張露荷,王多鋒,張 德,張廣忠,趙 通,呂斌燕,張洋軍,李 毅

(1.甘肅省林業(yè)科學(xué)研究院,甘肅 蘭州 730020; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

干旱是世界上最嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一。我國(guó)地處典型季風(fēng)氣候區(qū),干旱災(zāi)害的影響尤為突出[1]。干旱缺水是限制沙漠、戈壁區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素,棗樹作為一種抗旱性較強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)林樹種,其林地也出現(xiàn)了嚴(yán)重的土壤干燥化問題,給棗樹正常生長(zhǎng)造成了障礙。棗樹花小、人工去雄困難、坐果率低且胚敗育現(xiàn)象嚴(yán)重,使得棗樹雜交育種非常困難,所以生物技術(shù)育種是棗樹未來育種的主要途徑。前人通過轉(zhuǎn)錄組分析,鑒定了許多參與干旱響應(yīng)的基因,如棗樹的抗壞血酸過氧化物酶基因(ZjAPX基因)[2],耐旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有DREB、NAC、MYB、TCP等,但對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)理還不清楚。miRNA是一類非編碼小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá),參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育,響應(yīng)著各種非生物脅迫和生物脅迫。雖然已經(jīng)報(bào)道了棗樹棗瘋病[3]、酸棗在鹽脅迫下miRNA的一些研究[4],證實(shí)miRNA在調(diào)控植物干旱脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5],但關(guān)于miRNA調(diào)控棗樹響應(yīng)干旱脅迫的研究未見報(bào)道。

TCPs是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)控下游基因的表達(dá),在調(diào)控植物的形態(tài)構(gòu)型、配子體發(fā)育、晝夜節(jié)律以及脅迫響應(yīng)等多種生命活動(dòng)過程發(fā)揮著重要作用;是響應(yīng)干旱脅迫、鹽脅迫、高溫脅迫等非生物脅迫的十分重要的轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明,TCPs轉(zhuǎn)錄因子主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和植物激素途徑來調(diào)控植物器官發(fā)生和形態(tài)構(gòu)型[6]。最近研究解析了TCP基因編碼蛋白與下游靶基因啟動(dòng)子DNA互作的調(diào)控模式[7]。TCP轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的功能被廣泛鑒定,其結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)理被相繼報(bào)道[8]。已經(jīng)鑒定了許多植物中的TCP 基因;如在擬南芥中鑒定了24個(gè)TCP成員,在水稻中發(fā)現(xiàn)了26個(gè)TCP成員,在毛竹基因組中有19個(gè)TCP成員,紫花苜蓿中發(fā)現(xiàn)了40個(gè)TCP成員,這些基因大多數(shù)都定位于細(xì)胞核[9],作為轉(zhuǎn)錄因子主要在細(xì)胞核里面發(fā)揮調(diào)控功能。轉(zhuǎn)錄因子 TCP4 參與下胚軸延伸、次生細(xì)胞壁的形成、子葉的舒展、葉片形態(tài)和表皮毛分化等植物生長(zhǎng)發(fā)育過程[10]。大豆的轉(zhuǎn)錄因子TCP4可以通過調(diào)節(jié)乙烯和脫落酸信號(hào)來響應(yīng)干旱脅迫[11]。

關(guān)于棗樹 TCP轉(zhuǎn)錄因子的功能研究還鮮有報(bào)道[12]。選擇干旱敏感型棗樹品種冬棗和耐旱型棗樹品種贊皇大棗為實(shí)驗(yàn)材料,通過small RNA-seq和降解組測(cè)序技術(shù)在棗樹全基因組水平挖掘干旱相關(guān)的miRNAs及其調(diào)控的靶基因,對(duì)棗樹干旱相關(guān)的miRNAs的鑒定得知:干旱脅迫和正常澆水相比較,novel-miR16在冬棗和贊皇大棗中都差異表達(dá),說明棗樹novel-miR16響應(yīng)干旱脅迫;RT-qPCR分析表明,novel-miR16在干旱脅迫下明顯差異表達(dá)[13]。對(duì)棗樹干旱相關(guān)的miRNA靶基因的鑒定中,驗(yàn)證了TCP4為棗樹novel-miR16的靶基因,靶基因功能注釋和相關(guān)研究報(bào)道表明TCP類轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)干旱脅迫。因此,選擇novel-miR16研究其在棗樹響應(yīng)干旱脅迫過程中的功能。本研究從棗樹中研究發(fā)現(xiàn)novel-miR16的靶基因?yàn)門CP轉(zhuǎn)錄因子,并在棗樹中克隆到ZjTCP4基因的序列,對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,亞細(xì)胞定位和干旱脅迫下的表達(dá)分析,以期為TCP轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)干旱脅迫的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本氏煙草無(wú)菌苗由陜西博瑞德生物科技有限公司提供。培養(yǎng)室溫度為26 ℃,光照1 500 lx,12 h光照、12 h黑暗。贊皇大棗棗樹苗由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。載體及試劑:DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,pMD?19-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司,pART-CAM-EGFP由陜西博瑞德生物科技有限公司提供,植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,DNA 膠回收試劑盒、DL2000 Marker、DNA聚合酶和各類限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)與分析軟件

已知植物miR319成熟體序列從miRNA數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.mirbase.org)中獲得;棗樹novel-miR16靶基因利用在線預(yù)測(cè)軟件psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)預(yù)測(cè)獲得,novel-miR16的靶基因序列在棗樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Ziziphus_jujuba.version2_13chr )中下載獲得;Expasy(http://www.expasy.org/tools)用于棗樹novel-miR16靶基因ZjTCP4編碼蛋白的基本性質(zhì)分析;軟件UNAFold (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/)預(yù)測(cè)novel-miR16前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用DNAMAN(Lynnon Biosoft, San Ramon, CA, USA)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 棗樹novel-miR16序列和結(jié)構(gòu)分析

將高通量測(cè)序獲得棗樹novel-miR16成熟體序列與miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase中已知的植物miRNA成熟序列比對(duì),分析其保守性。利用在線分析軟件UNAFold (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/)預(yù)測(cè)novel-miR16前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 棗樹novel-miR16靶基因的預(yù)測(cè)

根據(jù)高通量測(cè)序獲得棗樹novel-miR16的成熟體序列;利用植物miRNA靶基因在線預(yù)測(cè)軟件psRNATarget預(yù)測(cè)棗樹novel-miR16的靶基因,通過對(duì)靶基因的功能注釋鑒定其功能。

1.5 棗樹novel-miR16靶基因ZjTCP4的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證棗樹novel-miR16預(yù)測(cè)的靶基因,我們用RNA連接酶介導(dǎo)的RLM-5′RACE(Invitrogen公司的GeneRaeer 試劑盒)對(duì)棗樹novel-miR16預(yù)測(cè)靶基因的降解位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。采集棗樹葉片并提取總RNA,連接RNA接頭并反向轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,根據(jù) GeneRacer試劑盒5′接頭引物和靶基因ZjTCP4的特異性引物(Outer primer:5′-CAAGCCTCTTGCTTCTGATCC-3′和Inner primer:5′-CTGTGAATTTGTACAATTGCTTTC-TTAGCAACCTGTGAATTTGTACAATTGCTTTCTT-AGCAAC-3′)進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增獲得靶基因ZjTCP4的5′端序列,PCR擴(kuò)增片段經(jīng)凝膠電泳純化回收后克隆到pMD19-T進(jìn)行測(cè)序,通過分析靶基因的降解位點(diǎn)來驗(yàn)證預(yù)測(cè)棗樹novel-miR16靶基因。

1.6 棗樹TCP4基因的克隆

在棗樹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Ziziphus_jujuba.version2_13chr)中下載獲得ZjTCP4(CCG006181)基因序列,利用軟件DNAMAN設(shè)計(jì)棗樹ZjTCP4 基因的PCR 克隆引物;正向引物:5′-CGGGATCCTAACATGGAC GCCATCAATC TC-3′,退火溫度67.5 ℃;反向引物:5′-CGAGCTCCAATCTCACAAACCACTCTCTTCTTC-3′,退火溫度67 ℃;并送生物工程有限公司。以提取到的棗樹葉片總 RNA 為模板,按AMVcDNA合成試劑盒合成cDNA,用ZjTCP4 基因特異的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系:TaqPCR Master Mix(上海生工,貨號(hào):B639295)10 μL,ZjTCP4-F(10 μmol·μL-1) 1 μL, ZjTCP4-R(10 μmol·μL-1) 1 μL, 模板cDNA 1 μL,ddH2O 7 μL。將PCR產(chǎn)物與pMD?19-T Vector 載體進(jìn)行連接,用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。

1.7 ZjTCP4的生物信息學(xué)分析

利用在線分析工具Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)分析ZjTCP4基因編碼多肽的等電點(diǎn)、分子量及相關(guān)理化性質(zhì);Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)棗樹ZjTCP4基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型;用TMHM-M-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件進(jìn)行ZjTCP4基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析;利用SignalP 3.0 Server (http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP)信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件分析ZjTCP4基因編碼蛋白信號(hào)肽;利用NetPhos 2.0 Server軟件進(jìn)行ZjTCP4基因編碼蛋白質(zhì)的翻譯后加工修飾預(yù)測(cè);利用軟件ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析ZjTCP4基因的親疏水性;利用Plant-mPLoc蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)ZjTCP4基因的作用位置[14];通過軟件DNAMAN(Lynnon Biosoft, San Ramon, CA, USA)對(duì)靶基因ZjTCP4及擬南芥TCP轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 ZjTCP4亞細(xì)胞定位

將靶基因ZjTCP4與亞細(xì)胞定位載體pART-CAM-EGFP連接構(gòu)建表達(dá)載體,將本氏煙草植株置于白色熒光燈下一段時(shí)間使葉片氣孔打開,再用注射器將導(dǎo)入亞細(xì)胞定位載體的菌液注入煙草植株葉片的表皮,直到看到液體擴(kuò)散,再侵染其他部位,侵染后,用記號(hào)筆圈定侵染區(qū)域。然后將葉片噴水,套上保鮮袋后置于黑暗環(huán)境培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)48 h后打開保鮮袋,培養(yǎng)72 h后切取標(biāo)記區(qū)域,撕下煙草葉片表皮在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.9 棗樹novel-miR16及靶基因ZjTCP4在干旱脅迫下的表達(dá)分析

通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)棗樹novel-miR16及其靶基因ZjTCP4在贊皇大棗棗樹品種中的表達(dá)情況,贊皇大棗為定干80 cm 的3年生截干苗。2020年秋季將棗樹苗栽植在花盆中后,將花盆埋在地里面越冬。2021 年7月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)施溫室進(jìn)行盆栽的干旱試驗(yàn),干旱處理的土壤含水量為田間持水量的25%±5%,定期用土壤濕度計(jì)進(jìn)行監(jiān)測(cè),用稱重法進(jìn)行測(cè)定和澆水。分別提取干旱脅迫0、5、10、15、20、25 d時(shí)贊皇大棗棗樹的葉片總RNA,并用One Step PrimeScript1 miRNA cDNA synthesis kit(TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得各自的cDNA,檢測(cè)棗樹novel-miR16及其靶基因ZjTCP4在干旱脅迫不同時(shí)期的表達(dá)情況,以ef1a基因?yàn)閮?nèi)參基因,PCR條件為:94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性 20 s,58 ℃ 退火30 s,設(shè)置35個(gè)循環(huán)。最后用2-ΔΔCT公式計(jì)算novel-miR16及其ZjTCP4基因在不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗樹novel-miR16的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

UNAFold 預(yù)測(cè)novel-miR16前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)表明,其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有miRNA典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖1),20 bp的novel-miR16成熟體序列(UUGGACU GAAGGGAGCUCCC)位于二級(jí)結(jié)構(gòu)的5′端。

紅色部分表示novel-miR16成熟序列。Mature novel-miR16 sequences are in red.圖1 棗樹novel-miR16二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)Fig.1 The secondary hairpin structures of novel-miR16 in Chinese jujube

2.2 棗樹novel-miR16的保守性分析

為了研究棗樹novel-miR16的功能,我們分析了棗樹novel-miR16成熟體序列的保守性,結(jié)果表明,棗樹novel-miR16的成熟體序列與miRBase中植物miR319成熟體序列高度保守,與67個(gè)已知植物miR319成熟體序列完全相同,與其他33個(gè)已知植物miR319成熟體序列僅有1個(gè)堿基差異。因此,認(rèn)為novel-miR16為棗樹miR319家族成員。

2.3 棗樹novel-miR16靶基因的預(yù)測(cè)

棗樹novel-miR16靶基因利用psRNATarget軟件預(yù)測(cè)獲得(表1)。通過對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析表明,棗樹novel-miR16靶基因與TCP轉(zhuǎn)錄因子高度同源,且具有TCP轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)域,屬于TCP轉(zhuǎn)錄因子家族,并將靶基因命名為ZjTCP4(CCG006181)。

表1 棗樹novel-miR16的靶基因預(yù)測(cè)Table 1 Predicted target genes of novel-miR16 in Chinese jujube

2.4 棗樹novel-miR16靶基因ZjTCP4的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證novel-miR16預(yù)測(cè)的靶基因ZjTCP4,我們利用RLM-5′RACE技術(shù)對(duì)novel-miR16在靶基因ZjTCP4上的切割位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。靶基因ZjTCP4的降解位點(diǎn)多數(shù)都在novel-miR16結(jié)合位點(diǎn)的第10和11個(gè)核苷酸的位置 (圖2),表明ZjTCP4為棗樹novel-miR16的靶基因。

圖2 棗樹novel-miR16靶基因的驗(yàn)證Fig.2 Verification of novel-miR16 target mRNA in Chinese jujube

2.5 棗樹ZjTCP4基因的克隆

以ZjTCP4-F和ZjTCP4-R 為引物,在棗樹中擴(kuò)增ZjTCP4基因,擴(kuò)增獲得1 386 bp大小的預(yù)期條帶(圖3),初步判定靶基因ZjTCP4(CCG006181)擴(kuò)增成功,將PCR產(chǎn)物與克隆載體連接后送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增序列與ZjTCP4(CCG006181)序列只有3個(gè)堿基的差異,說明該基因擴(kuò)增成功。

M,2 000 bp ladder Marker;1,PCR 產(chǎn)物。M, 2 000 bp ladder Marker; 1, PCR products.圖3 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.3 Result of electrophoresis of PCR products

2.6 棗樹ZjTCP4基因的生物信息學(xué)分析

2.6.1 棗樹ZjTCP4基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

生物信息學(xué)分析表明,ZjTCP4基因的全長(zhǎng)cDNA序列為1 386 bp,預(yù)測(cè)編碼452個(gè)氨基酸的多肽,預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)為6.51,分子量為49 091.55 u。其分子量、等電點(diǎn)及其預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度與已報(bào)道擬南芥、水稻和楊樹等模式植物TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員極為相似。

2.6.2 棗樹ZjTCP4基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

Swiss-Model預(yù)測(cè)棗樹ZjTCP4基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,結(jié)果表明,該基因主要有2個(gè)α螺旋和2個(gè)折疊,詳細(xì)結(jié)果見圖4。

A,ZjTCP4基因編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);B,ZjTCP4基因編碼的蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析圖;C,ZjTCP4基因編碼的蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè);D,ZjTCP4基因編碼蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾預(yù)測(cè);E,ZjTCP4基因編碼的蛋白質(zhì)疏水性分析。A, Tertiary structure prediction of protein encoded by ZjTCP4 gene;B, Transmembrane domain analysis of protein encoded by ZjTCP4 gene; C, Signal peptide prediction of protein encoded by ZjTCP4 gene;D, Post-translational modification prediction of protein encoded by ZjTCP4 gene; E, Hydrophobicity analysis of protein encoded by ZjTCP4 gene.圖4 ZjTCP4基因編碼的蛋白質(zhì)生物信息分析圖Fig.4 Bioinformatics analysis of protein encoded by ZjTCP4 gene

2.6.3 棗樹ZjTCP4基因的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

用TMHM-M-2.0軟件進(jìn)行ZjTCP4基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果表明,該基因沒有跨膜結(jié)構(gòu)域,應(yīng)該是一個(gè)膜內(nèi)或膜外蛋白,詳細(xì)見圖4。

2.6.4ZjTCP4基因的信號(hào)肽分析

利用SignalP 3.0 Server軟件預(yù)測(cè)ZjTCP4編碼蛋白的信號(hào)肽,結(jié)果表明,該基因編碼蛋白未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽(圖4),可能為非分泌性蛋白。

2.6.5 棗樹ZjTCP4基因編碼蛋白翻譯后加工修飾預(yù)測(cè)

對(duì)ZjTCP4翻譯后加工修飾的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),ZjTCP4基因編碼蛋白有較高的磷酸化修飾,磷酸化修飾位點(diǎn)有76個(gè),其中Ser磷酸化修飾位點(diǎn) 39個(gè),Thr 磷酸化修飾位點(diǎn)17個(gè)(圖4)。

2.6.6 棗樹ZjTCP4基因編碼蛋白疏水性分析

ZjTCP4基因編碼蛋白親水性分析表明,該基因整體的親水性明顯強(qiáng)于疏水性,為親水性蛋白質(zhì)(圖4)。

2.6.7 棗樹novel-miR16靶基因ZjTCP4的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用Plant-mPLoc蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)軟件分析ZjTCP4基因編碼蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用位置,結(jié)果表明,該基因定位于細(xì)胞核,與預(yù)期結(jié)果一致,也符合轉(zhuǎn)錄因子的位置特征。

2.6.8 棗樹ZjTCP4基因的保守性分析

將棗樹ZjTCP4基因編碼蛋白與擬南芥33個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行序列比對(duì)分析,并用DNAMAN(Lynnon Biosoft, San Ramon, CA, USA)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明,棗樹ZjTCP4基因編碼的氨基酸序列與擬南芥AtTCP4最為相似,與擬南芥AtTCP17,AtTCP18和AtTCP12的相似性也較高,詳細(xì)結(jié)果見圖5。

圖5 ZjTCP4基因編碼的蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of protein encoded by ZjTCP4

2.7 棗樹novel-miR16靶基因ZjTCP4的亞細(xì)胞定位驗(yàn)證

將構(gòu)建的pCAM-GFP-ZjTCP4載體和pCAM-GFP空載體(陰性對(duì)照)注射至煙草葉片,黑暗環(huán)境培養(yǎng)48 h后用激光共聚焦顯微鏡在488 nm波長(zhǎng)處觀察拍照。結(jié)果顯示:空載體pCAM-GFP定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞膜中,而pCAM-GFP-ZjTCP4融合蛋白主要定位于細(xì)胞核(圖6)。

從左到右分別為 CK/基因的 GFP 綠色熒光蛋白、CHI、明場(chǎng)和3個(gè)通道的疊加照片。From left to right, superimposed photos of GFP green fluorescent protein, CHI, bright field and three channels of CK/gene, respectively.圖6 ZjTCP4基因的亞細(xì)胞定位圖Fig.6 Subcellular localization of the ZjTCP4 protein

2.8 棗樹novel-miR16及靶基因ZjTCP4響應(yīng)干旱脅迫

為了檢測(cè)棗樹novel-miR16及靶基因ZjTCP4(CCG006181)是否響應(yīng)干旱脅迫,本研究利用qRT-PCR分析了棗樹novel-miR16及靶基因ZjTCP4 (CCG006181)在干旱脅迫不同時(shí)期的表達(dá)模式。結(jié)果表明,棗樹novel-miR16及靶基因ZjTCP4(CCG006181)在響應(yīng)干旱脅迫的過程中呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式,棗樹novel-miR16在響應(yīng)干旱脅迫的過程中上調(diào)表達(dá),而其靶基因ZjTCP4(CCG006181)在干旱脅迫下下調(diào)表達(dá)(圖7)。

同一基因不同時(shí)間點(diǎn)間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。No identical lowercase letters between different time points of the same gene indicate significant differences (P<0.05).圖7 棗樹novel-miR16及基因靶ZjTCP4在干旱脅迫下的表達(dá)分析Fig.7 The expression level of novel-miR16 and ZjTCP4 under drought stress in Chinese jujube

3 討論

3.1 novel-miR16是棗樹中保守的miR319家族成員

MiR319是植物中最為保守miRNA家族之一[15-16]。另外,miR319靶向TCP轉(zhuǎn)錄因子在植物中同樣保守[17-19]。已知miR319靶向TCP轉(zhuǎn)錄因子在多種植物發(fā)育和對(duì)各種脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17,20]。例如,在鹽脅迫下,miR319在擬南芥[16]、小麥[21]、蔓生彎草[19]和柳枝稷[22]等多種植物中都上調(diào)表達(dá),而其靶基因TCP類轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)表達(dá)。這說明miR319靶向TCP轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控模式在植物中也同樣保守。本研究在棗樹中鑒定出1個(gè) miR319 家族新成員(novel-miR16),保守性分析表明,棗樹novel-miR16的成熟體序列與miRBase中植物miR319成熟體序列高度保守,與67個(gè)已知miR319成熟體序列完全相同,與其他33個(gè)已知miR319成熟體序列僅有1個(gè)堿基差異。表明novel-miR16是棗樹中保守的miR319家族成員之一。另外,靶基因預(yù)測(cè)表明,棗樹novel-miR16的靶基因?yàn)閆jTCP4(CCG006181),5′-RACE對(duì)靶基因ZjTCP4 (CCG006181)驗(yàn)證表明,其切割位點(diǎn)多數(shù)呈現(xiàn)在novel-miR16結(jié)合位點(diǎn)的第10和11個(gè)核苷酸之間,這與擬南芥miR319對(duì)靶基因TCP4的切割位點(diǎn)一致,說明植物miR319與靶基因TCP類轉(zhuǎn)錄因子的剪切位點(diǎn)在不同物種間保守性較強(qiáng)。

3.2 棗樹novel-miR16靶向ZjTCP4基因響應(yīng)干旱脅迫

眾所周知,miRNA通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng),大量響應(yīng)干旱脅迫的miRNA及其靶基因已在多種植物中被鑒定出來[23-26]。由于miRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因mRNA的降解,miRNA與靶基因呈現(xiàn)相反的表達(dá)模式,因此,通常通過分析miRNA與靶基因在脅迫下的表達(dá)模式來鑒定miRNA在脅迫響應(yīng)中的功能。例如,擬南芥在磷脅迫下miR399的表達(dá)量上升,而靶基因泛素結(jié)合酶基因UBC24下調(diào)表達(dá)[24];水稻在冷脅迫下miR159的表達(dá)量會(huì)明顯降低,導(dǎo)致其靶基因MYB3R-2類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的升高而增強(qiáng)水稻的耐凍性[25];植物miR395的靶基因?yàn)锳PS基因,植物中miR395表達(dá)量的降低會(huì)導(dǎo)致其靶基因APS表達(dá)量的積累,最終會(huì)使植物體內(nèi)谷胱甘肽的含量增加,提高植物對(duì)多種非生物脅迫的抗性[26]。

本研究通過高通量測(cè)序在棗樹中鑒定出1個(gè)miR319新成員novel-miR16,并通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鑒定出其靶基因ZjTCP4。研究發(fā)現(xiàn),TCP 轉(zhuǎn)錄因子通過激活或抑制下游干旱相關(guān)基因的表達(dá),在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[27-28]。也有報(bào)道表明,miR319與TCP存在靶向關(guān)系,響應(yīng)著植物逆境脅迫過程。我們利用qRT-PCR檢查novel-miR16及靶基因ZjTCP4 (CCG006181)在干旱脅迫不同時(shí)期的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),棗樹novel-miR16及靶基因ZjTCP4 (CCG006181)在響應(yīng)干旱脅迫的過程中呈負(fù)相關(guān),棗樹novel-miR16在響應(yīng)干旱脅迫的過程中上調(diào)表達(dá),而其靶基因ZjTCP4 (CCG006181)在干旱脅迫下下調(diào)表達(dá)。這與在模式植物中的研究結(jié)果基本一致[29-30]。研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥、水稻、白菜、棉花、蘭花的TCP基因中發(fā)現(xiàn)了miR319的靶基因位點(diǎn),并且在脅迫條件下miR319與TCP基因的表達(dá)模式就是呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。miR319主要是通過靶向轉(zhuǎn)錄因子,參與影響調(diào)控植物的激素合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆作用和生長(zhǎng)發(fā)育。有研究表明:過表達(dá)水稻miR319可以提高水稻的耐鹽性[17],與本研究結(jié)果相似。因此,本研究表明,棗樹novel-miR16通過靶向調(diào)控ZjTCP4轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)干旱脅迫,干旱脅迫下棗樹novel-miR16的上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致靶基因ZjTCP4 (CCG006181)下調(diào)表達(dá)來提高棗樹的耐旱性。TCP4轉(zhuǎn)錄因子可能在ABA和JA激素介導(dǎo)的干旱脅迫響應(yīng)中起正調(diào)控作用,這可以為深入解析棗樹novel-miR16靶向TCP4轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在棗樹中鑒定出miR319家族成員novel-miR16,并通過靶基因預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鑒定出棗樹novel-miR16的靶基因?yàn)閆jTCP4(CCG006181)轉(zhuǎn)錄因子。通過分析棗樹novel-miR16及靶基因ZjTCP4轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下的表達(dá)模式,結(jié)果表明,在干旱脅迫下棗樹novel-miR16上調(diào)表達(dá),而其靶基因ZjTCP4 (CCG006181)下調(diào)表達(dá),表明novel-miR16及其靶基因ZjTCP4在棗樹對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,但棗樹novel-miR16靶向ZjTCP4調(diào)控棗樹響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。