韓延超,陳慧芝,2,牛 犇,2,張小栓,韓樹(shù)人,王曉艷,王冠楠,劉瑞玲,郜海燕,

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所,全省生鮮食品智慧物流與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021; 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院,北京 100083; 4.鮮豐水果股份有限公司,浙江 杭州 310000)

藍(lán)莓中花青素含量較高且種類(lèi)豐富,有研究表明藍(lán)莓中的花青素含量是所有蔬菜和水果中最高的,主要集中在其紫色果皮部位[1]。藍(lán)莓花色苷具有抗氧化、改善視力等功能特性,深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。隨著我國(guó)果蔬電商物流產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展,藍(lán)莓遠(yuǎn)距離銷(xiāo)售的需求迅速增加,但是物流過(guò)程中振動(dòng)易造成藍(lán)莓腐敗、衰老等現(xiàn)象,外在因素的變化極易導(dǎo)致花色苷降解,影響藍(lán)莓果實(shí)的貯藏品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。藍(lán)莓在物流過(guò)程中容易遭受振動(dòng)脅迫,花色苷積累加速,振動(dòng)時(shí)間越久,達(dá)到峰值的時(shí)間越短,隨后降解速度也越快[3]。

花色苷是天然水溶性色素,廣泛存在于植物的花、果實(shí)、種子和葉片中,屬黃酮多酚類(lèi)化合物。它主要是通過(guò)苯丙烷類(lèi)代謝和類(lèi)黃酮途徑進(jìn)行生物合成,合成過(guò)程中重要酶有苯丙氨酸解氨酶(PAL)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)等,而參與花色苷降解的酶有花色苷-β-糖苷酶、多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)[4]。果蔬花色苷的代謝與基因表達(dá)有關(guān),通過(guò)促進(jìn)或抑制花色苷合成和降解基因的表達(dá)能夠延緩貯藏過(guò)程中花色苷的降解。在葡萄[5]、無(wú)花果[6]、藍(lán)莓[7]等果實(shí)中研究發(fā)現(xiàn),PAL、UFGT、DFR等基因表達(dá)與花色苷的合成密切相關(guān),說(shuō)明花色苷積累與苯丙烷代謝和類(lèi)黃酮合成途徑中的酶活性密切相關(guān)。Li等[8]研究也發(fā)現(xiàn),黃酮醇和原花青素的合成在草莓成熟過(guò)程中受抑制,而蔗糖處理上調(diào)了除FaF3′H之外的類(lèi)黃酮途徑相關(guān)基因表達(dá),加快花青素積累。POD、PPO和花色苷-β-糖苷酶是花色苷降解過(guò)程中的重要酶,可以抑制降解酶基因的表達(dá),延緩果蔬花色苷的降解。Fang等[9]研究表明,熱處理引發(fā)荔枝果實(shí)快速褐變和花青素?fù)p失,而熱酸處理通過(guò)降低花青素降解酶活性及LcPOD基因表達(dá),使荔枝果皮酸化從而達(dá)到護(hù)色目的。

本文主要研究物流振動(dòng)對(duì)藍(lán)莓花色苷組分和花色苷代謝相關(guān)酶活性的影響,并探究振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓貯藏過(guò)程中花色苷合成和降解相關(guān)基因表達(dá)的影響,闡明物流振動(dòng)對(duì)花色苷的作用機(jī)理,為后續(xù)研發(fā)藍(lán)莓物流過(guò)程中的花色苷等品質(zhì)保持技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

本文采用的實(shí)驗(yàn)原料為藍(lán)美人品種藍(lán)莓,采摘于浙江新昌兆豐生態(tài)園。果實(shí)于溫度較低的清晨采摘,挑選大小均勻、成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷的藍(lán)莓果實(shí)30 kg,置于4 ℃保鮮庫(kù)預(yù)冷待用。

試劑:乙醇、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、氯化鐵、福林酚、濃鹽酸、抗壞血酸、磷酸、碳酸鈉、沒(méi)食子酸、氫氧化鈉、硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鉀、醋酸鈉、冰醋酸,所有試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀,美國(guó)WATERS公司;SpectraMax M2酶標(biāo)分析儀,美國(guó)Molecular Devices公司; BioSpec-nano超微量分光光度計(jì),日本島津;Mastercycler nexus恒溫?cái)U(kuò)增PCR儀,Eppendorf生命科技有限公司;StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國(guó)Thermo Fisher Science公司。

1.3 振動(dòng)實(shí)驗(yàn)

模擬車(chē)輛高速路面行駛,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中大部分藍(lán)莓有輕微振動(dòng)現(xiàn)象,設(shè)置振動(dòng)頻率4 Hz,物流振動(dòng)中藍(lán)莓最大可承受時(shí)間18 h為振動(dòng)組,未振動(dòng)脅迫為對(duì)照組。樣品貯藏在4 ℃恒溫箱中,每4 d取樣一次,貯藏期24 d。

1.4 花色苷組分及含量測(cè)定

參考Hutabarat等[10]的方法,通過(guò)HPLC分析花色苷組分。稱(chēng)取1 g藍(lán)莓果實(shí)樣品,以料液比1∶20加入含0.2% HCl的60%乙醇溶液,離心取上清,過(guò)濾后用于HPLC分析。C18反相色譜柱,柱溫:25 ℃,流速:0.6 mL·min-1,進(jìn)樣體積:10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng):520 nm,流動(dòng)相A:1%磷酸溶液,流動(dòng)相B:100%乙腈。

1.5 花色苷代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

PAL活性測(cè)定:稱(chēng)取5 g藍(lán)莓樣品,加5 mL提取緩沖液(40 g·L-1PVP、2 mmol·L-1EDTA、5 mmol·L-1β巰基乙醇),離心后上清液低溫保存,取2支試管加入3 mL 50 mmol·L-1pH 8.8硼酸緩沖液和0.5 mL苯丙氨酸溶液,分別加入0.5 mL酶提取液和煮沸5 min失活的酶液,37 ℃保溫60 min,結(jié)束后加入0.1 mL 6 mmol·L-1HCl終止反應(yīng),290 nm處測(cè)定吸光度值。以每克藍(lán)莓鮮樣每分鐘吸光度值增加0.01為一個(gè)活性單位U,單位用U·g-1表示。CHI、DFR、UFGT和花色苷-β-糖苷酶活性測(cè)定:分別使用CHI、DFR、UFGT酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒測(cè)定。POD、PPO活性測(cè)定:參考曹建康等[11]、黃欣莉等[12]、嚴(yán)銳等[13]的方并略作改動(dòng)。POD活性測(cè)定具體方法如下: 取 1.0 g 藍(lán)莓果品樣品于 10 mL 離心管,加 入5 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液(Solabio),12 000 r·min-1離心25 min,取上清液(粗酶液)。 反應(yīng)體系:0.3 mL粗酶液,0.3 mL 6 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚,2.4 mL 5 mmol·L-1H2O2。反應(yīng) 15 s 后,測(cè)定470 nm 處 3 min 內(nèi)的吸光度值變化。PPO活性測(cè)定具體方法如下:取1 g藍(lán)莓果實(shí),充分研磨,加入5 mL 0.1 mol·L-1磷酸鈉緩沖液,混勻,12 000 r·min-1離心20 min,收集上清液(粗酶液)。采用1.0 mL 0.05 mol·L-1鄰苯二酚、4.0 mL磷酸鈉緩沖液和200 μL粗酶液,混勻,于25 ℃水浴30 s,以磷酸鈉緩沖液為空白對(duì)照,測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處的吸光度,每30 s記錄1 次。以每克樣品在每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶活力單位(U),單位為U·g-1,重復(fù)3 次。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)

本實(shí)驗(yàn)選擇已知的歐洲越橘GAPDH(VcGAPDH)作為內(nèi)參基因,通過(guò)Primer 5.0設(shè)計(jì)藍(lán)莓花色苷代謝相關(guān)酶基因引物,杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行引物合成(表1)。對(duì)合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè),條帶清晰單一且無(wú)二聚體,可進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn),檢驗(yàn)引物熔解曲線單一(無(wú)特異性產(chǎn)物)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)具體參考我們前面的方法[14-15]。反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Green PCR Supermix 10 μL,5 μmol·L-1上游和下游熒光定量引物 各1 μL,cDNA 模板 1 μL,加 ddH2O到20 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性 4 min,然后進(jìn)行如下循環(huán):94 ℃變性 5 s,55 ℃退火 10 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Fluorescent quantitative PCR primer sequence

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析,采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行Duncan顯著性分析(P<0.01,表示差異極顯著;P<0.05,表示差異顯著)。使用Graphpad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷組分及含量的影響

如表2所示,各單體花色苷含量隨貯藏時(shí)間呈先上升后下降的趨勢(shì),振動(dòng)脅迫組各單體花色苷含量大部分在貯藏8 d時(shí)達(dá)到峰值,而對(duì)照組則大部分在貯藏16 d時(shí)花色苷積累量最多,因此振動(dòng)脅迫能夠加速各花色苷單體含量峰值的到達(dá),貯藏后期振動(dòng)脅迫組各組分含量顯著低于對(duì)照組,貯藏24 d時(shí),各花色苷組分含量最低。藍(lán)莓貯藏過(guò)程中錦葵色苷含量最高,其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高,對(duì)照組和振動(dòng)組中其含量分別在16 d和8 d達(dá)到最高值8 719.88 μg·g-1和10 746.69 μg·g-1,分別占總量的72.67%和76.49%,而芍藥素-3-葡萄糖苷含量最少,其對(duì)照組和振動(dòng)組分別在貯藏24 d和8 d達(dá)到最高點(diǎn),含量?jī)H22.25 μg·g-1和25.66 μg·g-1,僅占總量的0.51%和1.82%。

通過(guò)HPLC分析共檢測(cè)出10種花色苷單體,使用SMICA-P 14.1軟件對(duì)花色苷組分進(jìn)行PCA主成分分析,如圖1所示,第一主成分和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為70.6%和10.4%。對(duì)照組多分布在第三、四象限而振動(dòng)脅迫組主要分布在第一和第二象限,說(shuō)明振動(dòng)對(duì)花色苷組分具有一定的影響。

圖1 對(duì)照和振動(dòng)脅迫藍(lán)莓花色苷組分變化的PCA得分圖Fig.1 PCA score diagram of anthocyanin components of blueberry under control and vibration stress

2.2 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶活性的影響

如圖2所示,藍(lán)莓采后貯藏過(guò)程中PAL活性呈先升后降趨勢(shì),對(duì)照組在貯藏20 d時(shí),PAL活性達(dá)到最高,為162.30 U·g-1,振動(dòng)組在貯藏4 d時(shí),PAL活性達(dá)到最高(170.05 U·g-1)。貯藏后期,振動(dòng)組PAL活性顯著低于對(duì)照組,貯藏24 d時(shí),PAL活性最低,僅141.68 U·g-1。藍(lán)莓CHI活性隨貯藏時(shí)間整體呈先上升后下降的趨勢(shì),對(duì)照組在貯藏16 d時(shí),CHI活性最高8.69 U·g-1,隨后開(kāi)始下降,24 d時(shí)活性僅6.74 U·g-1;振動(dòng)脅迫組在貯藏第8 d時(shí),CHI活性達(dá)到最高點(diǎn)(8.92 U·g-1),24 d時(shí)活性下降為5.56 U·g-1。藍(lán)莓貯藏過(guò)程中DFR活性先上升后下降,貯藏16 d以前, DFR活性變化較為平緩,貯藏16 d時(shí)達(dá)到最大值,隨后迅速下降,至24 d時(shí),對(duì)照組和振動(dòng)組DFR活性分別為98.81 U·g-1和75.34 U·g-1,相比最高點(diǎn)下降了33.28%和49.87%。貯藏后期,振動(dòng)脅迫極顯著抑制了藍(lán)莓DFR活性。藍(lán)莓UFGT活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降趨勢(shì),貯藏8 d時(shí),振動(dòng)組活性達(dá)到最高,為20.03 U·g-1,顯著高于對(duì)照組,隨后開(kāi)始下降,貯藏20 d時(shí),活性最低,為16.24 U·g-1,相比最高點(diǎn)下降了11.98%;而貯藏后期對(duì)照組UFGT活性極顯著高于振動(dòng)組,貯藏20 d時(shí),對(duì)照組活性最高為18.85 U·g-1,比貯藏0 d上升了7.48%。

*或**分別表示與對(duì)照相比差異達(dá)顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。下同。* or ** represents the significant (P<0.05) or very significant(P<0.01) difference compared with the control. The same as below.圖2 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶活性的影響Fig.2 Effect of vibration stress on anthocyanin synthesis related enzymes activity of blueberry

2.3 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶活性的影響

如圖3所示,在藍(lán)莓貯藏過(guò)程中,對(duì)照組花色苷-β-糖苷酶活性整體呈下降趨勢(shì),貯藏24 d時(shí)活性為4.08 U·mg-1,相比0 d下降了33.87%;而振動(dòng)脅迫組花色苷-β-糖苷酶活性整體呈先上升后下降趨勢(shì),貯藏4 d時(shí)活性達(dá)到最高點(diǎn)6.58 U·mg-1,極顯著高于對(duì)照組,隨后迅速下降,貯藏24 d時(shí)活性下降為3.60 U·mg-1,比對(duì)照組低11.76%。藍(lán)莓貯藏過(guò)程中,POD活性隨藍(lán)莓果實(shí)成熟衰老,不斷下降。貯藏0 d時(shí),振動(dòng)組POD活性為8.89 U·g-1,為對(duì)照組的1.4倍,貯藏前4 d,振動(dòng)組POD活性極顯著高于對(duì)照組,隨后振動(dòng)組POD活性迅速下降至貯藏8 d的4.56 U·g-1,之后其活性變化趨于平緩;而對(duì)照組在整個(gè)貯藏過(guò)程POD活性極顯著低于振動(dòng)組,貯藏24 d時(shí)其活性最低僅0.94 U·g-1,比振動(dòng)組低2.66 U·g-1。在藍(lán)莓果實(shí)貯藏期間,PPO活性呈下降趨勢(shì),振動(dòng)組PPO活性顯著高于對(duì)照組,貯藏0 d時(shí),振動(dòng)組和對(duì)照組PPO活性分別為8.35 U·g-1和5.41 U·g-1;貯藏前期振動(dòng)組PPO活性下降趨勢(shì)較為明顯,12 d時(shí),其活性為4.32 U·g-1,下降48.26%,12 d以后趨于平緩;而對(duì)照組整個(gè)貯藏過(guò)程PPO活性下降趨勢(shì)較為平緩,0 d到24 d活性下降了41.22%。與對(duì)照組相比,振動(dòng)脅迫組PPO活性較高,能夠加速花色苷降解。

圖3 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶活性的影響Fig.3 Effect of vibration stress on to anthocyanin degradation related enzymes activity of blueberry

2.4 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)基因VcPAL1和VcPAL2在貯藏過(guò)程中的表達(dá)情況如圖4所示,隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)藍(lán)莓VcPAL1和VcPAL2基因表達(dá)變化趨勢(shì)一致,相對(duì)于貯藏初期出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨向,其中對(duì)照組VcPAL1和VcPAL2基因相對(duì)表達(dá)量分別在12 d和16 d最高,而振動(dòng)組藍(lán)莓VcPAL1和VcPAL2基因則均在8 d時(shí)達(dá)到最高點(diǎn),貯藏后期振動(dòng)組VcPAL1和VcPAL2基因相對(duì)表達(dá)量逐漸下降且極顯著低于對(duì)照組。

圖4 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷合成相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of vibration stress on relative expression of anthocyanin synthesis enzymes related genes in blueberry

由圖4可知,對(duì)照組藍(lán)莓在貯藏期間VcDFR1、VcDFR2和VcDFR3基因相對(duì)表達(dá)量均呈先上升后下降趨向,均在貯藏16 d時(shí)表達(dá)量最高。振動(dòng)組VcDFR1和VcDFR2基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致,在貯藏前8 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量上升達(dá)到最高值,隨后開(kāi)始下降,貯藏16 d到24 d振動(dòng)組VcDFR1和VcDFR2基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組。而振動(dòng)組VcDFR3基因相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于貯藏初期逐漸上調(diào),貯藏8 d開(kāi)始其VcDFR3基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組,振動(dòng)脅迫顯著抑制貯藏后期VcDFR基因的表達(dá)。

藍(lán)莓貯藏過(guò)程中VcCHI1和VcCHI2基因表達(dá)量的變化如圖4所示,對(duì)照組VcCHI1基因相對(duì)表達(dá)量逐漸上調(diào),而振動(dòng)組VcCHI1基因表達(dá)量在貯藏前12 d上調(diào)且其表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組,貯藏后期振動(dòng)組VcCHI1基因表達(dá)逐漸下調(diào)且極顯著低于對(duì)照組。對(duì)照組和振動(dòng)脅迫組VcCHI2基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致,均隨貯藏時(shí)間逐漸上升,但是貯藏后期振動(dòng)組VcCHI2基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。振動(dòng)誘導(dǎo)了貯藏前期VcCHI1基因的表達(dá),也抑制了貯藏后期VcCHI1和VcCHI2基因的表達(dá)。

VcUFGT表達(dá)量在對(duì)照和振動(dòng)脅迫組中變化一致,均呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì),分別在貯藏16 d和8 d最高,與初始值相比分別上調(diào)了74.42和67.53%。在貯藏前期4～8 d振動(dòng)組VcUFGT基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01),16 d和20 d表達(dá)量下降且極顯著低于對(duì)照組。振動(dòng)脅迫誘導(dǎo)貯藏前期VcUFGT基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào),加速貯藏前期花色苷的積累。

2.5 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓貯藏期間VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3基因相對(duì)表達(dá)量的影響如圖5所示,對(duì)照和振動(dòng)脅迫組VcPOD2表達(dá)量均呈現(xiàn)先升后降趨向,在貯藏8 d達(dá)到最高峰;而VcPOD1和VcPOD3表達(dá)量隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低,VcPOD1基因在貯藏20 d和24 d時(shí)的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,VcPOD3表達(dá)量從8 d開(kāi)始極顯著高于對(duì)照組。對(duì)照組VcPPO1表達(dá)量隨貯藏時(shí)間逐漸下降,而振動(dòng)脅迫組VcPPO1呈先上調(diào)后下調(diào)趨勢(shì),貯藏8 d表達(dá)量最高。VcPPO2在藍(lán)莓貯藏過(guò)程中的表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì),但是與對(duì)照組相比,振動(dòng)組極顯著抑制了VcPPO2基因的表達(dá)。

圖5 振動(dòng)脅迫對(duì)藍(lán)莓花色苷降解相關(guān)酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of vibration stress on relative expression of anthocyanin degradation enzymes related genes in blueberry

3 討論

藍(lán)莓果實(shí)采后貯藏過(guò)程中,隨著果實(shí)的成熟,藍(lán)莓花色苷含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),但其花色苷種類(lèi)沒(méi)有明顯的變化。在本實(shí)驗(yàn)所用藍(lán)美人品種藍(lán)莓果實(shí)中共檢測(cè)到5種花青素,其中以錦葵色素為主,芍藥色素含量最少。此結(jié)果與南京市種植的兔眼藍(lán)莓中測(cè)到的花青素種類(lèi)相似[10]?；ㄉ罩饕怯苫ㄇ嗨睾蛦翁擎I合而成,本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的花青素主要被葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖糖基化形成10種花色苷單體,其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高。Li等[16]通過(guò)對(duì)藍(lán)莓中花青素的HPLC和主成分分析發(fā)現(xiàn),17種不同品種花色苷?qǐng)D譜相似,但其占比取決于種類(lèi),而檢測(cè)到的花色苷主要有錦葵苷、飛燕草苷和矮牽牛苷,分別占比41.0%、33.1%、17.3%,占總花色苷含量的90%以上。在貯藏過(guò)程中藍(lán)莓花色苷含量呈先上升后下降的趨勢(shì),對(duì)照組和振動(dòng)脅迫組花色苷總量分別在16 d和8 d時(shí)達(dá)到峰值,各組分含量也隨之發(fā)生變化,振動(dòng)組處理加速了花色苷含量峰值的到達(dá),隨后下降過(guò)程中,其含量顯著低于對(duì)照組。

PAL是花色苷生物合成途徑的第一個(gè)酶。王惠聰?shù)萚17]發(fā)現(xiàn),荔枝果皮中花色苷含量與PAL活性沒(méi)有相關(guān)性;邱雪[4]和黎歡歡等[18]研究表明,PAL活性與花色苷含量變化呈顯著正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PAL活性與花色苷含量變化相似,均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),貯藏前期活性較高,藍(lán)莓果實(shí)開(kāi)始大量合成類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì),貯藏后期振動(dòng)組PAL活性下降迅速,振動(dòng)脅迫加快了花色苷的合成進(jìn)程,后期花色苷分解加快花色苷含量逐漸下降,PAL活性隨之下降,說(shuō)明PAL是花色苷合成途徑的重要酶。Feng等[19]研究表明,CHI與花青素的合成密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中,花色苷含量呈先上升后下降的趨勢(shì),而CHI、DFR、UFGT活性變化與花色苷含量變化相似,振動(dòng)脅迫組PAL、CHI、DFR、UFGT活性在貯藏8 d左右達(dá)到最高點(diǎn),隨后開(kāi)始下降,貯藏后期振動(dòng)組花色苷合成酶活性顯著低于對(duì)照組。因此,CHI、DFR、UFGT可能都是花色苷合成途徑的重要酶。Lister等[20]研究發(fā)現(xiàn),在蘋(píng)果生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,CHI僅在蘋(píng)果果皮發(fā)生轉(zhuǎn)色時(shí),其活性與花色苷變化協(xié)同。王惠聰?shù)萚17]通過(guò)研究荔枝果皮中花色苷含量以及PAL、DFR、CHI、UFGT等活性變化發(fā)現(xiàn),僅有UFGT活性變化與花色苷合成趨勢(shì)相吻合。劉曉靜[21]和王慶菊等[22]也研究發(fā)現(xiàn),DFR活性變化與花色苷含量呈正相關(guān),說(shuō)明DFR能夠加速花色苷的合成。

花色苷不能直接作為PPO和POD的底物,必須在兒茶酚等酚類(lèi)物質(zhì)以及過(guò)氧化氫的存在下,花青素才能被PPO和POD降解[23-24]。在藍(lán)莓貯藏過(guò)程中對(duì)照組和振動(dòng)組PPO、POD和花色苷-β-糖苷酶活性隨貯藏時(shí)間逐漸下降,且振動(dòng)組PPO和POD活性顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明振動(dòng)脅迫加速了花色苷降解。Fang等[9]通過(guò)研究荔枝果皮中花色苷降解發(fā)現(xiàn),貯藏過(guò)程中荔枝果皮POD、PPO和花色苷-β-糖苷酶活性逐漸下降,熱酸處理與對(duì)照相比顯著降低了降解酶活性,保護(hù)了荔枝果皮顏色。

花色苷是在植物次生代謝過(guò)程中通過(guò)苯丙烷代謝和類(lèi)黃酮合成途徑產(chǎn)生,花色苷的生物合成涉及到多種結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因[25]。本實(shí)驗(yàn)探究了花色苷合成和降解相關(guān)13種結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)大部分基因表達(dá)與相關(guān)酶活性變化相對(duì)應(yīng)。在藍(lán)莓貯藏過(guò)程中花色苷合成相關(guān)VcPAL1、VcPAL2、VcDFR1、VcDFR2、VcCHI1、VcUFGT等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)均呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì),與對(duì)照組相比振動(dòng)脅迫誘導(dǎo)了藍(lán)莓貯藏前期各結(jié)構(gòu)基因表達(dá),從而調(diào)控相關(guān)酶活性上升,加速貯藏前期花色苷積累。貯藏16 d開(kāi)始到貯藏結(jié)束,振動(dòng)脅迫組VcPAL1、VcPAL2、VcDFR1、VcDFR2、VcDFR3、VcCHI1、VcCHI2以及VcUFGT等基因表達(dá)下調(diào)且顯著低于對(duì)照組,對(duì)應(yīng)相關(guān)酶活性下降,花色苷合成減弱。在貯藏過(guò)程中花色苷合成相關(guān)酶基因表達(dá)量變化差異較大則說(shuō)明VcPAL、VcDFR、VcCHI以及VcUFGT等基因在花色苷合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用,調(diào)控花色苷的合成并具有一定的特異性[26-27]?；ㄉ丈锖铣上嚓P(guān)基因的表達(dá)通常需要上游轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控[28]。Yang等[29]研究發(fā)現(xiàn),VuCHS、VuDFR、VuUFGT等花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá),在白色漿果中顯著下調(diào),與花青素合成密切相關(guān)。Liu等[30]發(fā)現(xiàn),光敏轉(zhuǎn)錄因子PybZIPa通過(guò)識(shí)別G-box基序,結(jié)合并激活PyUFGT表達(dá),從而調(diào)控梨皮中花青素的積累。

振動(dòng)脅迫使藍(lán)莓貯藏后期花色苷合成減弱,加速花色苷的降解。目前花色苷降解途徑并不明確,但是有研究表明花色苷-β-糖苷酶、PPO和POD這3種酶能夠參與花色苷降解,可通過(guò)抑制酶活性減少花青素?fù)p失[9,31]。我們通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3、VcPPO1和VcPPO2基因的表達(dá)量,結(jié)果表明,振動(dòng)脅迫組VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3、VcPPO1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,抑制花色苷降解酶POD、PPO活性下降,加速花色苷降解。

4 結(jié)論

我們的研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)莓果實(shí)中有10種花色苷單體,其中錦葵素-3-阿拉伯糖苷含量最高。在藍(lán)莓貯藏前期,振動(dòng)脅迫加速了花色苷的積累,顯著提高了PAL和UFGT活性;而貯藏后期,振動(dòng)組PAL、CHI、DFR、UFGT活性均顯著低于對(duì)照組,同時(shí)振動(dòng)脅迫延緩了花色苷降解相關(guān)的POD、PPO和花色苷-β-糖苷酶活性的下降。振動(dòng)脅迫誘導(dǎo)了藍(lán)莓貯藏前期花色苷合成相關(guān)基因VcPAL1、VcDFR2、VcCHI1、VcUFGT的表達(dá),提前了基因表達(dá)量峰值的到達(dá),在貯藏后期顯著下調(diào)了花色苷合成相關(guān)酶基因的表達(dá);振動(dòng)脅迫顯著促進(jìn)了藍(lán)莓貯藏過(guò)程中花色苷降解相關(guān)VcPOD1、VcPOD2、VcPOD3和VcPPO1等的基因表達(dá)。