侯 棟,李亞莉,岳宏忠,張東琴,姚 拓,黃書超,楊海興

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,甘肅 蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅 蘭州 730070; 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,甘肅 蘭州 730070; 4.甘肅省榆中縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,甘肅 榆中 730070)

蔬菜在我國居民飲食中占據(jù)重要地位,蔬菜生產(chǎn)是農(nóng)民重要的經(jīng)濟來源和農(nóng)業(yè)重要的經(jīng)濟支柱[1]。近年來,我國蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[2],但隨著蔬菜栽培年限的增長和化肥的過量使用,一些蔬菜地的土壤理化性狀惡化,引致蔬菜產(chǎn)品品質(zhì)下降,硝酸鹽和亞硝酸鹽含量超標(biāo),嚴(yán)重制約蔬菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。

微生物肥料,又稱菌肥、生物肥料、微生物接種劑,是指含有有益微生物,以特定微生物的生命活動使作物獲得肥效的微生物制品[4]。研究表明,微生物菌肥可能是替代化肥最具潛力的綠色肥料之一[5]。植物根際存在著促生菌(PGPR),這類菌大多數(shù)可以固定空氣中的氮氣,一些菌還兼具溶解土壤中不能被植物直接吸收利用的磷素、分泌植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(如生長素和赤霉素等)、促進(jìn)植物根系生長和礦物質(zhì)吸收、增強植物抗病性等功能[6]。利用從不同環(huán)境、不同植物根際分離篩選的優(yōu)良促生菌研制的生物菌肥既具有肥效作用,還可以減少生產(chǎn)中因使用農(nóng)藥、化肥而帶來的環(huán)境和食品污染及非再生能源消耗。于健等[7]研究發(fā)現(xiàn),微生物菌肥部分替代化肥可顯著提高番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。岳宏忠等[8]研究發(fā)現(xiàn),微生物菌劑與化肥配施能夠在不減產(chǎn)的前提下提高土壤細(xì)菌多樣性和土壤有益菌的相對豐度。蔣永梅等[9]研究表明,優(yōu)良的PGPR菌株對青?；ㄒ说纳L具有良好的促進(jìn)效果。李杰等[10]用生物肥部分替代化肥,結(jié)果發(fā)現(xiàn),減施20%化肥配施生物肥可在不影響花椰菜產(chǎn)量的同時,顯著改善花椰菜的品質(zhì),提高肥料利用率和光合效率。李鳳霞等[11]的研究也證實,微生物菌肥能夠顯著提高花椰菜的產(chǎn)量。

花椰菜具有很好的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值,是甘肅省高原夏菜主要種植的蔬菜種類之一。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,以試驗當(dāng)?shù)爻Ｓ没适┯昧繛榛鶞?zhǔn),研究微生物肥源部分替代化肥對花椰菜生長、品質(zhì)和產(chǎn)量的影響,以期為化肥減量、土壤保育和蔬菜品質(zhì)提升提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花椰菜品種為小米粒100,系青梗散花型花椰菜,由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所花椰菜課題組提供。

本試驗采用壟膜溝灌栽培模式,定植前整地作畦,溝深20 cm,溝寬30 cm,壟寬40 cm。供試土壤的基本理化性狀如下:pH值8.2,全鹽量0.046%,有機質(zhì)含量19.9 g·kg-1,堿解氮含量123.3 mg·kg-1,速效鉀含量154.3 mg·kg-1,有效磷含量23.1 mg·kg-1,全磷含量0.8 mg·kg-1,全鉀含量20.9 mg·kg-1,全氮含量1.4 mg·kg-1。

供施肥料系蔬菜專用硫基長效復(fù)合肥(N質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%,P2O5質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%,K2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%),由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所研制。

微生物菌劑含4種PGPR菌株,有效活菌數(shù)≥108CFU·g-1,生產(chǎn)單位為甘肅鴻遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2018年4月至2020年9月在甘肅省蘭州市榆中縣進(jìn)行,共設(shè)3個處理:A,全量化肥(當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)化肥施用量);B,菌肥(60 kg·hm-2)+60%化肥(即當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)化肥施用量的60%);C,菌肥(120 kg·hm-2)+40%化肥(即當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)化肥施用量的40%)。

本試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計,每處理重復(fù)3次,每小區(qū)面積40 m2,每壟定植兩行,株距為40 cm,其余田間管理均與當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)方式保持一致。在當(dāng)?shù)鼗ㄒ朔N植中,常規(guī)基施900 kg·hm-2的蔬菜專用硫基長效復(fù)合肥。

于2020年7月(花椰菜生長后期)在每個取樣點采集2份土壤樣品,去除表面雜物后,一部分新鮮土樣保存于-80 ℃環(huán)境中,用于微生物多樣性研究;另一部分自然風(fēng)干后過1 mm篩,用于土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性的測定。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 花椰菜產(chǎn)量與品質(zhì)指標(biāo)測定

待產(chǎn)品器官達(dá)到采收標(biāo)準(zhǔn)后,每年每個處理的每次重復(fù)隨機選取10株,測定花椰菜的單株重、葉球重、葉片重,統(tǒng)計小區(qū)產(chǎn)量,并折算單位面積(以1 hm2計)產(chǎn)量。同時,分別采用2,6-二氯靛酚法、烘干法、考馬斯亮藍(lán)法、蒽酮法、紫外分光光度法測定葉球的維生素C(VC)、粗纖維、可溶性蛋白、可溶性糖、硝酸鹽含量[12]。

1.3.2 土壤樣品采集

待3 a的定位試驗結(jié)束后,用5點取樣法采集試驗小區(qū)0～20 cm土樣[13]。采樣器需經(jīng)乙醇消毒后再取樣,每個樣點取3份土樣作為重復(fù),用于土壤微生物總DNA的提取、測序及土壤理化性質(zhì)測定。

1.3.3 土壤理化性質(zhì)測定

使用Hanna HI8314便攜式pH儀[漢鈉儀器(上海)有限公司]測定土壤pH值,浸提液的土水質(zhì)量體積比為1∶5;使用雷磁DDSJ-308A電導(dǎo)儀[儀電科學(xué)儀器(上海)有限公司]測定土壤電導(dǎo)率(EC,單位為mS·cm-1),并相應(yīng)折算全鹽量(全鹽量的單位為%,當(dāng)EC值≤3時,全鹽量的值約等于EC值的0.320;當(dāng)EC值>3時,全鹽量的值約等于EC值的0.355)。參照文獻(xiàn)[14-16]中的方法,測定下列指標(biāo),簡述如下:采用重鉻酸鉀容量-稀釋熱法測定土壤有機質(zhì)含量,采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量,采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定土壤有效磷含量,采用 NaNO3浸提-四苯硼鈉比濁法測定土壤速效鉀含量,采用半微量凱氏法測定土壤全氮含量,采用氫氧化鈉熔融—鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量,采用氫氧化鈉熔融—火焰光度法測定土壤全鉀含量。土壤脲酶活性用靛酚藍(lán)比色法測定;過氧化氫酶活性用高錳酸鉀滴定法測定;堿性磷酸酶活性用磷酸苯二鈉比色法測定;蔗糖酶活性用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[12]。

1.3.4 土壤微生物總DNA的提取與測序

將保存的土樣交由上海聯(lián)川生物技術(shù)公司進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取與測序。簡述如下:采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司),按照說明書方法獲得土壤總DNA,經(jīng)瓊脂糖電泳檢查DNA的完整性,并測定其含量,選擇合格樣品用于測序。對于細(xì)菌,選擇其16S rDNA的V3～V4區(qū)域,采用引物341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)進(jìn)行PCR擴增[17];對于真菌,選擇ITS2可變區(qū),采用引物ITS1(5′-GTGARTCATCGAATCTTTG-3′)和ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴增[18]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化[AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒,康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司]、定量后,準(zhǔn)備擴增子庫進(jìn)行測序。采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒在Qubit熒光定量系統(tǒng)上對文庫進(jìn)行定量。構(gòu)建好的文庫使用Illumina NovaSeq測序系統(tǒng)進(jìn)行2×250 bp 的雙端測序。利用QIIME2軟件計算α-多樣性,并基于Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)進(jìn)行處理間的比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品在Illumina NovaSeq平臺上進(jìn)行測序。對測序結(jié)果,利用QIIME2插件特征分類器進(jìn)行物種標(biāo)注序列比對,用于比對的數(shù)據(jù)庫為SILVA和UNITE。

采用SPSS 26軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),對有顯著(P<0.05)差異的,采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較,以評價不同處理對花椰菜品質(zhì)、產(chǎn)量及土壤理化性質(zhì)的影響。采用Microsoft Excel 2007軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物菌肥替代化肥對花椰菜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

在2018年和2020年,B處理的產(chǎn)量最高(表1),分別達(dá)到了32.41、33.61 t·hm-2,顯著高于同年的其他處理,較A處理分別提高了7.7%和2.1%;在2019年,A處理的產(chǎn)量最高,達(dá)到了48.67 t·hm-2,其次是B處理和C處理,三者差異均顯著。

表1 不同處理對花椰菜品質(zhì)和產(chǎn)量的影響Table 1 Effect of treatments on quality and yield of cauliflower

對比各處理花椰菜的品質(zhì)指標(biāo):在2018年,各處理間在檢測的品質(zhì)指標(biāo)上均無顯著差異。在2019年,與A處理相比,B處理和C處理的VC含量分別顯著提高了72.2%和94.3%;C處理的粗纖維、可溶性蛋白、硝酸鹽含量分別顯著降低了7.6%、29.8%、5.6%;B處理的硝酸鹽含量顯著升高了6.4%。在2020年,與A處理相比,C處理的VC含量顯著降低了4.2%;B處理的粗纖維含量顯著提高了37.7%,而硝酸鹽含量顯著降低了7.0%?？偟膩砜?利用微生物菌劑替代40%的化肥對花椰菜的花球品質(zhì)并無明顯不良影響。

2.2 微生物菌肥替代化肥對土壤理化性質(zhì)和酶活性的影響

經(jīng)過3 a的定位試驗,與A處理相比,B、C處理的土壤脲酶、過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性,及pH值、全鹽量、有機質(zhì)含量、堿解氮含量、全氮含量、全鉀含量無顯著差異(表2、表3);B、C處理的土壤蔗糖酶活性和有效磷含量顯著升高;C處理的土壤速效鉀含量顯著下降,而全磷含量顯著升高。以上結(jié)果說明,微生物菌肥可替代部分化肥,且在提高土壤質(zhì)量方面有一定的效果。

表2 不同處理對土壤酶活性的影響Table 2 Effect of treatments on soil enzymes activities

表3 不同處理對土壤基本理化性質(zhì)的影響Table 3 Effect of treatments on soil physiochemical properties

2.3 微生物菌肥替代化肥對土壤微生物的影響

表征微生物物種豐富度的Chao1指數(shù),及表征微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),在各處理間差異不顯著(表4、表5)。

表4 不同處理對土壤細(xì)菌α多樣性的影響Table 4 Effect of treatments on α-diversity of soil bacteria

表5 不同處理對土壤真菌α多樣性的影響Table 5 Effect of treatments on α-diversity of soil fungi

對于土壤細(xì)菌而言,在門水平上,各處理的細(xì)菌群落組成相似(圖1),相對豐度>1%的門有12個,合計約占全部細(xì)菌豐度的96.66%～96.86%,其中,變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)為優(yōu)勢門,相對豐度大于10%。相較于A處理,施用微生物菌肥后(對應(yīng)于B、C處理),土壤中固氮菌的相對豐度提高,與土壤N素循環(huán)有關(guān)的浮霉菌門(Planctomycetota)的相對豐度提高了17.0%～18.5%,具有硝化作用的硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度降低了11.7%～16.4%;同時,土壤中有益菌的相對豐度也增高,放線菌門(Actinobacteria,其次生代謝產(chǎn)物可拮抗病原菌)的相對豐度提升0～24.9%,厚壁菌門(Firmicutes,大多數(shù)具有防控生物病害的功能)的相對豐度提升了4.4%～29.2%。在屬水平上,微生物菌肥可使土壤中WD2101_soil_group_unclassified、RB41這2個屬的相對豐富度增加(圖2),可降低Gemmatimonadaceae_unclassified、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、硝化螺菌屬(Nitrospira)的相對豐度。芽單胞菌屬是有機碳(苯酚)分解的主要細(xì)菌,其相對豐度的降低或許與土壤有機質(zhì)含量的降低相關(guān)。

圖1 不同處理門水平上的土壤細(xì)菌(左)、真菌(右)相對豐度Fig.1 Relative abundance of soil bacteria (left) and fungi (right) at phyla level under treatments

圖2 不同處理屬水平上的土壤細(xì)菌(左)、真菌(右)相對豐度Fig.2 Relative abundance of soil bacteria (left) and fungi (right) at genus level under treatments

對于土壤真菌而言,不同處理的土壤真菌類群組成整體相似,相對豐度大于1%的除未分類真菌(Fungi_unclassified)外,包括子囊菌門(Ascomycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和壺菌門(Chytridiomycota),合計占全部真菌相對豐度的99.87%～99.98%。施用微生物菌肥后,較全量化肥(A處理)而言,子囊菌門、接合菌門的相對豐度有所提高,增幅分別為8.90%～14.43%、23.01%～28.79%,油壺菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門的相對豐度降低,降幅分別為2.98%～42.97%、14.73%～19.55%、65.99%～73.91%。在屬水平上,相對豐度>10%的優(yōu)勢屬除未分類真菌(Fungi_unclassified)外,還有油壺菌屬(Olpidium)、被孢霉屬(Mortierella),相對豐度分別為11.44%～20.06%、13.80%～17.83%。施用微生物菌肥較全量化肥降低了油壺菌屬和小壺菌屬(Spizellomyces)這兩類病原菌的相對豐度,降幅分別為2.98%～42.97%、80.69%～85.31%,提高了被孢霉屬有益微生物的相對豐度,增幅為29.20%～23.49%,使土壤真菌群落組成更有利于花椰菜生長。

2.4 花椰菜產(chǎn)量、品質(zhì)指標(biāo)與土壤因子的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示,土壤pH和全氮含量與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)(表6),土壤全磷含量和放線菌門相對豐度與VC含量呈顯著負(fù)相關(guān),土壤酸桿菌門相對豐度與粗纖維含量呈顯著正相關(guān),子囊菌門相對豐度與可溶性糖含量呈顯著正相關(guān)。其他土壤因子與花椰菜產(chǎn)量、品質(zhì)指標(biāo)間無顯著相關(guān)性。

表6 花椰菜產(chǎn)量、品質(zhì)指標(biāo)與土壤因子的相關(guān)性Table 6 Correlation within cauliflower yield and quality indexes and soil factors

3 討論

3.1 減量化肥配施微生物菌劑對花椰菜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響

花椰菜作為一種具有保健功能的蔬菜,深受廣大消費者的喜愛。目前,我國是世界上花椰菜種植面積最大、總產(chǎn)量最高的國家[19]?；ㄒ说臓I養(yǎng)價值豐富,其VC含量是番茄的8倍、芹菜的15倍[20]。近年來,由于農(nóng)民盲目追求產(chǎn)量,過量施用化肥的現(xiàn)象頻發(fā),導(dǎo)致蔬菜連作時的產(chǎn)量和品質(zhì)逐漸下降,不利于蔬菜產(chǎn)業(yè)的長久健康發(fā)展[21-23]。微生物菌肥不僅可以促進(jìn)黃瓜的營養(yǎng)生長[24],還可提高番茄果實中維生素C、可溶性糖的含量和果實產(chǎn)量[25-26]。本研究結(jié)果與前人研究相似,適宜量的微生物菌肥與化肥配施(60 kg·hm-2菌肥+60%化肥)有助于花椰菜產(chǎn)量的提升,這可能是因為微生物菌肥中富含的多種促生菌可以有效促進(jìn)作物對土壤養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)化;但當(dāng)微生物菌肥用量過大,而配施的化肥比例較低時,作物所能利用的土壤養(yǎng)分含量降低,亦會導(dǎo)致作物品質(zhì)和產(chǎn)量的下降[27-29],如本研究中120 k·hm-2菌肥+40%化肥處理就導(dǎo)致花椰菜的產(chǎn)量顯著降低。

在花椰菜品質(zhì)方面,減量化肥配施菌肥主要影響花球的VC、粗纖維、可溶性蛋白和硝酸鹽含量,在2019年,施用菌肥的B、C處理的花球VC含量較A處理顯著升高,在2020年,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥處理的花球VC含量仍處于較高水平,與A處理無顯著差異,但顯著高于120 kg·hm-2菌肥+40%化肥的處理。同時,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥處理的花椰菜花球在2020年的硝酸鹽含量顯著低于其他處理。

3.2 減量化肥配施微生物菌劑對土壤理化性質(zhì)和酶活性的影響

土壤理化性質(zhì)和酶活性是反映土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[30]。有研究指出,長期施用化肥通常會引起土壤鹽漬化、土壤板結(jié)、透氣性變差等問題[31]。長期施用微生物菌肥有利于改善土壤質(zhì)量,但在短期內(nèi)可能無法發(fā)揮顯著的效果[32]。本研究中,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥處理較全量化肥的處理顯著提高了土壤的有效磷含量。這可能是由于微生物菌劑所含的促生菌具有轉(zhuǎn)化有機磷的特性,因而有助于增加土壤養(yǎng)分[31]。本研究中,60 kg·hm-2菌肥+60%化肥處理的土壤蔗糖酶活性顯著高于單施化肥的處理,這與張緒美等[33]的研究結(jié)果相似;但各處理的土壤脲酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性無顯著差異。徐忠山等[34]的研究發(fā)現(xiàn),BMF菌肥和MF菌肥的施用均抑制了茶園土壤脲酶的活性,這可能與作物種類、土壤類型、菌肥配施比例及田間管理措施的差異有關(guān)。

3.3 減量化肥配施微生物菌劑對土壤微生物的影響

錢海燕等[35]研究表明,秸稈還田配施化肥及微生物菌劑刺激了微生物的生長和活動,細(xì)菌與真菌數(shù)量明顯增多。李鳳霞等[11]的研究表明,化肥配施微生物菌劑可以有效提高土壤中的細(xì)菌數(shù)量,降低真菌數(shù)量,并且配合減量化肥的效果相比全量化肥更優(yōu)。劉森林[36]研究發(fā)現(xiàn),兩種菌劑(BS和EM)及有機肥對土壤微生物群落組成有不同程度的影響,但均能抑制部分植物病原細(xì)菌和真菌。Li等[37]對花生根際微生物的研究發(fā)現(xiàn),病原菌的增多是以有益微生物的減少作為前提的。本研究中,微生物菌劑部分替代化肥后,有益微生物(如放線菌門、厚壁菌門等)的相對豐度增加,而有害微生物(如油壺菌屬和小壺菌屬)的相對豐度降低。我們推測,這主要是由于微生物菌劑所含的促生菌具有與植物聯(lián)合固氮、溶解土壤難溶性磷、轉(zhuǎn)化有機磷、分泌植物生長激素和拮抗引起植物病害的病原菌等特性,能夠優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu),使土壤向著更利于植物生長的方向轉(zhuǎn)變。微生物菌肥不僅能夠給土壤提供養(yǎng)分,而且能夠優(yōu)化調(diào)控土壤微生物菌群區(qū)系結(jié)構(gòu),促進(jìn)根際土壤PGPR菌增殖,進(jìn)而提高作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[38]。

綜上所述,適宜用量的微生物菌肥部分替代化肥可提高土壤質(zhì)量、改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、平衡微生物區(qū)系,改善高原種植區(qū)花椰菜的品質(zhì),在本試驗條件下,以60 kg·hm-2菌肥配施540 kg·hm-2蔬菜專用硫基長效復(fù)合肥(減少化肥用量40%)處理的效果最佳。