江杰 羅再 張昊亮 裘正軍 黃陳

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82072662）和上海市級(jí)醫(yī)院臨床技能與臨床創(chuàng)新三年行動(dòng)計(jì)劃（SHDC2020CR4022）；第一、二位作者對(duì)本文貢獻(xiàn)一致

摘要：環(huán)狀RNA（CircRNA）是一類具有連續(xù)、共價(jià)閉合、環(huán)狀結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，生成機(jī)制與線性RNA存在較大差異。目前研究已發(fā)現(xiàn)部分CircRNA可以通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、N6-甲基腺苷和滾環(huán)翻譯等非帽依賴性蛋白翻譯機(jī)制來編碼蛋白質(zhì)，且編碼的蛋白質(zhì)可進(jìn)一步通過蛋白誘餌或其他作用機(jī)制來調(diào)控同源線性蛋白質(zhì)或下游信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。已有研究表明CircRNA在各種疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，特別是參與腫瘤生長(zhǎng)增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)等發(fā)生發(fā)展過程中。因此，通過闡明編碼CircRNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)情況和作用機(jī)制，有望為腫瘤診治提供新的腫瘤標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：環(huán)狀RNA；內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；蛋白質(zhì)；蛋白誘餌

中圖分類號(hào)： R735.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A? 文章編號(hào)：1000-503X（2024）01-0072-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15498

Circular RNA-Encoded Proteins in Gastrointestinal Cancer：A Review

JIANG Jie，LUO Zai，ZHANG Haoliang，QIU Zhengjun，HUANG Chen

Department of Gastrointestinal Surgery，Shanghai General Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200080，China

Corresponding author：HUANG Chen? Tel：021-63240090-3121，E-mail：richard-hc@hotmail.com

ABSTRACT：Circular RNAs（CircRNAs）are a class of non-coding RNAs with a covalently closed-loop structure，high stability，and tissue specificity，with the production mechanisms different from linear RNAs.Recent studies have discovered that some CircRNAs can encode proteins via cap-independent translation mechanisms such as internal ribosome entry site，N6-methyladenosine，and rolling loop translation.The encoded proteins regulate homologous linear proteins or downstream signaling pathways via protein bait or other mechanisms，thereby exerting biological functions.Studies have shown that CircRNAs play a role in various diseases，especially in tumor progression，proliferation，invasion，and metastasis and immune regulation.Therefore，by elucidating the expression and roles of proteins encoded by CircRNAs in tumorigenesis and development，this paper is expected to provide new tumor markers and potential targets for tumor diagnosis and treatment.

Key words：circular RNA；internal ribosome entry site；protein；protein bait

Acta Acad Med Sin，2024，46（1）：72-81

環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA）是一類具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)閉合RNA分子，通常被認(rèn)為是一種非編碼RNA［1-2］。目前關(guān)于CircRNA的大部分研究主要聚焦于miRNA海綿和蛋白結(jié)合等非編碼RNA作用機(jī)制，如在最經(jīng)典的miRNA海綿機(jī)制中，CircRNA通過吸附miRNA來抑制miRNA與靶基因的結(jié)合，間接調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)來發(fā)揮作用［3］。隨著研究的深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)了在特定情況下可編碼蛋白的CircRNA，這為CircRNA的研究提供了新方向。本文將深入探討CircRNA蛋白編碼、與蛋白質(zhì)交互作用、翻譯蛋白質(zhì)等作用機(jī)制以及潛在臨床應(yīng)用。

1? CircRNA的概述

Sanger等［4］于1976年首先發(fā)現(xiàn)CircRNA。經(jīng)典的線性mRNA是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄并剪接去除內(nèi)含子形成的，CircRNA形成方式則不同，大多是通過反向剪接形成的，即CircRNA外顯子上游的3端跨過外顯子區(qū)域與其下游的5端相拼接，形成5-磷酸二酯鍵閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)RNA，小部分CircRNA是因傳統(tǒng)剪接中形成的套索結(jié)構(gòu)未降解，而形成閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)RNA［5-8］。已有研究表明CircRNA主要在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生，隨后被運(yùn)輸至不同的作用位點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮作用，而RNA結(jié)合蛋白、參與剪接的蛋白因子和內(nèi)含子互補(bǔ)元件可以通過互相配對(duì)來調(diào)節(jié)CircRNA的生成速率［7］。含有內(nèi)含子的CircRNA大多定位在細(xì)胞核內(nèi)，而具有外顯子的CircRNA則通過核酸長(zhǎng)度依賴的方式運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其中大于1300 nt的CircRNA由人類DExD-box解旋酶39B介導(dǎo)運(yùn)輸［9］。CircRNA降解由核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶介導(dǎo)，盡管反向剪接生成的CircRNA較少，但得益于共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可耐受核酸外切酶，故在時(shí)間累積下CircRNA在細(xì)胞內(nèi)有一定的豐度［10-12］。RNA甲基化修飾普遍存在方式是N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾，m6A修飾的CircRNA可以通過m6A閱讀蛋白YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2和熱反應(yīng)蛋白12被核糖核酸酶P-多藥耐藥性蛋白復(fù)合體降解［13］。除上述降解方式外，在病毒感染的情況下，CircRNA可以由病毒源性的雙鏈RNA激活的核糖核酸酶L降解［14］。CircRNA對(duì)于生物體的生長(zhǎng)調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生方面有著重要的作用，調(diào)控的作用機(jī)制主要包括miRNA海綿機(jī)制、蛋白海綿機(jī)制和與蛋白互作（如增強(qiáng)、支架、招募作用等）［15］。

隨著對(duì)CircRNA研究的進(jìn)展，越來越多的證據(jù)表明CircRNA在特定情況下也具有蛋白編碼的功能，具有編碼功能的CircRNA需要相對(duì)應(yīng)的密碼子，類似于其他蛋白編碼的mRNA，且序列保守性會(huì)比非編碼性CircRNA高［16］。與常規(guī)線性mRNA的帽依賴性翻譯機(jī)制不同，目前研究發(fā)現(xiàn)的CircRNA存在非帽依賴性的翻譯機(jī)制，這種非帽依賴性翻譯機(jī)制也是CircRNA是否能翻譯關(guān)鍵之一。

2? CircRNA編碼蛋白的機(jī)制

mRNA在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后需要進(jìn)行加工，通常在mRNA的5端處加帽，即5末端7-甲基鳥苷殘基帽結(jié)構(gòu)，并于3端被多聚腺苷酸化，生成poly A尾［17］。當(dāng)mRNA運(yùn)出細(xì)胞核進(jìn)入胞質(zhì)進(jìn)行翻譯時(shí)，便開啟帽依賴性翻譯的過程，當(dāng)帽結(jié)合蛋白真核生物翻譯起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eIF）4E結(jié)合至5末端7-甲基鳥苷殘基帽結(jié)構(gòu)處，就招募eIF4G和eIF4A組裝成eIF4F復(fù)合物，然后又和eIF3、eIF1、40S小核糖體亞單位等組合構(gòu)成43S預(yù)啟動(dòng)復(fù)合物，從5端非翻譯區(qū)識(shí)別起始密碼子，最后與60S大核糖體亞單位結(jié)合，開啟后續(xù)翻譯［18］。CircRNA中不存在5末端7-甲基鳥苷殘基帽結(jié)構(gòu)，無法以類似mRNA的帽依賴性翻譯機(jī)制啟動(dòng)翻譯，只能以非帽依賴性方式進(jìn)行翻譯，如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）、RNA甲基化修飾和滾環(huán)翻譯介導(dǎo)等的非帽依賴性機(jī)制啟動(dòng)翻譯［2，19］。

2.1? IRES介導(dǎo)的非帽依賴性翻譯起始

IRES是招募核糖體到mRNA內(nèi)部區(qū)域的一段核酸序列，最早在病毒中發(fā)現(xiàn)，IRES介導(dǎo)的翻譯有部分還需要翻譯起始因子（initiation factor，IF）和IRES反式作用因子（IRES trans-acting factor，ITAF）幫助［20］。通常來說結(jié)構(gòu)越是緊密的IRES需要較少的ITAF和IF進(jìn)行協(xié)助翻譯［18］。根據(jù)對(duì)IF和ITAF的需求，病毒IRES可被分成4組［21］。Ⅰ組病毒IRES通常具有很強(qiáng)的活性，不需要多余的ITAF和IF，僅憑借RNA序列形成假結(jié)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)直接與40S小核糖體亞單位相結(jié)合開始翻譯，少部分甚至可以從非起始密碼子開始翻譯［22］。Ⅱ組病毒IRES雖然也可以直接與40S小核糖體相結(jié)合，但同時(shí)需要幾個(gè)IF來協(xié)調(diào)。Ⅲ組和Ⅳ組兩組病毒IRES則不能直接與40S小核糖體結(jié)合，需要ITAF和IF來招募40S小核糖體亞單位，主要區(qū)別是Ⅲ組病毒IRES不需要40S小核糖體識(shí)別起始密碼子，直接可在IRES位點(diǎn)進(jìn)行翻譯，而Ⅳ組病毒IRES則需要識(shí)別起始密碼子，才能開始進(jìn)行翻譯［23］。

相較于病毒IRES，細(xì)胞內(nèi)IRES的發(fā)現(xiàn)則相對(duì)較晚，這是因?yàn)榧?xì)胞IRES介導(dǎo)的翻譯通常不如病毒IRES介導(dǎo)的翻譯有效，且細(xì)胞內(nèi)IRES介導(dǎo)的翻譯還受到多種復(fù)雜機(jī)制的調(diào)控［24-25］。雖然細(xì)胞內(nèi)的IRES發(fā)現(xiàn)較晚，但并不少見，任何只要大于50 nt的CircRNA都可能包含1個(gè)IRES六聚體存在，由此可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IRES介導(dǎo)的翻譯［26］。在細(xì)胞非應(yīng)激狀態(tài)下，IRES位點(diǎn)僅支持低水平的翻譯，而在有絲分裂、凋亡、缺氧等應(yīng)激情況下，帽依賴的細(xì)胞翻譯機(jī)制不能正常運(yùn)行時(shí)，IRES位點(diǎn)則可支持細(xì)胞穩(wěn)定翻譯，盡量維持細(xì)胞內(nèi)正常的生理活動(dòng)［20，25，27］。細(xì)胞IRES相較于病毒IRES擁有更少的RNA結(jié)構(gòu)和序列保守性，給細(xì)胞IRES的分類帶來了一定的難題，細(xì)胞IRES大致分為2類：（1）I型IRES是位于RNA上的順式作用元件，可以與ITAF結(jié)合，且與核糖體相互作用促進(jìn)翻譯；（2）Ⅱ型IRES也是位于RNA上的短順式元件，在距IRES起始位置大約40～60nt左右的位置有1個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA元件（stem-loop structured RNA element，SuRE）結(jié)構(gòu)，通過核糖體40S亞基中的18S rRNA與IRES相配對(duì)來促進(jìn)翻譯［20］（圖1）。

Ⅰ型IRES通常為一類RNA結(jié)合基序，可以募集ITAF，并進(jìn)一步募集核糖體進(jìn)行翻譯，ITAF大多為RNA結(jié)合蛋白，也是在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中穿梭的異質(zhì)核糖核蛋白組，可能與RNA轉(zhuǎn)錄加工之間存在干擾調(diào)控關(guān)系［24，28］。ITAF可以增加IRES和翻譯復(fù)合物之間的結(jié)合力，但具體介導(dǎo)IRES翻譯的機(jī)制尚不清晰，以下是2個(gè)可能的機(jī)制：（1）ITAF重塑IRES空間結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生更高的親和力；（2）ITAF可在mRNA和核糖體之間充當(dāng)橋梁關(guān)系，代替IF在mRNA和核糖體之間充當(dāng)橋梁關(guān)系［20，24-25］。已有研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于ITAF作用的9類途徑，如伴侶作用、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合、核質(zhì)易位、啟動(dòng)子依賴性募集、與IF相互作用、與核糖體相作用和作為核糖體固有成分等［29］。也有研究發(fā)現(xiàn)，ITAF在細(xì)胞內(nèi)分布的位置和數(shù)量是影響IRES活性的重要因素［30］。

Ⅱ型IRES，類似于細(xì)菌翻譯起始的Shine-Dalgarno序列，幫助招募18S RNA核糖體定位至核酸上［31］。Ⅱ型IRES最大的特征是在距IRES起始位置40～60 nt位置含有SuRE結(jié)構(gòu)，SuRE具有以位置依賴性和結(jié)構(gòu)依賴性方式促進(jìn)CircRNA非帽依賴性翻譯活動(dòng)的發(fā)生，具體機(jī)制為當(dāng)18S rRNA識(shí)別到SuRE時(shí)，可延緩CircRNA解旋，從而增加IRES上18S rRNA與核糖體18S rRNA互補(bǔ)的機(jī)會(huì)來促進(jìn)翻譯。SuRE結(jié)構(gòu)為CircRNA特有促進(jìn)翻譯的結(jié)構(gòu)，不存在于線性IRES中［31］。

2.2? m6A介導(dǎo)的非帽依賴性翻譯起始

CircRNA含有類似IRES的活性存在的m6A修飾位點(diǎn)共同基序，即RRm6ACH。這些位點(diǎn)主要集中在終止密碼子附近和長(zhǎng)的內(nèi)部外顯子上，并且在人類和鼠之間高度保守，有研究發(fā)現(xiàn)單個(gè)m6A位點(diǎn)足以驅(qū)動(dòng)非帽依賴性翻譯起始［32］。 在m6A介導(dǎo)的非帽依賴性翻譯起始中，YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白3負(fù)責(zé)讀取RNA序列的m6A甲基，讀取后招募eIF4G2以及核糖體等，促進(jìn)翻譯進(jìn)行（圖1），甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白3/14增強(qiáng)非帽依賴性翻譯效率，而去甲基化酶降低非帽依賴性翻譯效率。非帽依賴性翻譯效率在熱休克時(shí)上調(diào)，這可能是通過YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白2從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核中阻斷了去甲基化酶，提高了m6A水平，從而增強(qiáng)了翻譯效率［32］。

2.3? 滾環(huán)翻譯介導(dǎo)的非帽依賴性翻譯起始

滾環(huán)翻譯是指核糖體在CircRNA上無限滾動(dòng)翻譯，從而產(chǎn)生含有大量重復(fù)肽段蛋白質(zhì)的一種翻譯機(jī)制［33］。Abe等［34］在2013年首次發(fā)現(xiàn)病毒CircRNA可通過滾環(huán)翻譯機(jī)制來翻譯蛋白質(zhì)。在2015年，有研究證明真核細(xì)胞內(nèi)CircRNA也可通過滾環(huán)翻譯機(jī)制來翻譯蛋白質(zhì)［35］。不同于IRES和m6A介導(dǎo)的翻譯機(jī)制，滾環(huán)翻譯不需要CircRNA內(nèi)在特殊的啟動(dòng)因子，僅需憑借起始密碼子AUG就可以啟動(dòng)翻譯［2，19，36-37］。一般來說，可進(jìn)行滾環(huán)翻譯的CircRNA的核苷酸數(shù)量均為3的倍數(shù)［35］。CircRNA沒有現(xiàn)成的終止密碼子，存在無限開放閱讀框架（open reading frame，ORF），但已有研究證明CircRNA滾環(huán)翻譯可通過程序性-1核糖體移位方式產(chǎn)生終止密碼子，最終停止翻譯［38-40］。在滾環(huán)翻譯機(jī)制中，CircRNA僅含有起始密碼子AUG，且沒有終止密碼子存在，理論上核糖體可以在無限ORF中進(jìn)行無限循環(huán)翻譯，從而產(chǎn)生不同分子量的蛋白質(zhì)［35］（圖1）。

3? 驗(yàn)證CircRNA編碼蛋白的工具和實(shí)驗(yàn)

CircRNA通過特定的翻譯機(jī)制來編碼蛋白，在生物體內(nèi)可能有著十分重要的調(diào)控作用。常規(guī)對(duì)于CircRNA編碼能力的驗(yàn)證主要包括生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.1? 基于生物信息學(xué)對(duì)CircRNA編碼能力的預(yù)測(cè)

CircRNA可以非帽依賴性方式進(jìn)行翻譯，如IRES、m6A和滾環(huán)翻譯，除此之外，還需有ORF的存在，即從起始密碼子至終止密碼子的序列存在，才能完成精準(zhǔn)翻譯。一般來說，可翻譯CircRNA的ORF常常是大于100個(gè)密碼子的序列存在，但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，許多小于100個(gè)密碼子的短ORF也具有翻譯的能力。不同于線性mRNA，在CircRNA中ORF的范圍變異性很大，可跨過或不跨過反向剪接連接點(diǎn)，同時(shí)，ORF不僅可以有小于一圈的長(zhǎng)度存在，還可以有多圈的長(zhǎng)度存在。

CircRNA編碼能力預(yù)測(cè)主要是依賴于生物信息學(xué)工具對(duì)于IRES序列、m6A位點(diǎn)和ORF預(yù)測(cè)［26，32，41-43］。核糖體圖譜常用于對(duì)ORF進(jìn)行定位，在裂解RNA的情況下，依靠核糖體對(duì)20～30 nt片段RNA的保護(hù)（免于降解），通過鑒定這些片段（又稱為核糖體保護(hù)片段、核糖體足跡等），配合RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以定位到ORF的準(zhǔn)確位置，以此預(yù)測(cè)CircRNA編碼能力［44］。表1總結(jié)了對(duì)單個(gè)或整合CircRNA翻譯因素的部分預(yù)測(cè)工具。

3.2? 基于實(shí)驗(yàn)對(duì)CircRNA編碼能力的驗(yàn)證

預(yù)測(cè)CircRNA的翻譯能力后，仍需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證CircRNA編碼能力，檢驗(yàn)CircRNA與核糖體的結(jié)合情況、起始活性以及ORF的翻譯是主要的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證手段。

路徑1：IRES介導(dǎo)的非帽依賴性翻譯起始；路徑2：m6A介導(dǎo)的非帽依賴性翻譯起始；路徑3：滾環(huán)翻譯機(jī)制；IF：翻譯起始因子；ITAF：內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)反式作用因子；SuRE：莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA元件；Met：甲基；40S：核糖體40S小亞基；60S：核糖體60S大亞基；A：腺苷；YTHDF3：YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白3；4G2：翻譯起始因子4G2；4A：翻譯起始因子4A；4B：翻譯起始因子4B；ATG：起始密碼子

核糖體的驗(yàn)證主要是通過多聚核糖體分析技術(shù)，檢測(cè)結(jié)合的核糖體多少來判斷CircRNA編碼能力，RNA上結(jié)合的核糖體越多，在蔗糖密度梯度溶液當(dāng)中下沉的速率也就越快，RNA被翻譯的可能性就越大，收集不同密度層中富集的CircRNA，并進(jìn)行高通量測(cè)序，就可驗(yàn)證CircRNA的編碼能力［41-42］。

IRES元件的驗(yàn)證主要是通過測(cè)定預(yù)測(cè)的IRES是否有活性，來判斷CircRNA編碼能力，常常使用以下兩個(gè)報(bào)告系統(tǒng)：（1）反向切割綠色熒光蛋白片段的單外顯子CircRNA報(bào)告系統(tǒng)：可以經(jīng)反向剪接形成完整跨過反向剪接連接點(diǎn)的CircRNA，并編碼完整的綠色熒光蛋白，這樣可通過檢測(cè)綠色熒光蛋白的存在來判斷IRES是否具有翻譯起始活性；（2）完整海腎熒光素酶基因的自剪接報(bào)告系統(tǒng)：通過前體RNA體外自剪接形成的CircRNA，并編碼完整的綠色熒光蛋白，這樣可通過檢測(cè)轉(zhuǎn)錄出來的熒光信號(hào)來判斷IRES是否具有翻譯起始活性，主要用于體外實(shí)驗(yàn)［55］。

m6A位點(diǎn)的驗(yàn)證可以通過甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序直接篩選是否具有m6A修飾位點(diǎn)的存在，來判斷CircRNA編碼能力［56］。此外，Yang等［32］通過設(shè)計(jì)針對(duì)m6A位點(diǎn)的抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)可以確定m6A位點(diǎn)，從而鑒定含有內(nèi)源性m6A的CircRNA的存在。

滾環(huán)翻譯的驗(yàn)證可以通過ORF的序列分析，確定CircRNA是否存在無限ORF，來判斷IRES是否具有翻譯起始活性［33］。ORF是否能翻譯蛋白質(zhì)也是對(duì)CircRNA編碼能力的驗(yàn)證方法之一，對(duì)于蛋白質(zhì)的驗(yàn)證而言，質(zhì)譜分析是最為常用的高通量技術(shù)，也是蛋白質(zhì)組學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)［41，43，57］。聯(lián)合運(yùn)用質(zhì)譜分析與RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以有效用于ORF存在的鑒定實(shí)驗(yàn)［33，58］。研究者還可根據(jù)想要驗(yàn)證的ORF的特異序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的抗體，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，但應(yīng)注意當(dāng)所檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度過低時(shí)，常常會(huì)顯現(xiàn)出假陰性［59-60］。當(dāng)不能獲取對(duì)應(yīng)ORF抗體時(shí)，可以使用CPRIPR-CaS9基因編輯載入插入標(biāo)記基因（如GFP、Flag），翻譯后再利用免疫印跡法或免疫染色檢驗(yàn)標(biāo)記基因表達(dá)來驗(yàn)證，滾環(huán)翻譯機(jī)制產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，往往會(huì)在Western-blot結(jié)果中呈現(xiàn)依據(jù)CircRNA翻譯的圈數(shù)存在一定規(guī)律的蛋白條帶［39］。除了上述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)外，可以通過凝膠電泳和放射自顯影檢驗(yàn)CircRNA是否能夠在體外以35S-甲硫氨酸為原料翻譯蛋白質(zhì)，驗(yàn)證其翻譯能力［41，51］。

4? CircRNA翻譯蛋白的潛在作用機(jī)制

CircRNA編碼蛋白的作用方式分為4類：（1）蛋白誘餌；（2）與線性蛋白作用；（3）非癌性調(diào)節(jié)；（4）調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［62］。

4.1? 蛋白誘餌

CircRNA編碼的蛋白與線性編碼的蛋白具有同源性，提示兩者擁有相似的蛋白作用機(jī)制，CircRNA編碼蛋白質(zhì)會(huì)與線性同源編碼的蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合功能蛋白，如輔助因子或者效應(yīng)器，由此蛋白誘餌假說應(yīng)運(yùn)而生［43］。CircRNA編碼蛋白相對(duì)線性同源蛋白短，可能是由于缺少表面屏蔽結(jié)構(gòu)域，易暴露結(jié)合位點(diǎn)，從而擁有與線性同源物不一樣的活性，發(fā)揮更強(qiáng)蛋白誘餌作用［43］。蛋白誘餌假說有以下3個(gè)先決條件：（1）誘餌可以通過同源序列與功能蛋白配偶體相結(jié)合；（2）功能蛋白至少包含1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn)；（3）誘餌功效取決于配偶體的可及性，即兩者的亞細(xì)胞定位和相對(duì)濃度，因?yàn)镃ircRNA相對(duì)含量較少，CircRNA編碼蛋白濃度較線性同源蛋白低，所以推測(cè)CircRNA編碼蛋白具有更強(qiáng)的生物活性［43］。

通過蛋白誘餌機(jī)制，CircRNA編碼蛋白可以發(fā)揮促進(jìn)或抑制線性同源蛋白的作用。Circ-SHPRH編碼蛋白SHPRH-146aa與線性同源蛋白SHPRH具有結(jié)構(gòu)相似性，SHPRH-146aa可以與E3泛素連接酶競(jìng)爭(zhēng)相互作用來保護(hù)SHPRH免受其降解，以此來抑制腫瘤生長(zhǎng)［63］。Circ-AKT3由蛋白激酶B第3～7外顯子環(huán)化而成，編碼蛋白激酶B-174aa，蛋白激酶B-174aa作為一種腫瘤抑制因子，與蛋白激酶B競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1，可抑制蛋白激酶B的磷酸化，下調(diào)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［64］

4.2? 與線性蛋白作用

CircRNA編碼蛋白可以與線性同源蛋白相作用，發(fā)揮生物學(xué)作用。CircFGFR1可通過顯性負(fù)調(diào)控的方式來抑制應(yīng)激條件下的細(xì)胞增殖 ，一般情況下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合正常FRFR1二聚體胞外端段后，會(huì)使胞內(nèi)段自身磷酸化激酶結(jié)構(gòu)域活化，從而觸發(fā)下游信號(hào)通路，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而CircFGFR1p雖然也定位在細(xì)胞膜上，包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1二聚化和結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但缺乏激酶結(jié)構(gòu)域，所以當(dāng)CircFGFR1p與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1相結(jié)合時(shí)，胞內(nèi)端僅有1個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，無法自身活化，反而發(fā)揮顯性負(fù)調(diào)控作用，抑制細(xì)胞增殖［31］。CircGprc5a在膀胱腫瘤中高表達(dá)并編碼CircGprc5a肽發(fā)揮作用，G蛋白偶聯(lián)受體家族C5組成員A是一種在膀胱癌中高度表達(dá)CircGprc5a肽的線性同源蛋白，CircGprc5a肽可與G蛋白偶聯(lián)受體家族C5組成員A結(jié)合，具有促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞自我更新和轉(zhuǎn)移的功能［65］。

4.3? 非癌性調(diào)節(jié)

指在除癌癥之外的生理過程中的調(diào)節(jié)作用。 CircMbl是由甘露糖結(jié)合凝集素第2外顯子環(huán)化而形成的，通過非翻譯區(qū)內(nèi)的IRES介導(dǎo)啟動(dòng)翻譯，從而產(chǎn)生CircMbl編碼蛋白。CircMbl及其編碼蛋白存在于大腦突觸體中，可通過叉頭框O信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸功能［62］。Circ-ZNF609及其編碼蛋白存在于肌肉組織當(dāng)中，可特異性控制肌母細(xì)胞增殖［66］。

4.4? 調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

CircRNA參與調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響下游目標(biāo)，從而調(diào)節(jié)生物體的生理功能。CircPINT是由長(zhǎng)非編碼RNA-p53誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本的第2個(gè)外顯子環(huán)化形成，CircPINT編碼產(chǎn)生p53誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本-87aa，p53誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本-87aa主要定位在細(xì)胞核當(dāng)中，可通過與聚合酶相關(guān)因子復(fù)合物結(jié)合，使聚合酶相關(guān)因子復(fù)合物保持在靶基因啟動(dòng)子上發(fā)揮調(diào)控作用，從而抑制多個(gè)癌基因的轉(zhuǎn)錄［67］。CircHER2由人類表皮生長(zhǎng)因子受體2基因的第3～7個(gè)外顯子環(huán)化形成，在三陰性乳腺癌中顯著上調(diào)，CircHER2編碼蛋白可激活表皮生長(zhǎng)因子受體和促進(jìn)AKT磷酸化來促進(jìn)腫瘤增殖［68］。Circ-0000437編碼人冠蛋白1C-47aa功能肽，人冠蛋白1C-47aa通過與轉(zhuǎn)錄因子背景轉(zhuǎn)錄相關(guān)酸性卷曲蛋白3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分化，從而抑制血管生成和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)，具有一定的抗腫瘤作用［69］。

5? CircRNA編碼蛋白在腫瘤進(jìn)展中的作用

CircRNA編碼蛋白具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫調(diào)節(jié)等功能，CircRNA編碼蛋白調(diào)控功能失衡是許多疾病演進(jìn)的基礎(chǔ)，已有研究證明CircRNA編碼蛋白與腫瘤、心血管等多種疾病相關(guān)［3，15，70］。有文獻(xiàn)表明CircRNA編碼蛋白可以在胃腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CircRNA編碼蛋白不僅可以作為腫瘤標(biāo)志物用于胃腸腫瘤等的早期篩查和預(yù)后預(yù)測(cè)，也有望作為抗體藥物的靶點(diǎn)用于胃腸腫瘤等的治療［19，62，71-78］。

5.1? CircRNA編碼蛋白與胃癌

CircMAPK1可通過IRES位點(diǎn)編碼腫瘤抑制因子絲裂原活化蛋白激酶1-109aa，絲裂原活化蛋白激酶1-109aa與絲裂原活化蛋白激酶1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，可抑制絲裂原活化蛋白激酶1的磷酸化，從而進(jìn)一步抑制絲裂原活化蛋白激酶1下游信號(hào)通路的活化，發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用。Jiang等［71］發(fā)現(xiàn)CircMAPK1的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后情況正相關(guān)，可作為胃癌患者預(yù)后標(biāo)志物。 CircFNDC3B是由Ⅲ型纖維連接蛋白域蛋白3B基因的外顯子5～6環(huán)化反剪接而形成的，CircFNDC3B編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為25×103的蛋白，可降低E-鈣黏蛋白的表達(dá)，也可通過形成CircFNDC3B/胰島素樣生長(zhǎng)因子II mRNA結(jié)合蛋白3/白細(xì)胞分化抗原4三元復(fù)合物，促進(jìn)白細(xì)胞分化抗原44信使RNA的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)［72］。CircDIDO1編碼蛋白水平同樣也與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，如CircDIDO1可以編碼一個(gè)529aa蛋白，529aa蛋白通過與其線性同源蛋白死亡誘導(dǎo)終結(jié)因子1-1a競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，可抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶活性，影響胃癌患者預(yù)后情況［73］。CircAXIN1在胃癌中高表達(dá)并編碼軸蛋白1-295aa，軸蛋白1-295aa競(jìng)爭(zhēng)性地與腺瘤性大腸息肉病基因相作用，釋放出β-連環(huán)蛋白于核內(nèi)，與啟動(dòng)子的T細(xì)胞因子共識(shí)位點(diǎn)結(jié)合，從而誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，并激活Wnt信號(hào)通路，可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞進(jìn)展，也與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)［74］。

5.2? CircRNA編碼蛋白與結(jié)直腸癌

CircPPP1R12A可編碼翻譯一種功能蛋白肌球蛋白磷酸酶抗體-73aa，肌球蛋白磷酸酶抗體-73aa可通過激活Hippo-YAP通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用［75］。CircPLCE1編碼的磷脂酶Cε1-411蛋白不僅可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移，還可以與熱休克蛋白90α/核糖體蛋白S3復(fù)合物中的熱休克蛋白90α的腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使核糖體蛋白S3游離出來被泛素依賴性降解，降低核因子-κB核易位，進(jìn)而抑制了核因子-κB的活性，同樣也具有抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展的作用［76］。Circ-FNDC3B在結(jié)直腸癌中編碼一個(gè)218aa的蛋白，可抑制鋅指轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)二磷酸果糖激酶1的抗腫瘤作用，抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展［62］。CircMAPK14編碼的一個(gè)175aa的肽鏈，可通過蛋白誘餌機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合人絲裂原活化蛋白激酶6蛋白，從而減少絲裂原活化蛋白激酶14的核易位，并促進(jìn)叉頭框蛋白C1的泛素化降解，同樣也具有抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展的作用［77］。CircARHGAP35在結(jié)直腸癌組織中高度表達(dá)，并可以編碼一個(gè)長(zhǎng)達(dá)1289aa的蛋白，具有促癌作用［78］。

5.3? CircRNA編碼蛋白與其他腫瘤

CircFBXW7的編碼蛋白含F(xiàn)-框WD重復(fù)域蛋白7-185aa具有抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的作用，含F(xiàn)-框WD重復(fù)域蛋白7-185aa 可以競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合泛素特異性蛋白酶28，進(jìn)而避免其線性同源蛋白遭到去泛素化降解，而逃脫的FBXW7a則會(huì)誘導(dǎo)c-myc泛素降解，抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并減少癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［79］。此外，CircSHPRH、CircAKT3和CircPINT編碼蛋白也在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)程中起到抑制作用［63-64，67］。CircE-cadherin可以編碼出長(zhǎng)度為245個(gè)氨基酸的C-E-鈣黏蛋白，C-E-鈣黏蛋白憑借其尾部的14個(gè)氨基酸與表皮生長(zhǎng)因子受體作用，并促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子受體的磷酸化，從而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性表型的進(jìn)展，反而具有促癌作用［80］。CircSMO可編碼平滑蛋白-193aa ，平滑蛋白-193aa可以與其線性同源蛋白的N端相結(jié)合，促進(jìn)其膽固醇化，從而促進(jìn)Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)，增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的致癌性，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮促癌作用［81］。Circβ-catenin編碼的β-連環(huán)蛋白-370aa可通過蛋白誘餌機(jī)制競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合糖原合成酶激酶3β，從而保護(hù)β-連環(huán)蛋白免受磷酸化和泛素化，而避免降解的β-連環(huán)蛋白則會(huì)通過介導(dǎo)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展［82］。CircARHGAP35編碼蛋白可通過與細(xì)胞核內(nèi)的反式作用因子Ⅱ-I蛋白相互作用也促進(jìn)肝癌細(xì)胞的進(jìn)展［78］。CircMRPS35在肝癌中高表達(dá)，與順鉑化療的耐藥性高度相關(guān)，影響化療的效果［80］。有研究發(fā)現(xiàn)由CircMRPS35編碼的CircMRPS35-168aa可以抵消順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3，從而產(chǎn)生耐藥性［83］。

6? 總結(jié)

本綜述分別回顧了CircRNA的特性、翻譯機(jī)制、與CircRNA翻譯相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、CircRNA編碼蛋白的作用機(jī)制以及與腫瘤關(guān)聯(lián)的5方面最新進(jìn)展。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，CircRNA編碼蛋白為我們打開了人類蛋白質(zhì)組學(xué)的大門，增強(qiáng)了我們對(duì)CircRNA在人類腫瘤中重要性的認(rèn)識(shí)，越來越多的證據(jù)表明CircRNA可以通過非帽依賴性的方式來翻譯蛋白，并在腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。盡管CircRNA編碼蛋白在腫瘤患者的臨床診斷和治療方面具有巨大的潛力，但下面一系列難題仍未完全厘清：（1）具備翻譯潛能的CircRNA特征尚未闡明；（2）CircRNA的其他翻譯機(jī)制尚待發(fā)現(xiàn)；（3）CircRNA編碼蛋白的作用機(jī)制仍待探索；（4）如何避免無義蛋白干擾，純化短肽的相關(guān)技術(shù)尚需完善，待我們進(jìn)一步研究。

利益沖突? 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明? 江杰：數(shù)據(jù)文獻(xiàn)搜集閱讀并起草文章；羅再：文章選題并修改文章；張昊亮：圖表制作并起草文章；裘正軍、黃陳：文章設(shè)計(jì)并修訂文章并同意対研究工作誠(chéng)信負(fù)責(zé)

參? 考? 文? 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-01-17）