邊佳

（安徽皖欣環(huán)境科技有限公司，安徽合肥230000）

1 引言

隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題的日趨嚴(yán)重，各行各業(yè)對(duì)氮素排放的要求也愈加嚴(yán)格，因此，如何有效凈化氮素成為當(dāng)前廢水處理領(lǐng)域的重要課題［1］。氮在廢水中的存在方式多種多樣，如氨態(tài)、分子態(tài)、有機(jī)態(tài)、硝態(tài)和亞硝態(tài)等［2］，其中，氨氮是引發(fā)水域富營(yíng)養(yǎng)化的重要污染源之一。因此，開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)高效的氨氮去除方法，以達(dá)到高標(biāo)準(zhǔn)的氮素排放要求，成為當(dāng)前水處理研究的關(guān)鍵。

曝氣生物濾池（BAF）融合了過(guò)濾、生物代謝、吸附等多種凈化功能，在水處理應(yīng)用中備受關(guān)注［3-4］。生物膜是BAF 穩(wěn)定運(yùn)行的關(guān)鍵，其中微生物活性對(duì)BAF 的處理效果影響較大。填料表面的結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)對(duì)附著物生長(zhǎng)以及出水水質(zhì)的提升至關(guān)重要；沸石作為廉價(jià)天然的非金屬載體，具有獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的離子吸附和交換性能［5］。通過(guò)對(duì)天然沸石載體進(jìn)行改性或與其他材料聯(lián)合，可以有效提升對(duì)氮素的去除水平，促進(jìn)載體再生［6-8］。研究表明，不同填料載體上的微生物結(jié)構(gòu)具有多樣性，對(duì)氮素去除的作用機(jī)理也不盡相同，進(jìn)水及工藝條件也在很大程度上影響了沸石填料的脫氮性能及微生物群落［9-10］。因此，在開(kāi)發(fā)高效廉價(jià)的沸石填料的同時(shí)，探討沸石填料中生物群落結(jié)構(gòu)及演替變化規(guī)律對(duì)BAF 凈化廢水的工藝優(yōu)化具有重要意義。

本文以天然沸石、鋁粉、水泥為主要原料，制備了多孔沸石混合填料。通過(guò)吸附、生物再生、淋洗序批三段式BAF 技術(shù)，探究填料的氨氮去除性能及氨氮廢水處理的最佳工藝參數(shù)；通過(guò)DNA 提取、PCR擴(kuò)增、DGGE 電泳等方法分析了填料上微生物結(jié)構(gòu)及多樣性，旨在為BAF 廢水處理的參數(shù)選取及工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)提供參考。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料及分析測(cè)試方法

本研究采用的沸石礦物取自安徽省宣城水東鎮(zhèn)，破碎后篩取至80～100 目。鋁粉源自合肥市化學(xué)試劑有限公司，水泥從安徽省蕪湖市的海螺水泥制造公司購(gòu)買。篩取后的沸石、鋁粉、水泥按照配比與水混合，攪拌漿液30 min，隨后保持操作溫度為60 ℃，將形成的漿液在模具中約3 h，以促使?jié){液中的氣體釋放并形成氣泡，同時(shí)切割成邊長(zhǎng)約10 mm的正方體。將其在高壓蒸汽鍋中蒸壓6 h 后，即可得到多孔沸石混合填料（Porous mixed zeolite filter）。本研究使用納氏試劑分光光度法對(duì)實(shí)驗(yàn)出水的氨氮進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法檢測(cè)出水中亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮含量。

2.2 實(shí)驗(yàn)裝置及脫氮水處理實(shí)驗(yàn)

圖1 為多孔沸石混合填料氮素水處理裝置，填料柱和填料高度分別為195 cm 和210 cm，內(nèi)外層直徑分別為8 cm 及10 cm。在填料裝柱后，首先將活性污泥曝氣、沉淀1 d，去除上清液后按照相同體積添加50 mg/L 的氨氮水溶液，繼續(xù)通入空氣從而對(duì)硝化細(xì)菌進(jìn)行富集。隨后將液體通入裝置掛膜，通過(guò)每天取樣監(jiān)測(cè)出水氨氮及硝態(tài)氮，直至硝化率達(dá)90%以上后，通過(guò)BAF 技術(shù)進(jìn)行吸附、生物再生、淋洗序批三段式處理。首先，通過(guò)調(diào)整蠕動(dòng)泵的流量，使得水力停留時(shí)間分別為4.2，3.0，1.8 h，采用上流式的進(jìn)水方式，將人工配置廢水采用連續(xù)注入的方式通入填料柱中，依據(jù)國(guó)內(nèi)城鎮(zhèn)污水處理廠氨氮排放限值，以1.5 mg/L 的出水氨氮濃度作為停止進(jìn)水的閾值，下一階段通過(guò)排空填料柱中的水，使用空壓機(jī)向填料柱鼓風(fēng)供氧一段時(shí)間，停止進(jìn)氣后在反應(yīng)體系頂部進(jìn)行淋洗，以清洗由生物硝化生成的硝酸鹽，收集淋洗液并監(jiān)測(cè)其中氨氮、硝態(tài)氮及總氮濃度，隨后計(jì)算各項(xiàng)去除率。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)

2.3 微生物群落分析方法

2.3.1 DNA 提取

本小節(jié)利用產(chǎn)自O(shè)mega 公司的E.N.Z.A DNA試劑盒對(duì)微生物群落的沉積物進(jìn)行提取分析，具體步驟如下：首先取微生物沉積物樣品于50 mL 離心管中，在9 000 r/min 下離心以去除水分。隨后將樣品（0.3～0.6 g）放入2 mL 的離心管中，添加1 mL 的Buffer SLX，并在最高速度下渦旋約3 min；向離心管中添加Buffer DS 100 μL 并均勻渦旋，在60 ℃下水浴約10 min，放入離心機(jī)中，室溫下調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，持續(xù)5 min 后將上層澄清液移至另一離心管中；添加200 μL Buffer SP2，均勻渦旋后在5 ℃下冰浴5 min 并離心，將上層澄清液轉(zhuǎn)移到800 μL 離心管，同時(shí)添加0.7 倍體積異丙醇，振蕩均勻后在5 ℃下離心約8 min；將離心管取出，小心倒出上清液，并倒置離心管于濾紙上，維持約1 min；在65 ℃下添加200 μL Elution Buffer，同時(shí)水浴加熱8 min，混勻后溶解DNA；添加100 μL HTR Reagent，均勻渦旋后室溫下靜置2 min，隨后于4 ℃，10 000 r/min下離心2 min；將上清液轉(zhuǎn)移到2 mL 離心管，并加入相同體積的Buffer XP2，均勻渦旋后將混合液轉(zhuǎn)移至離心柱，于4 ℃，10 000 r/min 下離心1 min，棄濾出液；添加300 μL Buffer XP2，4 ℃進(jìn)行離心，棄濾出液并添加700 μL SPW Wash Buffer；在4 ℃環(huán)境下，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 離心1 min，棄濾出液（此步驟重復(fù)2 次）；在相同溫度下，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為13 000 r/min 離心3 min，將離心柱倒置于濾紙之上，維持約1 min；將離心柱移入新的離心管內(nèi)，并在65 ℃下添加25 μL Elution Buffer，水浴靜置約7 min；在4 ℃，12 000 r/min 下離心1 min，將DNA 洗脫，并將該步驟重復(fù)2 次。

2.3.2 PCR 擴(kuò)增

PCR 的擴(kuò)增制備完成于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，以總DNA 為模板，擴(kuò)增體系見(jiàn)表1。

表1 PCR-DGGE 擴(kuò)增體系

引物序列見(jiàn)表2。

表2 PCR-DGGE 引物序列

擴(kuò)增程序如圖2 所示。

圖2 PCR-DGGE 擴(kuò)增流程（引物：F338-GC，518R）

在經(jīng)過(guò)上述處理后，取出5 μL 的PCR 產(chǎn)物，首先和染料混合均勻（1 μL），通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳（80 V，1 h）進(jìn)行檢測(cè)；最終通過(guò)凝膠系統(tǒng)得到圖譜并進(jìn)行保存。

2.3.3 DGGE 電泳及分析方法

使用D-code 通用突變系統(tǒng)（DGGE 電泳系統(tǒng)，Bio-Rad 公司），用于分析檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。首先制備變形梯度凝膠，其中細(xì)菌變性劑的濃度在45%～55%之間，隨后進(jìn)行點(diǎn)樣和變性梯度凝膠電泳；點(diǎn)樣體積需為30 μL（包括25 μL 的PCR 產(chǎn)物和5 μL 染料），電泳過(guò)程條件設(shè)置為60 ℃，75 V，持續(xù)14 h；隨后進(jìn)行凝膠著色處理，通過(guò)紫外凝膠系統(tǒng)成像并對(duì)圖譜進(jìn)行保存；再使用滅菌刀片切割電泳過(guò)程中獲得的特異條帶，放入200 μL 的離心管里，加入40 μL 的蒸餾水后，將其放在冰箱內(nèi)靜置一晚；最后將混合液進(jìn)行擴(kuò)增并克隆測(cè)序。

運(yùn)用Quantity One 及Python 軟件分析圖譜，在消除背景及噪聲干擾后，使用Gaussian 模型可以獲取泳道內(nèi)各條帶光密度和位置。對(duì)于圖譜分析，相似度系數(shù)基于2%誤差值進(jìn)行區(qū)分匹配及計(jì)算。圖譜中的每一個(gè)菌種或操作單元分布都對(duì)應(yīng)著一個(gè)條帶，因此，條帶數(shù)量代表微生物群落的多樣性。信號(hào)強(qiáng)弱一定程度反映該種屬微生物數(shù)量，因此可通過(guò)條帶數(shù)目及亮度得出沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)［11］。利用凝膠電泳圖像分析軟件，可以測(cè)算出光吸收峰面積，進(jìn)而得到每一個(gè)條帶或泳道相對(duì)豐度以及微生物多樣性指數(shù)，此外，還通過(guò)辛普森多樣性指數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度等指標(biāo)深入分析微生物群落多樣性。

式中，H 代表香農(nóng)多樣性指數(shù)；Pi＝Ni/N，Ni代表樣品中第i 條帶的光密度值，N 為樣品中所有條帶的光密度總和。

式中，E 代表均勻度指數(shù)；S 為豐富度，即為每一泳道內(nèi)條帶數(shù)量［12-13］。

將測(cè)序獲得序列與Genbank 基因庫(kù)中測(cè)序序列加以比對(duì)，得到具有高度同源性的序列，進(jìn)而使用鄰接樹(shù)方法來(lái)構(gòu)造系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（boot strap＝1 000），并進(jìn)行相關(guān)的同源性比對(duì)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同水力停留時(shí)間對(duì)多孔沸石混合填料的水處理效果影響

圖3 為不同水力停留時(shí)間下多孔沸石混合填料氨氮去除性能，反應(yīng)過(guò)程中硝酸鹽氮濃度的上升歸因于進(jìn)水氨氮經(jīng)混合填料微生物硝化作用（NO＝NO2--N+NO3--N）；總無(wú)機(jī)氮含量的降低則主要源于氨氮通過(guò)離子交換作用被去除（TN＝NH4+-N+NO2--N+NO3--N）。

圖3 水力停留時(shí)間對(duì)氮素去除率的影響

下列公式分別表示了離子交換去除率、生物硝化去除率及氨氮去除率：

式中，Ci代表反應(yīng)進(jìn)水處含氮化合物濃度，mg/L；C代表反應(yīng)出口處含氮化合物濃度，mg/L。

在不同水力停留時(shí)間下，多孔沸石混合填料均展現(xiàn)出優(yōu)異的氨氮處理效果，在BAF 的吸附過(guò)程中，生物硝化與離子交換作用相互協(xié)同，使出水氨氮濃度保持在閾值以下，當(dāng)多孔沸石填料逐漸吸附飽和，離子交換去除率逐漸降低。當(dāng)水力停留時(shí)間為4.2 h 時(shí)，生物硝化和離子交換去除率隨著天數(shù)的增加逐漸逼近，到了第8 天生物硝化去除率超過(guò)了離子交換去除率，這表明填料中生物硝化作用代替離子交換占據(jù)了主導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致出水中NO2--N 和NO3--N 濃度的上升，同時(shí)總氮（TN）的去除率隨之降低。而在水力停留時(shí)間為3.0 h 和1.8 h 時(shí)，多孔沸石填料在BAF 運(yùn)行的第10～14 天及第15～17 天內(nèi)的離子交換去除率始終高于生物硝化去除率，表明吸附階段中氨氮去除仍以離子交換作用為主導(dǎo)。

進(jìn)一步對(duì)氨氮容積負(fù)荷進(jìn)行衡算可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系的水力停留時(shí)間調(diào)節(jié)為4.2 h 時(shí)，氨氮的容積負(fù)荷為0.042～0.053 kgNH4+-N/（m3·d-1），氨氮去除率為82.3%～94.7%。然而隨著水力停留時(shí)間的降低，氨氮的容積負(fù)荷增大，且其去除率可穩(wěn)定在84.3%～91.8%，表明多孔沸石填料具有優(yōu)異的抗沖擊負(fù)荷能力及氨氮去除能力。隨著水力停留時(shí)間的進(jìn)一步降低，多孔沸石填料的容積負(fù)荷為0.097～0.100 kg NH4+-N/（m3·d-1），而氨氮去除率略有降低（82.5%～88.1%）。綜合考慮水力負(fù)荷和氨氮去除，選取3.0 h 為多孔沸石填料吸附的最佳水力停留時(shí)間。

3.2 PCR－DGGE 結(jié)果分析

在序批式BAF 系統(tǒng)的運(yùn)行過(guò)程中，其內(nèi)部微生物群落也發(fā)生了相應(yīng)變化。本實(shí)驗(yàn)選取了體系中6個(gè)不同高度（里外）填料進(jìn)行PCR-DGGE 圖譜分析，探究了不同填料層高度的微生物群落變化情況，具體分布情況如下：樣品編號(hào)1 號(hào)和4 號(hào)分別為體系上層填料外部及內(nèi)部分析；樣品編號(hào)2 號(hào)和5 號(hào)分別為體系中層填料外部及內(nèi)部分析；樣品編號(hào)3 號(hào)和6號(hào)分別為體系下層填料外部及內(nèi)部分析。

沸石填料系統(tǒng)的微生物群落多樣性的變化情況如圖4 所示，沸石填料系統(tǒng)上、中層的群落多樣性相對(duì)更高。上層填料外部和內(nèi)部樣品（1 號(hào)、4 號(hào)）分別為25 和18 條，中層外部和內(nèi)部樣品（2 號(hào)、5 號(hào)）為24 和20 條，下層填料外部和內(nèi)部樣品（3 號(hào)、6 號(hào)）分別為21 和20 條?？梢?jiàn)沸石填料系統(tǒng)外部的微生物多樣性相對(duì)更高。其中，1，2，3，9，23，25，28 在填料系統(tǒng)各部位都能被觀察到，為最主要的優(yōu)勢(shì)種群，表明這些條帶代表的菌群生存適應(yīng)能力更強(qiáng)；而這些條帶信號(hào)也相對(duì)更強(qiáng)，表明菌群在系統(tǒng)中含量和活性較高，有利于有機(jī)污染物的去除。進(jìn)一步討論填料內(nèi)外層多樣性可以發(fā)現(xiàn)，沸石填料系統(tǒng)中外層樣品的優(yōu)勢(shì)條帶數(shù)量多于填料內(nèi)層的樣品，表明其多樣性更高，而內(nèi)層樣品具有部分獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)條帶，這主要?dú)w因于填料內(nèi)部含有厭氧菌群落。

圖4 不同填料層PCR-DGGE 圖譜

如圖5 所示，根據(jù)戴斯系數(shù)計(jì)算并分析樣品間的相關(guān)性。將1 號(hào)樣品設(shè)置為1.00。濾池上中下層微生物種屬差異很小，表明填料系統(tǒng)內(nèi)具有穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)微生物群落和較強(qiáng)的抗負(fù)荷力。而系統(tǒng)內(nèi)外優(yōu)勢(shì)菌群表現(xiàn)出一定差別，這主要是吸附過(guò)程中沒(méi)有進(jìn)行曝氣處理，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧隨水流方向逐漸下降，其中一些微生物不能適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)不足的環(huán)境，而在該營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中能保持高活性的微生物得以保留，從而體現(xiàn)出一定的種屬差異。同時(shí)，每一泳道的相似度較高，表面填料系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌群具有一定的穩(wěn)定性，對(duì)馴養(yǎng)后接種污泥進(jìn)行掛膜，有利于序批式沸石填料工藝長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行。

圖5 PCR-DGGE 凝膠電泳各條帶相似性熱力圖

采用非加權(quán)組平均（UPGMA）法對(duì)相似性矩陣中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類處理分析，聚類結(jié)果如圖6 所示。所有樣品共被劃分為2 個(gè)類別，其中1，3，4 號(hào)，2，5，6 號(hào)樣品分別被劃分為一類。該聚類結(jié)果（圖6）與相關(guān)性情況（圖5）及現(xiàn)實(shí)狀況（圖4）較為相符。

圖6 DGGE 圖譜聚類分析圖

3.3 多孔沸石載體生物膜微生物群落分析

不同填料層生物膜數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表3，從1 號(hào)到6號(hào)樣品種群豐富度為26，24，23，17，19，20；其中1號(hào)樣品種群豐富度最高。

表3 不同填料層生物膜數(shù)據(jù)分析

樣品細(xì)菌屬的水平百分比如圖7 所示。所有樣本中都存在著大量的噬氫菌，為樣品的優(yōu)勢(shì)菌種；5號(hào)采樣點(diǎn)的豐度最高（63.28%），平均豐度為44.78%。研究表明，噬氫菌［14］可對(duì)很多有機(jī)污染物特別是芳烴類污染物起到很好的降解作用。乳球菌屬為化能異養(yǎng)及革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧，通過(guò)某些碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸［主要為L(zhǎng)（+）-乳酸］，同時(shí)這一過(guò)程無(wú)氣體產(chǎn)生。陶厄氏菌屬為反硝化細(xì)菌屬［15］，在脫氮過(guò)程中可分解如甲醛和乙醇等溶解性有機(jī)物，而硝化螺旋菌能夠?qū)喯跛猁}轉(zhuǎn)化成硝酸鹽。

圖7 細(xì)菌屬水平百分比

4 結(jié)論

（1）水力停留時(shí)間為3.0 h 時(shí)，多孔沸石混合填料容積負(fù)荷增大，氨氮去除率可穩(wěn)定在84.3%～91.8%，氮損失及氮回收率分別為341.21 mg 及87.42%，氮素綜合去除性能最佳。

（2）對(duì)于填料層內(nèi)外的微生物群落，其結(jié)構(gòu)存在明顯差異，外層的微生物群落豐富度更高，而系統(tǒng)上、下層群落多樣性則高于中層，不同條帶聚類結(jié)果及相似度與現(xiàn)實(shí)狀況相符。

（3）在檢測(cè)條帶中觀察到能夠降解各類有機(jī)污染物的菌屬（如噬氫菌）和硝化菌、反硝化菌，表明該填料具有優(yōu)異的氮素去除性能。