朱東平 ，李海峰 ，馮俊飛 ，湯秋恒 ，冷 靜

（1）大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671003;2）云南省第三人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650011）

目前，肺癌已成為我國(guó)發(fā)病率、死亡率最高的腫瘤之一。我國(guó)健康體檢者每年通過影像檢查出肺部結(jié)節(jié)檢出率約為31%，良性結(jié)節(jié)約占96.4%，6 mm 以上肺結(jié)節(jié)惡性程度明顯增大風(fēng)險(xiǎn)超過1%[1]。早期惡性肺部結(jié)節(jié)診斷的檢出率極低，僅為腫瘤結(jié)節(jié)的2%。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域中的1 個(gè)關(guān)鍵研究方向，它在原位肺部惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色[2]。隨著實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化與肺癌密切相關(guān)[3-4]。

本研究通過RT-PCR 對(duì)支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化單獨(dú)與聯(lián)合對(duì)肺部結(jié)節(jié)或腫塊性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以確定其診斷效能，為影像學(xué)和細(xì)胞學(xué)診斷不明時(shí)，提高肺癌的檢出率，便于肺部良惡性疾病鑒別診斷及輔助肺癌早期診斷。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象均來自云南省第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院患者，該方案通過了云南省第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（2024KY001），在研究過程中詳細(xì)告知患者研究細(xì)則，并簽署知情同意書。收集2019 年3 月至2020 年3 月經(jīng)云南省第三人民醫(yī)院胸部影像學(xué)發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)、腫塊的患者99 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）胸部CT 提示肺部結(jié)節(jié)、腫塊患者根據(jù)《中國(guó)肺部結(jié)節(jié)分類、診斷和治療指南2016 版》診斷[5]，經(jīng)臨床排外感染病灶者；（2）年齡14～80 歲患者；排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不適宜進(jìn)行纖維支氣管鏡檢查者；（2）已明確診斷肺癌和肺部炎癥患者；（3）病情垂危者及失訪者。并在1a 內(nèi)進(jìn)行定期隨訪、肺活檢及手術(shù)后病檢，50 例患者最后確診為原發(fā)性肺癌，病理類型為腺癌23 例、鱗癌14 例、腺鱗癌2 例、小細(xì)胞癌1 例、大細(xì)胞癌1 例、其它肺部惡性腫瘤9 例。

1.2 BALF 提取

對(duì)99 例患者進(jìn)行纖維支氣管鏡檢查，操作均由云南省第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科副主任及以上醫(yī)師取樣，參照2013 年英國(guó)胸科學(xué)會(huì)成人纖維支氣管鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)[6]，分3 次將滅菌生理鹽水20 mL注入病變肺段，共60 mL，負(fù)壓抽吸前停留20 s，回收量不少于30 mL，取20 mL 離心，10 000 r/min離心5 min。記錄回收的BALF 總量，然后進(jìn)行刷檢，采集組織標(biāo)本。

1.3 BALF 中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化檢測(cè)

1.3.1 DNA 提取將提取的20 mL 肺泡灌洗液進(jìn)行離心，10 000 r/min 離心5 min，經(jīng)過沉淀后，使用移液槍去除上清液后提取肺泡細(xì)胞，然后將肺泡細(xì)胞中DNA 提取出來。

1.3.2 DNA 甲基化的PCR 檢測(cè)SHOX2 和RASSF1A 基因檢測(cè)試劑盒、引物和探針均由上海透景生命科技股份有限公司提供。本研究采用亞硫酸鹽修飾和Real-time PCR（Taqman 探針法）2種方法處理離心后提取的DNA。首先，亞硫酸鹽修飾：利用亞硫酸鹽將未甲基化堿基替換后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。通過觀察免疫熒光染色，可以區(qū)分甲基化和未甲基化的C 堿基。Taqman 探針法：通過采用Taqman 探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)肺泡組織中甲基化DNA 的特異性檢測(cè)，最后使用通用實(shí)時(shí)熒光PCR 儀循環(huán)階段收集FAM、VIC 及 CY5 的信號(hào)。FAM 用于檢測(cè)RASSF-1A 基因甲基化狀態(tài)，VIC 用于檢測(cè)SHOX2 基因的DNA 甲基化狀態(tài)，CY5 用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)基因βactin 的水平，（VIC 通道 Ct <32 為陽(yáng)性；FAM 通道 Ct <35 為陽(yáng)性；CY5 通道18≤ Ct ≤23 提示內(nèi)參有效，若超出需計(jì)算△Ct 值）。

1.4 組織病理學(xué)檢測(cè)

1.4.1 經(jīng)皮肺活檢應(yīng)用320 排螺旋CT 掃描，確定穿刺點(diǎn)后利用2%利多卡因針局部浸潤(rùn)麻醉，應(yīng)用11.8 cm 的穿刺針分布進(jìn)針方法一次穿刺至胸膜、靶病變邊緣及病變內(nèi)，4%甲醛固定后進(jìn)行組織病理及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.4.2 手術(shù)切除病檢經(jīng)螺旋CT 診斷結(jié)節(jié)、腫塊部位，經(jīng)手術(shù)切除后進(jìn)行相應(yīng)染色處理，行組織病理及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，由該機(jī)構(gòu)資深病檢學(xué)家出具診斷報(bào)告。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量（表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較；采用χ2分析臨床病理結(jié)果中SHOX2、RASSF1A 甲基化的陽(yáng)性率；應(yīng)用ROC 曲線評(píng)價(jià)SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化對(duì)肺癌診斷的效力，并獲得最佳約登指數(shù)（靈敏度+特異度-1），P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例特征分析

共納入99 例患者，其中病理檢測(cè)明確診斷為肺癌患者50 例，良性疾病組49 例，99 例患者的平均年齡為61.79 歲，其中肺癌組平均年齡（62.64±9.71）歲，較良性疾病組年齡（60.48±13.69）歲大，2 組年齡差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），吸煙史增加患肺部惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)（P<0.001）。性別、胸部CT 提示結(jié)節(jié)大小均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.132，P=0.177 和P=0.065），見表1。

表1 臨床病例特征[（n）%/（）]Tab.1 Clinical case characteristics[（n）%/（）]

*P <0.05。

2.2 2 組肺泡灌洗液中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化PCR 對(duì)比結(jié)果

在2 組SHOX2 和RASSF1A 2 基因甲基化PCR檢測(cè)中，單基因、雙基因聯(lián)合或任意基因甲基化對(duì)肺癌檢測(cè)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），肺癌組任意基因陽(yáng)性較對(duì)照組有明顯差異（χ2=54.046，P<0.001），見表2；對(duì)肺部惡性腫瘤進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)在2 基因甲基化PCR 任一陽(yáng)性對(duì)肺腺癌、肺鱗癌檢出率均高，分別為91.3%、85.71%，見表3。

表2 2 組SHOX2 和RASSF1A 基因組甲基化PCR 檢測(cè)結(jié)果 [n（%）]Tab.2 PCR results of SHOX2 and RASSF1A genome methylation in two groups [n（%）]

表3 不同類型肺癌患者基因甲基化檢測(cè) [n（%）]Tab.3 Gene methylation in patients with different types of lung cancer [n（%）]

2.3 研究指標(biāo)多因素回歸分析

將單因素差異性分析中P<0.05 變量直接納入多因素回歸分析，將SHOX2 陰性、RASSF1A 陰性和不吸煙作為參考類別，發(fā)現(xiàn)SHOX2、RASSF1A及吸煙是肺癌診斷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），2組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.469）；肺泡灌洗液SHOX2 基因甲基化陽(yáng)性患者比SHOX2陰性患者患癌風(fēng)險(xiǎn)增加13.675 倍（P=0.009，95%CI：2.146～20.451），RASSF1A 基因甲基化陽(yáng)性患者比RASSF1A 陰性患者患癌風(fēng)險(xiǎn)增加3.644 倍（P=0.014，95%CI：1.245～8.245），此外，吸煙患者比不吸煙患者患癌風(fēng)險(xiǎn)增加，見表4。

表4 多因素Logistics 回歸分析Tab.4 Multi-factor Logistics regression analysis

2.4 2 組基因甲基化PCR 結(jié)果ROC 分析

進(jìn)一步評(píng)估了2 基因甲基化檢測(cè)99 例肺部結(jié)節(jié)和腫塊患者預(yù)測(cè)價(jià)值，生成了受試者工作曲線，SHOX2 和RASSF1A 檢測(cè)肺癌曲線下面積、靈敏度和特異度，見表5、圖1。SHOX2、RASSF1A和2 基因聯(lián)合檢測(cè)曲線下面積分別為0.829、0.770 和0.869，SHOX2+RASSF1A 聯(lián)合高于單一檢測(cè)，靈敏度和特異度為0.84，0.898。

圖1 SHOX2 和RASSF1A 基因ROC 曲線Fig.1 SHOX2 and RASSF1A were detected by the ROC curve

表5 單一指標(biāo)和雙指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果Tab.5 Combined detection results of single index and double index

2.5 對(duì)良性疾病組中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化陽(yáng)性患者隨訪

對(duì)起始拒絕行肺穿刺活檢及手術(shù)病檢的2 例患者，每1、3、6 個(gè)月進(jìn)行電話隨訪、約定隨訪復(fù)查，詢問相關(guān)肺部疾病癥狀演變，是否在外院進(jìn)行相關(guān)治療，復(fù)查后經(jīng)由該院資深影像學(xué)家閱片，有1 例患者病情惡化，經(jīng)病理檢測(cè)診斷為肺癌，另1 例患者肺部結(jié)節(jié)消失，考慮為肺部炎癥。

3 討論

隨著我國(guó)的工業(yè)化和城市化不斷發(fā)展、老年基數(shù)增大及長(zhǎng)期吸煙等危險(xiǎn)因素影響導(dǎo)致我國(guó)體檢人群中肺結(jié)節(jié)檢出率為31%[1]，而歐美國(guó)家，體檢發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)的概率更高，達(dá)到了41%～51%[7]。此外，肺部長(zhǎng)期存在磨玻璃結(jié)節(jié)的患者，最后診斷惡性腫瘤概率超過了10%。根據(jù)最新研究結(jié)果[8]顯示，肺癌在我國(guó)以及全世界已成為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重的威脅。

據(jù)我國(guó)腫瘤登記報(bào)告顯示，云南省的肺癌發(fā)病率平均為每10 萬人中的44 例，是全國(guó)平均水平的2～3 倍。而云南宣威肺癌發(fā)病率高達(dá)93/10萬人，位居全國(guó)第一[9]，因此提升肺癌的診斷率變得迫切和必要。2011 年美國(guó)進(jìn)行國(guó)家肺癌篩查實(shí)驗(yàn)（national lung screening trial，NLST），采用隨機(jī)對(duì)照研究對(duì)高危肺結(jié)節(jié)患者進(jìn)行低劑量胸部CT（常規(guī)CT1/5 輻射劑量）篩查，這一措施比單獨(dú)X 胸片降低了20%肺癌患者病死率[10]，因此為提高肺部腫瘤早期發(fā)現(xiàn)，我國(guó)建議高危肺結(jié)節(jié)人群每年進(jìn)行低劑量胸部CT 篩查[11]。但有研究顯示[12]，通過低劑量螺旋CT（low-dosespiral computed tomography，LDCT）能檢測(cè)出患者的非鈣化結(jié)節(jié)中實(shí)際僅為腫瘤結(jié)節(jié)的2%，很大程度影響了患者早期肺癌檢出。在高肺癌發(fā)病率的云南地區(qū)，對(duì)沒有明顯呼吸道癥狀及早期結(jié)節(jié)直徑小于1 cm 的肺癌患者，由于腫瘤標(biāo)記物、細(xì)胞學(xué)檢查、影像學(xué)檢查和支氣管鏡檢對(duì)肺癌檢出率相對(duì)較低，而且難以取得活體組織進(jìn)行病檢，所以多數(shù)患者被診斷為惡性腫瘤時(shí)已進(jìn)展到晚期，從而錯(cuò)過最佳手術(shù)及放化療治療時(shí)期，致肺癌整體5 a生存率低，僅為16%左右[13]。因此對(duì)高危肺癌患者的篩查、早期診斷、及時(shí)干預(yù)治療尤為重要。

研究表明DNA 甲基化被廣泛應(yīng)用于癌癥的輔助診斷，特別是在BALF 和胸腔積液等微創(chuàng)檢測(cè)中[14]。矮小同源盒基因（short stature homobox 2，SHOX2）是同源盒基因家族的一員，參與癌癥早期病變。劉瑩等[3]研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2 基因在實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常，如肺癌、乳腺癌和腎癌等，在肺癌組織中高表達(dá)，可能與甲基化后染色體穩(wěn)定性受損、促癌基因的表達(dá)、腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)和遺傳穩(wěn)定性失去平衡等，導(dǎo)致細(xì)胞增值失控。RASSF1A基因，Ras 相關(guān)區(qū)域家族蛋白1A（ras-association donmain family，RASSF1A）是1 種新型的腫瘤抑制基因，在腫瘤生長(zhǎng)過程中起著很重要抑制作用，參與了許多靶基因的調(diào)控，如基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞癌變是由于啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化、雜合性缺失及染色體缺失等導(dǎo)致了RASSF1A 基因失活[4]，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增值。SHOX2 甲基化能較好的區(qū)分肺部良、惡性病變[15]。本研究通過收集肺部結(jié)節(jié)或腫塊患者肺泡灌洗液，進(jìn)行SHOX2 及RASSF1A 基因甲基化PCR 檢測(cè)，通過病檢得到肺結(jié)節(jié)性質(zhì)對(duì)2 基因結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示SHOX2、RASSF1A 基因聯(lián)合對(duì)肺癌診斷的靈敏度為84%，特異度為89.8%，進(jìn)一步進(jìn)行多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)在排除吸煙及年齡影響后，2 基因甲基化陽(yáng)性對(duì)早期肺癌仍有較高的診斷效能，可以作為肺癌獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)相比，可為臨床上提供有效補(bǔ)充工具，避免了患者不必要的精神、身體損害。

此外，國(guó)內(nèi)研究表明[16]，肺癌的病理類型與基因甲基化陽(yáng)性檢出率有顯著相關(guān)性；此外Schmidt 等[17]對(duì)肺癌患者的血液和肺組織進(jìn)行SHOX2 甲基化研究，發(fā)現(xiàn)SHOX2 基因甲基化對(duì)癌癥有很高檢出率，可以作為早期檢測(cè)指標(biāo)，還可以獨(dú)立的預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌臨床預(yù)后。在本研究中，SHOX2、RASSF1A 基因甲基化在肺癌分類中發(fā)現(xiàn)肺腺癌（23 例）、肺鱗癌（14 例）、肺腺鱗癌（2）任意陽(yáng)性檢出率分別為91%、86%、50%，說明在肺癌早期的肺結(jié)節(jié)、腫塊時(shí)，2 基因?qū)Ψ蜗?、鱗癌檢出敏感性極高（由于肺大、小細(xì)胞癌病例數(shù)少，僅1 例，不具有統(tǒng)計(jì)意義），對(duì)比了相關(guān)研究[18]結(jié)果，在NSCLC 中，腺癌中RASSF1A 的甲基化頻率高于鱗狀細(xì)胞癌，與本研究結(jié)果是一致的。這種現(xiàn)象可能與SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化在肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌中的高表達(dá)增高了肺惡性腫瘤的檢出。

對(duì)開始拒絕行肺穿刺活檢及手術(shù)病檢的2 例患者，在1 a 內(nèi)行電話隨訪、約定隨訪復(fù)查，復(fù)查胸部CT 后有1 例患者病情惡化，經(jīng)病理檢測(cè)診斷為肺癌；另1 例肺結(jié)節(jié)患者中，BALF 中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化均陽(yáng)性，經(jīng)治療后肺部結(jié)節(jié)吸收，考慮為肺部炎癥，該例是否因其它疾病導(dǎo)致基因發(fā)生了甲基化，進(jìn)一步查閱大量資料對(duì)導(dǎo)致該現(xiàn)象進(jìn)行分析并對(duì)該患者持續(xù)進(jìn)行隨訪中。

本研究不足之處：（1）于周圍型肺小結(jié)節(jié)患者在留取BALF 時(shí)，有發(fā)生灌洗液中難以對(duì)結(jié)節(jié)部位進(jìn)行基因標(biāo)本獲取，從而導(dǎo)致一定假陰性結(jié)果可能性，這對(duì)操作者的支氣管鏡檢查技術(shù)帶來考驗(yàn)，且在一定程度取決于患者配合程度；（2）不能短時(shí)間內(nèi)獲取全部肺結(jié)節(jié)、腫塊患者的全部臨床病理數(shù)據(jù)，導(dǎo)致部分失聯(lián)患者數(shù)據(jù)缺失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

綜上所述，對(duì)肺癌早期對(duì)肺部結(jié)節(jié)、腫塊性質(zhì)不能有效診斷時(shí)，SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化可以作為有效的補(bǔ)充工具，提高早期肺癌的檢出，并且對(duì)肺腺癌、肺鱗癌診斷提供一定診斷依據(jù)。