黃 毅 ，黃永健 ，麥 玲 ，羅 婷

（1）崇左市人民醫(yī)院神經外科;2）手術麻醉科;3）供給室，廣西 崇左 532200）

動脈瘤性蛛網膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH）是腦血管疾病常見并發(fā)癥，具有較高致殘率、病死率，據相關資料顯示，aSAH 病死率高達45%，約30%幸存患者中伴有不同程度的認知功能障礙，嚴重影響患者生命健康、生活質量[1-3]。轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）/蘇氨酸激酶受體（aerinethreonine kinase receptors，Smads）信號轉導通路可調控多種細胞生長分化、凋亡、周期等生物學過程，對維持機體正常發(fā)育、動態(tài)平衡具有重要作用[4-5]。既往研究顯示，TGF-β1 與aSAH 發(fā)生發(fā)展密切相關，并與患者慢性腦積水形成顯著有關[6]，但關于TGF-β/Smads 信號轉導通路對患者認知功能障礙的研究尚未報道。本研究通過選取崇左市人民醫(yī)院100 例aSAH 患者，檢測患者外周血內TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子表達，并分析其與認知功能障礙的關系，旨在為臨床研究aSAH 提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入標準[7]：經CT、MRI 等檢查確診aSAH；均為單個病灶；均為首次發(fā)生蛛網膜下腔出血；臨床資料詳細完整。排除標準：aSAH 前即存在認知功能障礙者；合并顱內占位病變；血液系統(tǒng)疾?。粐乐馗文I等功能衰竭；近1 a 內服用過認知功能障礙藥物。本研究經崇左市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（201802012）。

根據上述納入、排除標準回顧性選取2018年10 月至2022 年3 月崇左市人民醫(yī)院收治的100 例aSAH 患者的臨床資料進行研究，其中男57 例，女43 例；年齡21～83（53.99±13.80）歲；動脈瘤大小2.5～9.3（6.48±1.43）mm；基礎疾病：10 例糖尿病，26 例高血壓；19 例煙酒史；Hunt-Hess 分級[8]：1～2 級86 例，3～4 級14 例；改良FISHER 分級[9]：1～2 級71 例，3～4 級29 例；動脈瘤位置：前循環(huán)87 例，后循環(huán)13 例。

1.2 認知功能障礙評估標準

出血后3 個月，由經過專業(yè)培訓的神經科醫(yī)師采用蒙特利爾認知評估量表（montreal cognitive assessment acale，MoCA）評估患者認知功能[10]，主要包括執(zhí)行功能、記憶力、語言、視功能技能、抽象思維、注意力、計算和定向力8 個領域，總分30 分，≥26 分為正常，即無認知功能障礙（n=46）；<26 分存在認知功能障礙（n=54）。

1.3 實時熒光定量PCR 法檢測TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 水平

入組時，取2 組患者靜脈血，與1 mL TRIzol試劑（賽默飛世爾）混合，用于抽提總RNA，檢測其濃度、純度，利用Prime Script RT 試劑盒（賽默飛世爾）合成cDNA，并以cDNA 為模板，用Premix Ex Taq 試劑盒（賽默飛世爾）于ABI 7 500 PCR 儀（賽默飛世爾）上進行擴增反應，反應體系為5.0 μL SYBR Green Mix，1.0 μL cDNA，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 補足至20.0 μL。采用2-ΔΔCT法計算TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA表達水平。引物由上海吉瑪設計合成，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 觀察指標

（1）統(tǒng)計2 組臨床資料，包括性別、年齡、受教育年限、糖尿病、高血壓、煙酒史、Hunt-Hess 分級、改良FISHER 分級、動脈瘤大小與位置、治療方式、術后血性腦脊液引流方式及并發(fā)癥發(fā)生率；（2）比較2 組患者外周血TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表達水平；（3）分析 TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 與aSAH 患者認知功能障礙的關系；（4）采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA對aSAH 患者認知功能障礙的預測價值。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數據采用Excel 2016 收集整理，并用統(tǒng)計學SPSS 24.0 軟件處理，計數資料用n（%）表示，χ2檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料用（）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；Logistic 進行多因素分析；采用ROC 曲線評估TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 對aSAH 患者認知功能障礙的預測價值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2 組臨床資料比較

2 組性別、年齡、受教育年限、糖尿病、高血壓、煙酒史、Hunt-Hess 分級、改良FISHER分級、動脈瘤大小與位置、治療方式、術后血性腦脊液引流方式及并發(fā)癥發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 2 組臨床資料比較[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

表2 2 組臨床資料比較[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

表2 2 組臨床資料比較[（）/n（%）]（2）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（2）

表2 2 組臨床資料比較[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

表2 2 組臨床資料比較[（）/n（%）]（3）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（3）

表2 2 組臨床資料比較[（）/n（%）]（1）Tab.2 Comparison of clinical data between the two groups[（）/n（%）]（1）

2.2 2 組TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子表達比較

認知功能障礙組患者外周血TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表達水平較無認知功能障礙組高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 2 組TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子表達比較（）Tab.3 Comparison of expression of factors related to TGF-β/Smads signaling pathway between the two groups（）

表3 2 組TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子表達比較（）Tab.3 Comparison of expression of factors related to TGF-β/Smads signaling pathway between the two groups（）

*P <0.05。

2.3 TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子與aSAH 患者認知功能障礙的關系

以aSAH 患者有無認知功能障礙為因變量，TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 為自變量，賦值情況見表4，Logistic 回歸分析顯示，TGF-β、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 與aSAH 患者認知功能障礙獨立相關（P<0.05），見表5。

表4 賦值量表Tab.4 Assignment Scale

表5 TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子與aSAH 患者認知功能障礙的關系Tab.5 Relationship between factors related to TGF-β/Smads signaling pathway and cognitive dysfunction in patients with aSAH

2.4 TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子預測aSAH 患者認知功能障礙的ROC 曲線

繪制TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子預測aSAH 患者認知功能障礙的ROC 曲線，TGFβ、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 單獨預測aSAH 患者認知功能障礙的曲線下面積（Area under the curve，AUC）值分別為0.704、0.817、0.738、0.706，聯(lián)合預測AUC 為0.918，P均 <0.001，見表6、圖1；進一步對各預測方案預測價值比較顯示，TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子TGFβ、Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 聯(lián)合預測的AUC 明顯優(yōu)于單獨指標，P均 <0.05，見表7。

圖1 TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子預測aSAH患者認知功能障礙的ROC 曲線Fig.1 ROC curves of TGF-β/Smads signaling pathwayrelated factors predicting cognitive dysfunction in patients with aSAH

表7 TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子聯(lián)合與單獨預測方案預測價值比較Tab.7 Comparison of predictive value of TGF-β/Smads signaling pathway-related factors in combination with separate prediction schemes

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，aSAH 存在不同程度的認知功能障礙，其發(fā)生機制可能與腦水腫、顱內壓升高、腦部缺血缺氧、腦血流灌注壓降低、腦血流速度降低等有關，患者腦部組織生理病理性改變可引起海馬組織微循環(huán)障礙，導致海馬神經元細胞壞死、凋亡，進而影響患者認知功能[11-12]。本研究顯示，100 例aSAH 患者認知功能障礙發(fā)生率為54.0%，這高于溫玉東等[13]研究結果，可能與患者年齡、樣本量、Hunt-Hess 分級、改良FISHER分級等有關。

研究表明，TGF-β/Smads 信號轉導通路可參與中樞神經系統(tǒng)、腦血管等疾病發(fā)生[14-15]。TGFβ 是細胞因子超家族成員，廣泛存在哺乳動物體內，目前已被發(fā)現(xiàn)有6 個亞型，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2、TGF-β4 及TGF-β5，而各種亞型具有高度同源性，功能作用形似，可介導參與多種細胞增殖分化、凋亡、自噬、纖維化和炎癥反應等[16]。TGF-β 是該信號轉導通路的關鍵因子，可激活下游絲裂原活化蛋白激酶、細胞外信號調節(jié)激酶、磷脂酰肌醇激酶、氨基末端激酶及Smad 等因子，進而參與細胞生物學過程[17-19]。Smad 是TGF-β 下游蛋白，正常情況下TGF-β 以失活形式存在細胞質內，在一些因素刺激下（如脂多糖），神經細胞可激活TGF-β 聚合形成異四聚體，TGF-β 發(fā)生磷酸化，通過招募Smad 形成復雜的復合物進入細胞核內，從而抑制或激活目的基因轉錄，參與疾病發(fā)展[20]。研究顯示，中樞神經細胞損傷后，可激活海馬神經細胞、小膠質細胞，促進大量炎癥因子生成，TGF-β1 表達增高，加重機體神經功能損傷，導致機體認知功能障礙[21]。動物研究發(fā)現(xiàn)，通過構建蛛網膜下腔出血大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織TGF-β1 蛋白表達上調，加重大鼠神經功能缺損、增加血腦屏障通透性，并促進神經細胞凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，認知功能障礙組患者外周血內TGFβ mRNA 表達水平高于無認知功能障礙，且TGFβ mRNA 與aSAH 患者認知功能障礙密切相關，故筆者推測TGF-β 變化可能與aSAH 患者認知功能障礙有關，考慮其作用機制可能為外周血內TGF-β mRNA 表達水平升高，導致患者腦組織局部缺血缺氧，促進神經細胞發(fā)生炎癥反應，加重神經組織損傷，進而參與aSAH 發(fā)展，但該結果僅為推測，有待臨床進一步研究證實。

Smad 蛋白家族成員眾多，在神經系統(tǒng)疾病、腦血管疾病激活TGF-β/Smads 信號轉導通路，可減輕神經元細胞損傷，從而提高機體抗炎、抗凋亡作用[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，Smad3 基因缺陷帕金森病模型內，可促進炎癥因子聚集在小鼠神經元細胞、星形膠質細胞，并表現(xiàn)出小鼠海馬功能障礙[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，認知功能障礙患者外周血內Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表現(xiàn)趨勢與TGFβ mRNA 表現(xiàn)一致，表明 Smad1、Smad3、Smad7 可參與aSAH 患者認知功能障礙進展。可能是因為外周血內TGF-β mRNA 表達水平升高，激活下游Smad1、Smad3、Smad7 mRNA 表達水平，進而加重神經細胞損傷，引起患者神經功能障礙，可共同參與aSAH 發(fā)展，但具體機制尚不明確，有待進行下一步探究。

本研究通過繪制ROC 曲線，發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smads 信號轉導通路相關因子聯(lián)合預測aSAH 患者認知功能障礙的AUC 優(yōu)于單獨預測，具有一定診斷效能，提示各相關因子聯(lián)合預測aSAH 患者認知功能障礙的效能優(yōu)于單獨預測。

綜上可知，aSAH 患者外周血內TGF-β/Smads信號轉導通路相關因子高表達，提示該通路可能與患者認知功能障礙有關，可用于輔助臨床預測aSAH 術后認知功能障礙。本研究尚存在一定局限性，僅分析該信號通路轉錄層面的數據，未進行蛋白、因子等分析，有待臨床擴大樣本量，做進一步研究證實。