柴榮耀,游雨欣,,邱海萍,郭峻寧,張 震,李 斌,沈升法,王艷麗,*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所/省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點(diǎn)實驗室/浙江省國家農(nóng)作物品種抗性鑒定試驗站,浙江 杭州 310021; 2.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所,水稻生物育種全國重點(diǎn)實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學(xué)重點(diǎn)實驗室/浙江省作物病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實驗室,浙江 杭州 310058; 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所,浙江 杭州 310021)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是我國第四大糧食作物[1],具有營養(yǎng)價值高、生長適應(yīng)性廣、生產(chǎn)期長等特點(diǎn)。然而,由達(dá)旦提狄克氏菌Dickeyadadantii侵染引起的甘薯莖腐病是嚴(yán)重為害甘薯的一種細(xì)菌性病害[2],在浙江、河北、河南等省份發(fā)生較為嚴(yán)重[3],現(xiàn)已被列入浙江省植物檢疫性有害生物補(bǔ)充檢疫對象名錄[4]。該病原菌寄主范圍廣,致病力強(qiáng),主要為害薯苗、莖蔓、葉片和薯塊等部位,對甘薯生產(chǎn)造成毀滅性的影響,至今仍缺乏系統(tǒng)有效的防治措施[5]。因此,尋找具有抗莖腐病的甘薯新品種十分必要。

選育和種植甘薯莖腐病抗病品種是針對甘薯莖腐病最為經(jīng)濟(jì)有效環(huán)保的防治方法,也是控制病害的最根本措施之一。在抗病品種的選育過程中,需要進(jìn)行大量的抗病性鑒定試驗,因此,建立完善的病害抗性鑒定評價方法是重要前提。操作簡單、快速準(zhǔn)確的接種鑒定方法是研究中不可或缺的。目前,植物病原細(xì)菌的接種方法較多[6-7][8],如剪葉法、浸(蘸)根法、針刺法、噴霧法、摩擦法、注射法和灌注土壤法等。這些方法因細(xì)菌病害和寄主不同,作用效果也不同。在甘薯莖腐病的研究中,以往用的針刺法[9]和薯塊切片接菌法[10]以及已報道的剪葉法、噴霧法等常用的細(xì)菌病害接種方法[11],都存在一些弊端,如得到的致病甘薯的發(fā)病癥狀不穩(wěn)定,接菌量很難保證一致,不適用于甘薯莖腐病的大規(guī)模接種抗性鑒定[12]等。因此,建立一種操作簡單、快速準(zhǔn)確、效果穩(wěn)定的抗性鑒定方法對于甘薯的種質(zhì)資源和育種材料的篩選以及品種抗性評價至關(guān)重要。

本文旨在建立和優(yōu)化甘薯莖腐病的抗性鑒定技術(shù),選取最佳接種方式和接種菌液濃度建立甘薯抗莖腐病鑒定標(biāo)準(zhǔn),通過對6個代表性種質(zhì)進(jìn)行室內(nèi)接種與田間抗性比對驗證,用于室內(nèi)接種抗性精準(zhǔn)鑒定;對65份甘薯種質(zhì)進(jìn)行室內(nèi)接種抗性鑒定,明確這些種質(zhì)的真實抗性水平,并選育和種植對甘薯莖腐病表現(xiàn)出穩(wěn)定抗性的品種來防治該病害,為種植抗莖腐病、綜合性狀好的甘薯和生產(chǎn)提供技術(shù)支持,為甘薯抗莖腐病育種和品種的抗性改良提供可利用的抗性資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘薯種質(zhì)資源共65份,均由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所薯類育種與栽培研究室提供。

供試菌株為達(dá)旦提狄克氏菌 (Dickeyadadantii) dd1、dd2,由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)和微生物所分離、鑒定和保存。

接種菌液制備:活化保存的甘薯莖腐病菌,挑取單菌落在NA培養(yǎng)基上劃線,置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中,在搖床中以28 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)24～36 h。用無菌水配成濃度為4.4×108CFU·mL-1的菌懸液作為接種菌液。

1.2 甘薯莖腐病接種方法

根據(jù)田間甘薯莖腐病發(fā)病特點(diǎn)和品種抗性鑒定研究工作所需要求,設(shè)計了薯苗不同扦插栽培方式、病菌不同接種方式等多種病害接種方法進(jìn)行接種鑒定技術(shù)研究。

1.2.1 盆栽土壤扦插接菌法

在張鴻等[13]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。用口徑20 cm的育苗盆裝適量無菌潮濕沙壤土,用無菌手術(shù)刀將甘薯苗主莖或側(cè)枝修剪成帶有3～4片展葉的莖枝進(jìn)行扦插移栽,并在薯苗基部澆灌2 mL接種菌液,以等量無菌水作為對照。接種后逐天觀察甘薯苗發(fā)病情況,并對各處理組進(jìn)行發(fā)病結(jié)果調(diào)查統(tǒng)計。每個盆栽接種3株甘薯苗,3盆為一組,設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 水泥槽蛭石拌菌移栽法

在水泥槽中鋪滿無菌略潮濕的蛭石,將接種菌液拌入蛭石中,使其濕潤。接著扦插新生的3～4片真葉的甘薯苗,每區(qū)栽插10株甘薯苗為一組,共設(shè)3組重復(fù)。以無菌水蛭石作為對照組。接種后逐天觀察甘薯苗發(fā)病情況,并對甘薯苗進(jìn)行病害等級鑒定。

1.2.3 試管菌液插苗法

在張希太等[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。甘薯苗直接插入裝有5 mL接種菌液的試管中培養(yǎng),置于可控溫控光的培養(yǎng)室內(nèi),溫度為30 ℃,空氣相對濕度為80%。以裝有無菌水的大試管為對照。10株甘薯苗為一組,設(shè)3次重復(fù)。逐天觀察并統(tǒng)計甘薯苗在試管中的發(fā)病情況。

1.2.4 組培瓶蛭石菌液浸苗扦插法

參照劉偉明等[15]的接種方法,并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。將帶有3～4片展葉的薯苗基部輕輕置于菌懸液(菌液濃度為4.4×108CFU·mL-1)中浸泡2 min。在組培瓶中裝滿無菌水,使蛭石充分濕潤,將處理過的薯苗扦插于蛭石中,置于可控溫控光培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng),溫度為30 ℃,空氣相對濕度為80%;以浸泡無菌水的薯苗為對照。每個組培瓶中培養(yǎng)1株,9株為一組,每組重復(fù)3次。在接種后逐日記錄甘薯苗的發(fā)病情況。

1.2.5 組培瓶蛭石扦插灌根法

在謝越盛等[16]的基礎(chǔ)上,加以改進(jìn)。在組培瓶中裝滿無菌水,使蛭石充分濕潤,扦插帶有3～4片展葉的薯苗于蛭石中,在薯苗基部澆灌1 mL的接種菌液。以澆灌無菌水為對照。置于溫度為30 ℃,濕度為80%的可控溫控光培養(yǎng)室內(nèi),逐天調(diào)查發(fā)病情況。每個組培瓶中培養(yǎng)1株,9株為一組,每組重復(fù)3次。

1.2.6 組培瓶蛭石薯苗針刺法

在柴一秋等[17]方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。在裝有無菌水的組培瓶中填充蛭石并充分濕潤。選取帶有3～4片展葉的健康薯苗,將其莖基部用無菌針頭刺傷,取1 mL配制好的接種菌液滴加在針刺傷口處(傷口全部在空氣中),以滴加無菌水為對照。之后用滅菌濕棉球包扎傷口,放入裝滿蛭石的組培瓶中,置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)(溫度為30 ℃,濕度為80%)。每個組培瓶中培養(yǎng)1株,9株為一組,每組重復(fù)3次。

1.2.7 組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法

在無菌條件下,將帶有3～4片展葉的薯苗用600目砂紙在距下端剪口5 cm莖基處輕擦出0.5～1 cm的傷口,并扦插到蛭石中,使得傷口處一部分沒入蛭石,另一部分暴露在空氣中,用移液槍滴加1 mL接種菌液于甘薯苗擦傷處,置于可控溫控光培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)(溫度為30 ℃,濕度為80%)。以滴加無菌水為對照。每個組培瓶中培養(yǎng)1株,9株為一組,每組重復(fù)3次。

1.3 甘薯莖腐病菌接種菌液濃度

在作物細(xì)菌病害接種中,病菌接種菌液濃度會影響作物發(fā)病情況,因此,在作物抗病性鑒定中需明確最佳接種菌液濃度。本文上述不同接種方法的對比試驗中,所采用的甘薯莖腐病菌接種菌液濃度均為4.4×108CFU·mL-1(D600=0.2)。前人研究表明,在選取了已明確田間抗病性表現(xiàn)為抗病、中感、感病的3個甘薯品種,用濃度為4.4×108CFU·mL-1的菌懸液進(jìn)行擦傷接種,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘薯發(fā)病程度偏重,可能是由于接種菌液濃度過高引起的[18]。為此,本文通過對接種菌液進(jìn)行不同濃度的稀釋,以確定甘薯莖腐病抗性鑒定的最佳接種菌液濃度。

以中感甘薯品種浙薯33為研究材料,采用上述試驗中最佳的接種方法進(jìn)行培養(yǎng),以濃度為4.4×108CFU·mL-1的菌懸液(D600=0.2)作為母液,通過稀釋不同濃度(稀釋1倍、10倍、40倍、100倍和1 000倍)進(jìn)行接種,即接種菌液濃度梯度為2.2×108、4.4×107、1.1×107、4.4×106和4.4×105CFU·mL-1。以無菌水為對照,每種濃度重復(fù)3次。

1.4 新抗莖腐病鑒定技術(shù)的驗證與應(yīng)用

選取甘薯品種和不同的接種方法,確定最佳的接種方式和接種菌液濃度,建立鑒定標(biāo)準(zhǔn)。選擇最具代表性的6個代表性甘薯品種材料,采用最佳的接種方式和接種菌液濃度進(jìn)行室內(nèi)鑒定,與田間抗性品種比較的驗證,以確定該抗莖腐病鑒定技術(shù)的準(zhǔn)確性。并對65個甘薯材料進(jìn)行抗病鑒定,在接種后一段時間內(nèi)觀察甘薯的發(fā)病情況,根據(jù)鑒定標(biāo)準(zhǔn)對甘薯品種的抗病性進(jìn)行評估,并給出相應(yīng)的分級標(biāo)準(zhǔn)。

通過多次重復(fù)測定試驗,根據(jù)甘薯整體品種材料的發(fā)病癥狀特點(diǎn)與抗性表現(xiàn),結(jié)合田間病圃實際結(jié)果以及相關(guān)參考文獻(xiàn)資料,參照文獻(xiàn)的病害分級標(biāo)準(zhǔn)[19],加以改進(jìn):根據(jù)病情類型分為0級(高抗)、1級(抗病)、3級(中抗)、5級(中感)、7級(感病)以及9級(高感)這六種類型,其中各病級對應(yīng)癥狀的表型見表1。

表1 甘薯莖腐病薯苗接種病情分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading criteria for inoculation of sweet potato stem rot seedlings

以作物病情指數(shù)(DI)來評價作物抗病性是常用的科學(xué)評價方法[20],參照此標(biāo)準(zhǔn),對甘薯莖腐病病情指數(shù)進(jìn)行計算。甘薯莖腐病病情指數(shù)(DI)的計算公式如下:

式中:VDI,病情指數(shù)的值;Pi,各級發(fā)病株數(shù);Di,各級代表值;P,調(diào)查總株數(shù);Dm,最高級代表值。根據(jù)參與鑒定全部甘薯品種材料的發(fā)病與抗性表現(xiàn),結(jié)合田間病圃實際結(jié)果,參照文獻(xiàn)的評價標(biāo)準(zhǔn)[21],確定甘薯莖腐病抗病性按病情指數(shù)(DI)來評價的抗性評價分類為抗病(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感病(S)?？剐栽u價標(biāo)準(zhǔn)病情指數(shù)區(qū)間見表2。

表2 甘薯莖腐病抗病性評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation criteria for resistance to stem rot of sweet potato

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方法對薯苗發(fā)病程度的影響

實驗結(jié)果表明,薯苗經(jīng)不同接種方法接種菌液后,均能引起薯苗發(fā)生莖腐病甚至死亡,但不同接種方法間發(fā)病程度、穩(wěn)定性與效果仍存在很大差異(圖1、表3)。

圖1 不同接種方法薯苗莖腐病發(fā)病死亡率Fig.1 Mortality rate of stem rot of potato seedlings by different inoculation methods

表3 甘薯莖腐病不同接種方法效果比較Table 3 Comparison of the effectiveness of different inoculation methods for sweet potato stem rot

試管菌液插苗法具有快速發(fā)病和高發(fā)病率的特點(diǎn),但發(fā)病過于嚴(yán)重(圖2-A),無法區(qū)分品種的抗性;組培瓶蛭石菌液浸苗扦插法也存在類似問題。組培瓶蛭石薯苗針刺法發(fā)病嚴(yán)重且不穩(wěn)定。水泥槽蛭石拌菌移栽法發(fā)病緩慢且條件不易控制。組培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法發(fā)病緩慢,時間周期長且發(fā)病率低(圖2-B)。經(jīng)多次實驗表明,組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法接種最優(yōu)。該方法易于控制溫度、濕度等相關(guān)條件,發(fā)病率較為一致。初始發(fā)病時,薯苗擦傷接種部分出現(xiàn)水漬狀斑,隨著時間的推移逐漸變成黑褐色軟腐斑,病部伴有惡臭味,隨后甘薯莖基腐爛死亡(圖2-C)。該癥狀與田間莖腐病相似。

A,試管菌液插苗法;B,盆栽土壤扦插接菌法;C,組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法。A, Tube innoculation method; B, Potting soil inoculation method; C, Scratch innoculation method of seedlings in tissue culture bottles with vermiculite.圖2 不同接種方法的薯苗發(fā)病情況Fig.2 Morbidity of potato seedlings by different inoculation methods

2.2 不同接種菌液濃度對薯苗發(fā)病程度的影響

采用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法對不同接種菌液濃度的薯苗進(jìn)行處理。研究結(jié)果表明,經(jīng)母液稀釋40倍(1.1×107CFU·mL-1)菌液濃度接種后的效果最佳,接種2～3 d后薯苗開始顯癥,在擦傷接菌部出現(xiàn)水漬狀斑,后期形成黑褐色軟腐斑,甚至導(dǎo)致甘薯莖基腐爛死亡,該癥狀與田間莖腐病相似(圖3);經(jīng)母液(4.4×108CFU·mL-1)、稀釋1倍(2.2×108CFU·mL-1)和10倍(4.4×107CFU·mL-1)的接種菌液處理后的薯苗,其抗性評價仍高于中感級別;經(jīng)稀釋100倍(4.4×106CFU·mL-1)和1 000倍(4.4×105CFU·mL-1)的接種菌液濃度處理后,薯苗發(fā)病率低、病癥輕且顯癥極慢?；谏鲜鼋Y(jié)果,明確甘薯莖腐病抗性鑒定的最佳接種菌液濃度為1.1×107CFU·mL-1。

圖3 接種菌液不同濃度薯苗莖腐病發(fā)病死亡率Fig.3 Mortality rate of stem rot of potato seedlings inoculated with different concentrations of bacterial solution

2.3 新抗莖腐病接種鑒定技術(shù)的驗證

本文選取了7個具有代表性的甘薯品種(浙紫薯1號、FM11、浙薯38、浙薯33、浙薯13、浙733和浙薯26),采用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法對其進(jìn)行室內(nèi)接種抗性鑒定,接種菌液濃度為最適菌液濃度1.1×107CFU·mL-1,同時在基地自然病圃進(jìn)行田間抗性品比,最終調(diào)查結(jié)果顯示室內(nèi)接種抗性鑒定結(jié)果與田間抗性表現(xiàn)基本一致(圖4)。因此,可以確立新抗莖腐病鑒定技術(shù)方法為采用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法、接種菌液濃度為1.1×107CFU·mL-1。

圖4 甘薯品種室內(nèi)抗莖腐病鑒定結(jié)果與田間抗性品比的驗證Fig.4 Validation of the results of indoor identification of sweet potato varieties for resistance to stem rot with field resistance ratios

2.4 新抗莖腐病鑒定技術(shù)的應(yīng)用

通過新抗莖腐病鑒定技術(shù),采用dd1、dd2的混合菌株對65個甘薯品種材料進(jìn)行了抗莖腐病室內(nèi)接種鑒定,該方法接種甘薯植株病情擴(kuò)展迅速,接種后6 d感病品種發(fā)病可達(dá)9級;品種抗性區(qū)分度較好,接種6 d后品種間病情指數(shù)表現(xiàn)為0.9～77.4(表4)。

表4 甘薯品種資源對莖腐病抗性鑒定結(jié)果Table 4 Results of the identification of sweet potato variety resources for resistance to stem rot

根據(jù)甘薯莖腐病抗病性評價標(biāo)準(zhǔn),鑒定品種材料中有7個品種材料病情指數(shù)(DI)≤5,表現(xiàn)為抗病,占鑒定材料的10.8%,分別為YD7002、DY7082-1、浙紫薯1號、TF1118、DY7032、南薯88、浙紫薯4號;有12個品種材料病情指數(shù)在550,表現(xiàn)為感病,占比為23.0%(圖5)?？剐澡b定結(jié)果為品種推廣與抗病育種提供了依據(jù)。

圖5 六十五個甘薯種質(zhì)資源中對莖腐病各抗性水平占比Fig.5 Percentage of each level of resistance to stem rot in 65 sweet potato germplasm resources

3 結(jié)果與討論

選育和種植甘薯抗病品種是防治莖腐病的有效措施,需進(jìn)行抗性鑒定。建立簡便準(zhǔn)確的接種鑒定方法是研究不可或缺的前提。目前報道甘薯莖腐病抗性的研究較少,本文設(shè)計了不同薯苗扦插栽培方式、病菌不同接種方式對其進(jìn)行接種鑒定。采用不同的人工接種方式,甘薯莖腐病的發(fā)病程度具有明顯差異。利用試管菌液插苗法和組培瓶蛭石菌液浸苗扦插法進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)這兩種方法導(dǎo)致了較嚴(yán)重的發(fā)病情況,難以區(qū)分不同甘薯品種的抗性,在實際應(yīng)用中的可行性較低;組培瓶蛭石薯苗針刺法、水泥槽蛭石拌菌移栽法、組培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法,這些方法都展現(xiàn)出了一定程度的優(yōu)勢,發(fā)病較為緩慢且穩(wěn)定,條件易于控制。然而,組培瓶蛭石薯苗針刺法的發(fā)病程度嚴(yán)重且不穩(wěn)定,可能由于針刺導(dǎo)致的傷口感染引起了過度的病原菌侵染。水泥槽蛭石拌菌移栽法表現(xiàn)出一定的成活率和抗性評價,但發(fā)病緩慢且條件不易控制,因此,在實際應(yīng)用中可能存在一些局限性。組培瓶蛭石扦插灌根法和盆栽土壤扦插接菌法的發(fā)病程度較緩慢,時間周期長且發(fā)病率低,這些方法適于對抗性的長期評估。而組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法通過在薯苗表面進(jìn)行擦傷,使病原菌更容易侵入,從而真實地反映了田間莖腐病的發(fā)病情況。與其他方法相比,該方法處理間發(fā)病較為一致,病勢進(jìn)展適宜,且條件易于控制。由此可以更準(zhǔn)確地評估甘薯的抗性,并篩選出具有穩(wěn)定抗性的種質(zhì)資源。因此,該方法將成為甘薯莖腐病抗育種的重要工具。

此外,接種菌液濃度的差異也會影響甘薯抗性評價。將接種菌液濃度分別稀釋不同濃度(稀釋1倍、10倍、40倍、100倍和1 000倍)進(jìn)行接種,以確定甘薯莖腐病抗性鑒定的最佳接種菌液濃度。經(jīng)高濃度處理后的薯苗,其抗性評價高于中感級別,低濃度處理的薯苗發(fā)病較輕,顯癥慢;而用稀釋40倍(1.1×107CFU·mL-1)時的接種菌液進(jìn)行組培瓶蛭石薯苗擦傷接種效果明顯,能夠真實反映甘薯幼苗抗性。由此可見,濃度為1.1×107CFU·mL-1的接種菌液可作為最佳濃度,以進(jìn)行甘薯接種鑒定。

利用組培瓶蛭石薯苗擦傷接菌法與最佳接菌濃度(1.1×107CFU·mL-1),建立了一種新的抗性鑒定技術(shù)。通過選取6份最具代表性的甘薯種質(zhì)材料進(jìn)行室內(nèi)接種抗性鑒定,其發(fā)病情況與田間抗性相一致。進(jìn)一步對65份甘薯種質(zhì)材料進(jìn)行抗莖腐病鑒定,發(fā)現(xiàn)絕大部分材料表現(xiàn)為感病或中感,其中有7份甘薯種質(zhì)表現(xiàn)為抗性,這些具有穩(wěn)定抗性的種質(zhì)將成為甘薯莖腐病抗育種的重要資源,可以進(jìn)一步利用這些種質(zhì)進(jìn)行遺傳育種和分子標(biāo)記輔助選擇[22],開展甘薯抗莖腐病育種工作。雖然采用此方法進(jìn)行篩選抗性品種的效果佳,顯癥明顯,但由于田間接種易受病原菌傳播、年度氣候、地理環(huán)境、管理措施等多種因素的影響,鑒定結(jié)果往往與室內(nèi)存在差異[23],仍需要進(jìn)一步在田間進(jìn)行抗性鑒定,以明確此接種方法的有效性。

綜上所述,甘薯抗莖腐病鑒定技術(shù)的建立及種質(zhì)資源抗性分析是甘薯育種中的重要研究內(nèi)容,對于提高甘薯生產(chǎn)效益和促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。未來應(yīng)進(jìn)一步深入研究甘薯抗莖腐病的分子機(jī)理和遺傳規(guī)律,加速抗病種質(zhì)資源的篩選和開發(fā),為甘薯育種和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供更加精準(zhǔn)的技術(shù)支持。