì)胞成分分析(CC)、分子功能分析(MF)。最后利用微生信網(wǎng)站對結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 鹽敷方的成分及作用靶點 運用TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出鹽敷方組方的94個活性成分,其中乳香6個,沒藥34個,紫蘇子14個,吳茱萸32個,丁香6個,萊菔子2個,剔除重復(fù)項后獲得86個活性成分。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫對TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出的鹽敷方組方中活性成分所對應(yīng)的作用靶點進(jìn)行名稱校正后,共獲得255個活性成分作用靶點。

2.2 膝骨關(guān)節(jié)炎的作用靶點 通過檢索Disgenet與Drugbank數(shù)據(jù)庫,以“knee osteoarthritis”“osteoarthritis,knee”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,兩個數(shù)據(jù)庫所得的靶點信息整合、去重后,總共獲得415個疾病靶點。

2.3 構(gòu)建鹽敷方活性成分—膝骨關(guān)節(jié)炎共同靶點網(wǎng)絡(luò) 將鹽敷方活性成分作用靶點和膝骨關(guān)節(jié)炎靶點基因取交集,篩選出鹽敷方與膝骨關(guān)節(jié)炎的共同靶點51個,這些靶點為鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點。這51個靶點對應(yīng)的鹽敷方活性成分共有54個,導(dǎo)入cytoscape3.10.0軟件,構(gòu)建“鹽敷方活性成分—共同靶點網(wǎng)絡(luò)圖”,見圖1。

圖1 鹽敷方活性成分—共同靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過String數(shù)據(jù)庫在線構(gòu)建的鹽敷方活性成分和膝骨關(guān)節(jié)炎共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)包含51個節(jié)點和608條線將這些節(jié)點相連接,見圖2。將這51個共同靶點按照自由度(degree)值進(jìn)行排序,排名前十的靶點為TNF、IL-6、IL-1β、ALB、PTGS2、CCL2、MMP9、TP53、HIF1A、IL-10,其中TNF、IL-6的自由度值最高,均為45。表明這些靶點為鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點,可能在鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮核心作用。

圖2 鹽敷方—膝骨關(guān)節(jié)炎共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO與KEGG 富集分析

2.5.1 GO富集分析。GO功能富集分析共涉及882條生物過程、26種細(xì)胞組分、78個分子功能,根據(jù)基因富集程度進(jìn)行排序,列舉排名前十位的功能,并繪制三合一氣泡圖,詳見圖3。結(jié)果顯示:(1)鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎的生物過程通路(BP)主要富集于炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)(regulation of inflammatory response)、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)(cellular response to lipid)、細(xì)胞運動的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of cell motility)等。(2)細(xì)胞成分分析(CC)主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、血小板顆粒腔(platelet alpha granule lumen)、血小板α顆粒(platelet alpha granule)等細(xì)胞成分。(3)分子功能分析(MF)主要涉及細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、信號受體調(diào)節(jié)活性(signaling receptor regulator activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)等分子功能。

圖3 鹽敷方—膝骨關(guān)節(jié)炎共同靶點GO富集分析圖

2.5.2 KEGG富集分析。KEGG 通路富集分析共獲得119個條目,對富集基因最多的前20條信號通路進(jìn)行可視化,見圖4。與膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的KEGG通路主要涉及:IL-17(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子(TNF signaling pathway)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、核因子κB(NF-kappa B signaling pathway)等信號通路。

圖4 鹽敷方—膝骨關(guān)節(jié)炎共同靶點 KEGG通路富集分析圖

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)軟骨退行性病變,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。其病理特征隨病程變化,所受累組織不同而呈現(xiàn)出多方面的改變,包括軟骨下骨增生硬化、關(guān)節(jié)軟骨退變、骨贅形成、滑膜增厚等[13]。當(dāng)前研究顯示KOA的發(fā)病機(jī)制尚不明確,其病機(jī)主要包括軟骨退變、軟骨下骨代謝異常、滑膜炎癥等[14]?！胞}敷方”熱敷外用可起到擴(kuò)張血管、改善局部血液循環(huán)、消除炎癥、改善關(guān)節(jié)功能、減輕疼痛的作用,具有療效確切、不良反應(yīng)少、可用于長期治療等優(yōu)點。但由于缺乏動物實驗數(shù)據(jù)支持及其作用機(jī)制尚未明確,使得其難以廣泛推廣運用于臨床。

文章采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法,對“鹽敷方”進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫層面的機(jī)制探究。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可知,TNF、IL-6、IL-1β、ALB、PTGS2、CCL2、MMP9、TP53、HIF1A、IL-10等為關(guān)鍵靶點基因。患者血清及滑膜組織中的腫瘤壞死因子TNF、白細(xì)胞介素因子IL-6、IL-1β是評價藥物治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效的重要指標(biāo)。研究表明,TNF、IL-6、IL-1β、IL-10可激活機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),是參與KOA病程發(fā)展的關(guān)鍵炎癥因子[15-16]。TNF可影響軟骨細(xì)胞的生成與凋亡,可分解代謝軟骨組織,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞[17]。 IL-1β不僅可以獨立誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎性損傷[18],還可刺激COX-2、iNOS等的產(chǎn)生,激活炎癥途徑從而誘導(dǎo)炎癥性疼痛[19]。IL-6可加快生成IL-1β,破壞軟骨組織中TIPM和MMPs的平衡,使細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)失衡,從而破壞關(guān)節(jié)軟骨[20]。環(huán)氧合酶PTGS2亦是炎癥反應(yīng)重要靶點,通過將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為 PGH2 從而誘導(dǎo)炎癥[21]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)可通過降解軟骨基質(zhì)中的膠原蛋白和蛋白多糖等成分,而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死,從而導(dǎo)致加重炎癥反應(yīng)[22]。由此推測,鹽敷方可通過調(diào)控炎癥因子、誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的生成與凋亡等途徑,改善膝骨關(guān)節(jié)炎。

GO分析發(fā)現(xiàn),鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎主要涉及炎癥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)等生物過程?；ぱ装Y是膝骨關(guān)節(jié)炎重要病理表現(xiàn)之一,鹽敷方可通過參與炎癥反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié),改善滑膜組織炎癥。在KOA的早期階段,就可以觀察到脂質(zhì)沉積在關(guān)節(jié)腔內(nèi)[23]。研究表明,脂質(zhì)與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)。棕櫚酸可通過TLR4-ERK1/2-c-Jun信號通路增加軟骨細(xì)胞中IL-26的表達(dá),促進(jìn)炎癥反應(yīng)[24]。抵抗素可通過MEK/ERK信號通路,促進(jìn)關(guān)節(jié)滑液中IL-1β和TNF-α的表達(dá),激活炎癥反應(yīng)[25]。

KEGG富集通路分析結(jié)果顯示,鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎主要涉及IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎信號通路、核因子κB信號通路等。IL-17、TNF、NF-κB信號通路都是與KOA病程發(fā)展密切相關(guān)的炎癥信號通路。研究表明,IL-17信號通路可通過誘導(dǎo)釋放炎癥因子,提升中性粒細(xì)胞的趨化能力,降低相關(guān)酶的活性,引起炎癥反應(yīng)的加劇和關(guān)節(jié)軟骨的破壞[26-27]。同時,IL-17信號通路能夠異常激活NF-κB途徑中的炎癥因子,調(diào)控促炎性細(xì)胞因子TNF、IL-6、IL-1β等的表達(dá),增強(qiáng)炎癥反應(yīng),加重關(guān)節(jié)軟骨的損傷[28-30]。TNF信號通路中的TNF-α不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥,同時可以激活NF-κB信號通路,誘導(dǎo)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶MMP,從而加速軟骨的破壞[31]。由此推測,鹽敷方可通過調(diào)控多條炎癥信號通路從而治療膝骨關(guān)節(jié)炎。

綜上所述,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法可得鹽敷方治療膝骨關(guān)節(jié)炎具有多靶點、多途徑的特點,可通過下調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)、減慢軟骨降解退變來延緩KOA的發(fā)展。文章對鹽敷方作用機(jī)制進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫水平的分析,為后續(xù)研究奠定了堅實的理論基礎(chǔ),接下來我們將對鹽敷方如何調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)及其更深層次的抗炎機(jī)制進(jìn)行實驗研究。