鄧菊慶，于 璐，廖麗瓊，楊忠存

（昆明市第一人民醫(yī)院病理科，云南 昆明 650011）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）目前是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在2020 年世界癌癥報(bào)告數(shù)據(jù)中顯示，新發(fā)的結(jié)直腸癌病例數(shù)位居第二，死亡人數(shù)位居第五[1]。在我國(guó)，大部分結(jié)直腸癌確診時(shí)多為中晚期，5 a 生存率不足50%。因此，結(jié)直腸癌早期診斷率的提高顯得尤為重要。結(jié)直腸癌的主要發(fā)生途徑為腺瘤癌變途徑，傳統(tǒng)腺瘤癌變途徑導(dǎo)致70%～90%的結(jié)直腸癌，鋸齒狀新生物導(dǎo)致10%～20%的結(jié)直腸癌[2]。目前主要篩查方法為腸鏡、血清癌胚抗原檢測(cè)、糞便潛血實(shí)驗(yàn)及近年來(lái)逐步開(kāi)展使用的mSEPT9 檢測(cè)、多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA 檢測(cè)等。上述方法各有優(yōu)勢(shì)及不足，特別是對(duì)于結(jié)直腸癌發(fā)生的早期病變-結(jié)直腸腺瘤的檢測(cè)敏感性及特異性差異較大。而結(jié)直腸癌的發(fā)生途徑主要為腺瘤癌變而來(lái)，因此，如能通過(guò)提高對(duì)結(jié)直腸腺瘤早期診斷率從而進(jìn)行無(wú)創(chuàng)-有創(chuàng)的分層遞進(jìn)檢查，不僅結(jié)直腸癌的早期診斷率能顯著提高，也易于在健康人群中進(jìn)行推廣篩查，從而可以顯著提高結(jié)直腸癌篩查的可操作性。筆者通過(guò)對(duì)結(jié)直腸腺瘤實(shí)驗(yàn)組（包括低、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變）和對(duì)照組（腸鏡檢查陰性）外周血mSEPT9 檢測(cè)結(jié)果分析并探討其在結(jié)直腸腺瘤發(fā)生中的預(yù)測(cè)意義，并將其與外周血CEA 結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以期獲得結(jié)直腸腺瘤早期診斷中最優(yōu)化的篩查方案，并對(duì)是否進(jìn)行侵入性腸鏡做一定程度的分流作用，減少患者因行侵入性腸鏡檢查并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)及增加結(jié)直腸腺瘤篩查的可操作性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年10 月至2022 年5 月期間在昆明市第一人民醫(yī)院病理科行結(jié)腸鏡檢查鏡下取材送檢診斷為大腸腺瘤的30 名患者作為實(shí)驗(yàn)組研究對(duì)象，將22 例腸鏡檢查結(jié)果陰性受試者作為對(duì)照組研究對(duì)象。該研究中受試者均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)通過(guò)，倫理批件號(hào)：YLS-53。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）實(shí)驗(yàn)組：受試者均經(jīng)腸鏡及組織活檢病理診斷，依據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]確診為結(jié)直腸腺瘤，含25 例低級(jí)別腺瘤（包含管狀腺瘤伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、絨毛狀-管狀腺瘤伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；5 例高級(jí)別腺瘤（包含絨毛狀-管狀腺瘤伴高級(jí)上皮內(nèi)瘤變、管狀腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、鋸齒狀腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變）；（2）對(duì)照組：經(jīng)結(jié)直腸鏡檢測(cè)無(wú)結(jié)直腸腺瘤受試者。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）受試者存在全身感染性疾病、精神疾病，以及其他嚴(yán)重器質(zhì)性病變；（2）女性受試者處于妊娠狀態(tài)；（3）受試者年齡大于75 歲。

1.1.3 觀測(cè)指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組受試者均檢測(cè)有外周血外周血mSEPT9 及CEA 血清濃度。

1.2 研究方法

本檢測(cè)是運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 平臺(tái)，采用甲基化特異性引物和Taqman 特異性熒光檢測(cè)技術(shù)，偏向擴(kuò)增和檢測(cè)甲基化片段。利用重亞硫酸鹽處理DNA 可將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，而甲基化特異性引物特異識(shí)別甲基化片段，并偏向擴(kuò)增甲基化模板，利用Taqman 探針特異性識(shí)別甲基化片段，以鑒別甲基化片段的存在。另外通過(guò)Blocker 與非甲基化片段的結(jié)合，抑制高濃度野生型DNA 可能存在的翹尾現(xiàn)象。本試劑盒選擇Sep 和內(nèi)參基因ACTB 同時(shí)擴(kuò)增的雙重PCR 受控體系，通過(guò)陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品與樣本平行提取、硫化純化、PCR 檢測(cè)，可對(duì)樣本的檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控。

標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程：（1）含EDTA 抗凝劑的采血管進(jìn)行采血5 mL、溫度為2～8 ℃保存；（2）血漿游離DNA 提取：采用磁珠法進(jìn)行血漿游離DNA的提?。虎貲NA 硫化修飾和純化：采用硫化試劑進(jìn)行血漿游離DNA 的硫化修飾后，利用純化試劑對(duì)硫化后的產(chǎn)物進(jìn)行純化，作為mSEPT9 檢測(cè)的模板；②血漿樣品中SEP9 甲基化檢測(cè)（熒光PCR 法）；③分析PCR 結(jié)果：FAM CP ≤ 47.93，有擴(kuò)增信號(hào)，且呈 S 型擴(kuò)增曲線趨勢(shì)，并且 VIC CP≤40.21 則結(jié)果為陽(yáng)性；FAM CP >47.93，并且VIC CP≤40.21 則結(jié)果為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 及GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。使用受試者特征曲線（ROC）進(jìn)行外周血mSEPT9檢測(cè)結(jié)果及外周血CEA 結(jié)果對(duì)特異性及敏感性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Fisher 精確檢驗(yàn)對(duì)mSEPT9 結(jié)果與腺瘤級(jí)別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者基本信息

實(shí)驗(yàn)組（腺瘤組30 例）：（1）低級(jí)別腺瘤組25 例：絨毛狀-管狀腺瘤伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變7 例，男性6 例，其中mSEPT9 陽(yáng)性5 例，平均年齡（51.80±13.85）歲；陰性1 例：69 歲；女性1 例：mSEPT9 陰性；管狀腺瘤伴低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變18 例：男性9 例，其中mSEPT9 陽(yáng)性4 例，平均年齡（53.00±5.35）歲；陰性5 例：平均年齡（50.80±22.65）歲；女性9 例：其中mSEPT9 陽(yáng)性7 例，平均年齡（59.43±10.75）歲；陰性2 例，平均年齡（66.50±6.36）歲。（2）高級(jí)別腺瘤組：5 例：絨毛狀-管狀腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變2 例：男性1 例，mSEPT9 陰 性，72 歲；女 性1 例，mSEPT9 陽(yáng)性，49 歲，管狀腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變2 人：男性1 例mSEPT9 陰性，67 歲；其中，女性，1 例，mSEPT9 陽(yáng)性，73 歲；鋸齒狀腺瘤伴高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，女性1 例，mSEPT9 陽(yáng)性，49 歲。對(duì)照組：男性7 例，女性15 例，平均年齡（47.77±12.01）歲。

2.2 CEA 血清濃度

實(shí)驗(yàn)組2 例大于3.4 ng/mL，分別為5.44及8.88 ng/mL；對(duì)照組：CEA 血清濃度均小于3.4 ng/mL。

2.3 結(jié)直腸低、高級(jí)別腺瘤的病理形態(tài)

低級(jí)別管狀腺瘤及絨毛狀管狀腺瘤共計(jì)25 例，高級(jí)別絨毛管狀及鋸齒狀腺瘤共計(jì)5 例，其病理形態(tài)見(jiàn)圖1：低級(jí)別管狀腺瘤：見(jiàn)增生的腺管，腺上皮細(xì)胞核柱狀，排列緊密；低級(jí)別絨毛狀管狀腺瘤：見(jiàn)增生的腺體，呈乳頭狀及腺管狀，腺上皮細(xì)胞核柱狀，排列緊密；高級(jí)別絨毛狀腺瘤：見(jiàn)增生的乳頭狀結(jié)構(gòu)，腺體上皮細(xì)胞核卵圓形、圓形，有異型，核分裂像可見(jiàn)；鋸齒狀腺瘤：見(jiàn)增生的腺體呈鋸齒狀，腺上皮細(xì)胞核圓形、卵圓形，有異型，可見(jiàn)核分裂。對(duì)照組為腸鏡陰性門(mén)診患者，因此無(wú)病理形態(tài)圖。圖1 所顯示的病理形態(tài)圖是本次研究實(shí)驗(yàn)組入組對(duì)象的病理形態(tài)圖，代表了入實(shí)驗(yàn)組研究對(duì)象的主要鏡下結(jié)構(gòu)。

圖1 結(jié)直腸低、高級(jí)別腺瘤的HE 病理形態(tài)（×20）Fig.1 Pathological morphology of colorectal low-and high-grade adenoma by HE staining（×20）

2.4 外周血mSEPT9 檢測(cè)比CEA 檢測(cè)有更高的敏感度、特異度的預(yù)測(cè)價(jià)值

外周血mSEPT9 檢測(cè)，受試者特征曲線顯示：曲線下面積為0.720 5，P=0.007 0，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，利用約登指數(shù)計(jì)算其分界值（Cut-off 值）即CT 值是39.55，對(duì)應(yīng)的敏感度為90.91%，特異度為56.67%；外周血CEA 血清濃度檢測(cè)受試者特征曲線顯示：曲線下面積為0.533，P=0.683 7，見(jiàn)圖2。

圖2 外周血mSEPT9 檢測(cè)結(jié)果與CEA 血清濃度的ROC 曲線比較Fig.2 The ROC comparison between the detection of mSEPT9 and CEA in peripheral blood

2.5 低、高級(jí)別腺瘤組mSEPT9 檢測(cè)結(jié)果

在本研究中腺瘤高級(jí)別受試者有5 例，陽(yáng)性3 例，陰性2 例，陽(yáng)性率60%，腺瘤低級(jí)別受試者有25 例，陽(yáng)性17 例，陰性8 例，陽(yáng)性率68.00%，將2 組腺瘤對(duì)應(yīng)的mSEPT9 陽(yáng)性例數(shù)進(jìn)行Fisher 精確檢驗(yàn)（P>0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 低、高級(jí)別腺瘤組mSEPT9 陽(yáng)性數(shù)的比較Fig.3 Comparison of mSEPT9 positivity in the low-and high-grade adenoma groups

3 討論

Septin 是一類(lèi)具有鳥(niǎo)苷三磷酸活性的保守基因家族，廣泛存在于生物中，其中Septin9 基因是Septin 基因家族的一員，位于人類(lèi)染色體17q25.3，是一種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，參與許多生物過(guò)程，如細(xì)胞分裂、胞膜重建、極化、囊泡運(yùn)輸、脫氧核糖核酸修復(fù)、細(xì)胞遷移及凋亡[4]，與人類(lèi)很多疾病尤其是腫瘤相關(guān)，在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前，已有多項(xiàng)研究通過(guò)檢測(cè)受檢者外周血游離Septin9 異常甲基化發(fā)生情況，從而判斷受檢者患結(jié)直腸癌的可能性，但其作為預(yù)測(cè)早期結(jié)直腸癌報(bào)道的敏感性及特異性卻各不相同[5-7]。

3.1 SEP9 基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤中的敏感性及特異性

WARREN JD、CHURCH TR 等[8-9]研究顯示，血漿mSEPT9 在結(jié)直腸腺瘤/息肉組中的陽(yáng)性檢出率（11.5% 和 11.2%）與對(duì)照組（10.0% 和 9.1%）相比，（P>0.05），提示血漿mSEPT9 及血清 CEA對(duì)結(jié)直腸良性腫瘤（如腺瘤與息肉）的檢出率不高，這與筆者的研究結(jié)果不一致。本研究顯示外周血mSEPT9 檢測(cè)顯示ROC 曲線下面積為0.720 5，P值為0.007 0（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。敏感度為90.91%，特異度為56.67%（0.900 0 >0.720 5>0.700 0），說(shuō)明其敏感性高、特異性相對(duì)較好，這與吳東等[10]研究結(jié)果顯示的診斷進(jìn)展期腺瘤的敏感度為67.6%，特異度為47.4%相似。說(shuō)明mSEP9 檢測(cè)可以用于結(jié)直腸腺瘤篩查，并且因?yàn)槠錂z測(cè)方法便捷、患者依從性較好，從而對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷具有良好的臨床推廣作用。

3.2 檢測(cè)平臺(tái)，檢測(cè)方法靈敏性，特異性及臨床應(yīng)用

本研究利用甲基化特異性引物和Taqman 特異性熒光檢測(cè)技術(shù)基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 平臺(tái)對(duì)外周血進(jìn)行mSEP9 的檢測(cè)，證實(shí)了其在結(jié)直腸腺瘤中的敏感性及特異性。也有部分學(xué)者通過(guò)改進(jìn)或創(chuàng)新，研究新的檢測(cè)平臺(tái)以達(dá)到更好的操作接受度和更多的臨床應(yīng)用。如Ma Z Y 等[11]研究顯示mSEPT9 率、甲基化豐度及CEA 的水平在結(jié)直腸癌患者中比正常對(duì)照組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在CRC 中甲基化發(fā)生率及豐度的曲線下面積分別為0.707 和0.710。甲基化豐度從近端到遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌中有增加的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后3 個(gè)月，甲基化率、甲基化豐度都有下降，尤其在三期及直腸癌中明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外也有學(xué)者研制出一個(gè)微滴式數(shù)字PCR 平臺(tái)可對(duì)結(jié)直腸癌病人血漿SEP9 進(jìn)行定量的檢測(cè)。SEP9 甲基化豐度早期術(shù)后下降，這可能用于監(jiān)測(cè)術(shù)后治療反應(yīng)的有效性[12]。Qiu Liang 等[13]研制了一種檢測(cè)雙鏈DNA 的新型mSEPT9 檢測(cè)方法，在這個(gè)方法中甲基化DNA 連同質(zhì)控基因的特異序列能夠在一個(gè)反應(yīng)中得到擴(kuò)增及檢測(cè)，對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生的敏感性及特異性分別為77.4%，97.8%，對(duì)于臨床早期結(jié)直腸癌檢測(cè)有更好的診斷價(jià)值。此外，也有研究者探索mSEPT9 檢測(cè)聯(lián)合不同的標(biāo)記物，檢測(cè)其在腫瘤中的表達(dá)情況。如LEI ZHANG 等[12]通過(guò)聯(lián)合SEPT9 甲基化與編碼蛋白基因Synuclein Gamma（SNCG）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其在食道癌中不同分期表達(dá)存在差異，聯(lián)合檢測(cè)敏感性有所提高?？傊?，甲基化在部分癌癥發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合篩查篩出早期病變?nèi)缦倭龅仁枪P者努力探索的方向。

3.3 mSEPT9 陽(yáng)性界定值及如何提高檢測(cè)敏感度及特異度

本研究中，外周血mSEPT9 檢測(cè)受試者特征曲線顯示SEP9 在CT 值為39.55 是分界值，這與試劑盒建議的小于41 為陽(yáng)性有一定的差異，筆者分析這與本研究總體樣本量較小，而且是單中心研究結(jié)果有一定的關(guān)系，而且可能與本研究結(jié)果主要針對(duì)的是結(jié)直腸癌早期病變-結(jié)直腸腺瘤有關(guān)，尚需增大樣本量、多中心的研究進(jìn)一步證實(shí)。同時(shí)，在39.55 分界值時(shí)候敏感度為90.91%，特異度為56.67%，敏感度較高、而特異度不是很強(qiáng)。因此，在結(jié)直腸腺瘤或結(jié)直腸癌早篩的過(guò)程中，可以通過(guò)多個(gè)標(biāo)記物的聯(lián)合檢測(cè)以提高敏感性及特異性，F(xiàn)EI XU 等[14]通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)mSEP9 和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶1（branched chain amino acid transaminase 1，BCAT1）對(duì)于結(jié)直腸癌的診斷敏感性可達(dá)83.7%，特異性可達(dá)93.9%，曲線下面積為0.908。目前，報(bào)道稍多的是SEP9 基因甲基化聯(lián)合大便隱血免疫法（fecal immunochemical test，F(xiàn)IT）檢測(cè)，H.W 等[15]聯(lián)合 FIT 和DNA 甲基化檢測(cè)（包括mSEPT9），對(duì)結(jié)直腸癌敏感性提高到81.5%，曲線下面積為 0.93，優(yōu)于單獨(dú)的FIT，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)腺瘤的敏感性為 27.8%，特異性為94.4%，多維檢測(cè)在不同階段的腫瘤中的敏感性及特異性也不同。因此，探討更便捷和經(jīng)濟(jì)的聯(lián)合檢測(cè)方式篩查結(jié)直腸腺瘤依然是待解決的問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)多中心、大樣本、多分層的研究得到更加經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)方法，使陰性檢測(cè)者不必接受腸鏡等侵入性檢查，而結(jié)直腸腺瘤患者能夠更有針對(duì)性接受腸鏡檢查，從而大范圍減少由腺瘤惡變?yōu)榘┑目赡堋?/p>

3.4 結(jié)直腸腺瘤中mSEPT9 與外周血CEA 敏感性及特異性的比較

目前，臨床常用篩查結(jié)直腸癌的方法主要是檢測(cè)外周血腫瘤標(biāo)記物，如 CEA、CA19-9、CA125 等，而這些標(biāo)記物一般可在多種惡性腫瘤中有不同程度的升高因此對(duì)結(jié)直腸癌的診斷特異性較差。尤其是在結(jié)直腸癌發(fā)生的早期病變-腺瘤中的敏感性及特異性則更不明顯，這在筆者的研究中也得到證實(shí)。本研究在結(jié)直腸腺瘤中外周血CEA 檢測(cè)的受試者特征曲線顯示曲線下面積為0.533，P值為0.683 7（>0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，不能單獨(dú)將外周血CEA 檢測(cè)用于結(jié)直腸腺瘤的篩查。

3.5 低級(jí)別與高級(jí)別腺瘤mSEPT9 的比較

在結(jié)果中經(jīng)過(guò)Fisher 精確統(tǒng)計(jì)，低級(jí)別與高級(jí)別腺瘤mSEPT9 陽(yáng)性例數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也許并不能完全代表真實(shí)的客觀情況，因?yàn)榇舜问茉囌邩颖玖可儆绕涓呒?jí)別腺瘤組受試者樣本量很少，只有5 例，通過(guò)這次研究入組對(duì)象等分析在后續(xù)的研究中納入腺瘤更細(xì)分類(lèi)入組及增加入組樣本數(shù)量，并進(jìn)行多中心研究對(duì)于得到更加客觀的結(jié)論非常重要，只有這樣得到的結(jié)論才更能分層分類(lèi)指導(dǎo)臨床推廣應(yīng)用。

綜上所述，在結(jié)直腸癌早期病變-腺瘤的早期篩查中，本研究結(jié)果一定程度上為臨床優(yōu)先進(jìn)行mSEPT9 檢測(cè)進(jìn)行有效分層管理，再對(duì)陽(yáng)性人群進(jìn)行侵入性腸鏡檢查提供了一定的理論基礎(chǔ)，這樣一定程度上可增加結(jié)直腸癌或腺瘤早期篩查的陽(yáng)性診斷率，并可增加該類(lèi)篩查人群對(duì)腸鏡檢查的接受度及相應(yīng)減少腸鏡侵入性檢查的有可能造成的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。

本研究有一定的局限性，首先是樣本量相對(duì)較少，其次是沒(méi)有進(jìn)行多因素的分析，因此研究結(jié)果外周血mSEPT9 檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)直腸腺瘤有較高的敏感性，和相對(duì)較好特異性的結(jié)論要慎重解讀，后續(xù)項(xiàng)目組可通過(guò)優(yōu)化如納入更細(xì)分層，入組更多樣本量、多中心、多因素分析及聯(lián)合其他檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)結(jié)直腸腺瘤進(jìn)行早期預(yù)測(cè)及診斷研究，以期為結(jié)直腸癌早期病變-腺瘤篩查診斷及管理提供更好的檢測(cè)保障。