李天恩,周思含,孫洪超,付 媛,石團(tuán)員,*,閆文朝

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471023; 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,浙江 杭州 310021)

雞球蟲病由專性寄生于宿主腸道上皮細(xì)胞內(nèi)的艾美耳屬球蟲所引起[1]。每年因雞球蟲病造成的全球經(jīng)濟(jì)損失超過144億美元,嚴(yán)重制約著養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展[2]。在目前世界公認(rèn)的7種雞球蟲中,柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)的致病性最強(qiáng),同時(shí)也是國(guó)內(nèi)外各地雞群感染最普遍的優(yōu)勢(shì)蟲種[3],其感染不受年齡段限制,主要寄生在盲腸上皮細(xì)胞,造成腸上皮細(xì)胞壞死,腸黏膜損傷,最常見的臨床癥狀是血便[4-7]。輕度感染時(shí)可對(duì)雞的生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)性能造成影響,重度感染可造成雞大批量死亡[8]。此外,柔嫩艾美耳球蟲感染后對(duì)宿主黏膜系統(tǒng)的嚴(yán)重破壞會(huì)降低機(jī)體的免疫力,導(dǎo)致其他病原感染可能性增加。研究發(fā)現(xiàn),柔嫩艾美耳球蟲與J亞群禽白血病病毒雙重感染時(shí),可導(dǎo)致雛雞更嚴(yán)重的腸道組織損傷和較高的死亡率[9]。然而,目前雞球蟲病傳統(tǒng)防控策略主要依賴藥物和弱毒活卵囊疫苗,隨著球蟲耐藥蟲株的頻發(fā),以及公眾對(duì)雞肉、蛋產(chǎn)品藥物殘留問題的日益關(guān)注[10],抗球蟲藥物存在防治效果不佳和使用受限等實(shí)際問題[11],活卵囊疫苗也存在成本高、不易操作和潛在返強(qiáng)散毒等諸多弊端[12]。因此,養(yǎng)雞生產(chǎn)上亟需球蟲病新型疫苗。采用基因工程技術(shù)研制安全、有效的雞球蟲新型疫苗是一個(gè)很有吸引力的研究方向,其中,重組亞單位疫苗的表達(dá)系統(tǒng)較為成熟,該系統(tǒng)具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn),而篩選具有良好免疫保護(hù)效果的疫苗抗原蛋白,無疑是重組亞單位疫苗研制的關(guān)鍵[13]。

致密顆粒(dense granule, DG)是頂復(fù)合器門原蟲(包括球蟲、弓形蟲和新孢子蟲等)特有的一種分泌性亞細(xì)胞器,在透射電鏡下為單層膜包裹的球形致密小體,數(shù)量和大小隨種類和發(fā)育階段的不同存在差異[14]。早在上世紀(jì)的八九十年代,就有國(guó)內(nèi)外學(xué)者在球蟲子孢子和裂殖子內(nèi)觀察到DG的報(bào)道,E.tenella細(xì)胞內(nèi)的DG數(shù)量大約為4個(gè),且觀察到了DG向納蟲空泡(parasitophorous vacuole, PV)分泌蛋白的現(xiàn)象[15-16]。致密顆粒蛋白(GRAs)是一類由致密顆粒分泌的、具有重要生物學(xué)功能和免疫學(xué)應(yīng)用價(jià)值的蛋白質(zhì),在弓形蟲(Toxoplasmagondii)上已得到深入研究。目前,已報(bào)道的弓形蟲GRAs有54種[17-19]。蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)顯示,GRAs是一類分子量大小為20～60 ku,具有靶向信號(hào)肽和疏水性α螺旋結(jié)構(gòu)的分泌性小分子蛋白[17]。按照其參與PV結(jié)構(gòu)和功能不同,可大致分為3類:(1)納蟲空泡膜(PVM)結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)GRAs,包括GRA3、GRA5、GRA7、GRA8、GRA10、GRA14、GRA15、GRA19～24、GRA33、GRA35和GRA36[17,20-21],這類GRAs可形成伸入宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)長(zhǎng)突出,與PV結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、宿主逃避和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換功能密切相關(guān);(2)泡內(nèi)膜樣微管網(wǎng)絡(luò)(MNN)結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)GRAs,包括GRA2、GRA3、GRA4、GRA6、GRA9、GRA12和GRA14[17,20-21],這類GRAs存在于PVM上,與蟲體空間穩(wěn)定、有序分裂和物質(zhì)運(yùn)輸功能密切相關(guān);(3)非PV結(jié)構(gòu)相關(guān)GRAs,這類GRAs包括位于PV腔內(nèi)的可溶性GRA1和最終靶向宿主細(xì)胞核的GRA15、GRA16、GRA24,具有催化和宿主細(xì)胞應(yīng)答調(diào)節(jié)功能[16]。另外,按照其免疫應(yīng)答類型和應(yīng)用價(jià)值來說,GRAs大體可分為2類:(1)能夠激發(fā)宿主Th1型/CD8+T細(xì)胞為主要免疫應(yīng)答的GRAs,包括GRA1、GRA6、GRA7和GRA14等,因Th1型或CD8+T免疫應(yīng)答是宿主清除細(xì)胞內(nèi)原蟲的主要免疫機(jī)制,這類GRAs具有較高的疫苗研發(fā)價(jià)值[22]。據(jù)Scorza等[23]報(bào)道,GRA1蛋白免疫C3H小鼠后,能夠激發(fā)宿主高水平的CD8+T為主的特異性免疫應(yīng)答,免疫小鼠攻蟲后的存活率可達(dá)75%～100%;另?yè)?jù)Quan等[24]和Vazini等[25]報(bào)道,GRA7也能夠激發(fā)高水平的保護(hù)性免疫應(yīng)答,免疫小鼠存活時(shí)間和存活率均顯著提高,弓形蟲腦組織包囊減少率可高達(dá)80%以上,GRA1和GRA7都是具有弓形蟲疫苗研發(fā)價(jià)值的候選抗原基因。(2)能夠激發(fā)宿主較高體液特異性免疫應(yīng)答的GRAs,包括GRA2、GRA4、GRA7、GRA24和GRA41等;其中,GRA7不僅能夠激發(fā)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答,也能夠激發(fā)宿主較高的體液免疫應(yīng)答,能夠用于人、豬、雞和貓等動(dòng)物的弓形蟲病診斷,GRAs在弓形蟲病診斷中也具有較高的應(yīng)用價(jià)值[26-30]。

令人遺憾的是,盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)球蟲DG的報(bào)道較早,目前尚未有關(guān)于球蟲GRAs分子生物學(xué)和功能方面的確切研究報(bào)道。鑒于GRAs對(duì)球蟲胞內(nèi)寄生、發(fā)育起重要作用,以及在球蟲新型疫苗研發(fā)中的潛在價(jià)值,本研究以E.tenella北京株為研究對(duì)象,通過對(duì)E.tenella基因組分析,發(fā)掘到2種假定致密顆粒蛋白基因hEtGRA12、hEtGRA9,進(jìn)而通過基因擴(kuò)增、質(zhì)粒構(gòu)建和原核表達(dá)獲得重組蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9,并鑒定了其抗原性,為球蟲致密顆粒蛋白基因功能和免疫應(yīng)用深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

柔嫩艾美耳球蟲北京株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)并由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。Trans1-T1、Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞、TransScript?One-Step RT-PCR SuperMix一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司,pET32a(+)表達(dá)載體為實(shí)驗(yàn)室保存,pMD19-T克隆載體、dNTP、10×Buffer、rTaq酶、DNA marker、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,Trizol試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉和瓊脂糖購(gòu)自O(shè)XOID公司。

1.2 球蟲假定致密顆粒蛋白基因序列篩選

目前尚未有關(guān)于球蟲致密顆粒蛋白基因的確切報(bào)道,本研究首先從NCBI基因庫(kù)下載目前已報(bào)道的頂復(fù)合器門原蟲(如剛地弓形蟲、犬新孢子蟲、豬囊等孢球蟲等)的GRAs基因序列,然后通過BLAST工具分別將其與NCBI中E.tenellaHoughton株基因組比對(duì)分析,篩選出11條與GRAs蛋白序列相似性較高的假定基因序列,進(jìn)而利用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的引物(引物由杭州有康生物技術(shù)有限公司合成),引物序列見表1。根據(jù)推薦的反應(yīng)程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。

表1 克隆E. tenella假定致密顆粒蛋白基因序列所用引物Table 1 Primers for cloning dense granule protein hypothetical genes in E. tenella

1.3 RT-PCR

取新鮮的E.tenella孢子化卵囊5×107個(gè),通過機(jī)械研磨、化學(xué)消化、G3漏斗過濾、水平離心等系列方法步驟提取子孢子;取感染E.tenella后第5天的雞盲腸,刮取腸黏膜依次通過酶消化、離心洗滌、紅細(xì)胞裂解、Percoll密度梯度離心等手段提取第2代裂殖子。利用Trizol試劑提取子孢子、裂殖子的總RNA,然后進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段與pMD19-T載體于16 ℃連接過夜,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基于37 ℃過夜培養(yǎng),挑取單菌落培養(yǎng)并擴(kuò)增,選擇擴(kuò)增陽(yáng)性菌液送杭州有康生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 球蟲假定致密顆粒蛋白結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析

通過一系列生物信息學(xué)分析軟件對(duì)擴(kuò)增獲得的疑似基因蛋白結(jié)構(gòu),包括基本理化性質(zhì)(ProtParam tool在線軟件,https://web.expasy.org/protparam/)、信號(hào)肽(SignalP-5.0在線軟件,https://services.healthtech.dtu.dk/)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TMHMM-2.0在線軟件,https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)、二級(jí)結(jié)構(gòu)(GOR4在線軟件,https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl)、抗原表位(Antigenic在線軟件,http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)和親疏水性(Protscale在線軟件,https://web.expasy.org/protscale/)等進(jìn)行分析,并與已知的其他頂復(fù)合器門原蟲GRAs蛋白功能結(jié)構(gòu)域保守性進(jìn)行比對(duì)分析,以確定擴(kuò)增到的基因序列是否為球蟲假定致密顆粒蛋白基因。

1.5 球蟲假定致密顆粒蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將測(cè)序正確的pMD19T-hEtGRA克隆質(zhì)粒和pET32a(+)表達(dá)載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切,酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。通過T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜,構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-hEtGRA,并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Transetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落培養(yǎng),通過質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,用PCR和雙酶切鑒定。

1.6 球蟲重組蛋白rhEtGRA表達(dá)、純化與Western blot分析

將鑒定陽(yáng)性的pET32a(+)-hEtGRA重組表達(dá)菌按1∶100比例擴(kuò)大培養(yǎng)至D600(600 nm處的吸光度)為0.6～0.8時(shí),加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG,37 ℃、200 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)4 h。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于4 ℃ 10 000×g離心10 min,收集菌體棄去上清液。加入菌體10倍體積的裂解液將菌體充分懸浮,冰浴超聲破碎,將破碎液轉(zhuǎn)移至離心管,4 ℃,10 000×g離心10 min,取上清液(蛋白粗提物)待過柱。在純化柱中加入適量Ni-NTA純化介質(zhì)并靜置15 min,再對(duì)Ni-NTA純化柱進(jìn)行清洗、平衡。將蛋白粗提物加入Ni-NTA純化柱,使目的蛋白與Ni2+充分接觸,再經(jīng)過洗雜、洗脫處理,即可得到純化的目的蛋白。以純化的目的蛋白為抗原進(jìn)行SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)印到NC膜上,進(jìn)行Western blot分析。以雞抗柔嫩艾美耳球蟲陽(yáng)性血清和雞陰性血清作為一抗,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗雞IgG作為二抗,對(duì)重組蛋白抗原的特異性進(jìn)行鑒定。

1.7 鼠抗rhEtGRA多克隆抗體的制備與檢測(cè)

取6周齡SPF(無特定病原體)小鼠,將已測(cè)定濃度的rhEtGRA與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑1∶1混合后充分乳化,并采用頸部皮下多點(diǎn)注射的方式免疫小鼠。首免劑量為每只100 μg,二免、三免劑量均為每只50 μg,每次免疫間隔14 d。三免后第7天摘取眼球采血,采集的血液在37 ℃溫箱靜置1 h,再靜置于4 ℃冰箱過夜,第2天3 000×g離心5 min,分離血清并置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用間接ELISA方法檢測(cè)多克隆抗體效價(jià),以rhEtGRA為抗原,以rhEtGRA免疫小鼠血清和陰性鼠血清為一抗,以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,經(jīng)過顯色后用H2SO4終止,最后在酶標(biāo)儀中讀取450 nm處的吸光度D450。

2 結(jié)果與分析

2.1 球蟲假定致密顆粒蛋白基因hEtGRA12、hEtGRA9

通過RT-PCR擴(kuò)增E.tenella子孢子、裂殖子總RNA,獲得特異性擴(kuò)增條帶2條,分別命名為hEtGRA12基因(ETH_00023950)、hEtGRA9基因(ETH_00031740)。hEtGRA12條帶測(cè)序大小為1 188 bp(圖1-A),與E.tenellaHoughton株核苷酸序列一致性為99.92%,氨基酸序列一致性為100%,與T.gondiiME49株致密顆粒蛋白GRA12相似性為33.88%。hEtGRA9條帶測(cè)序大小為1 110 bp(圖1-B),與E.tenellaHoughton株核苷酸序列一致性為99.91%,氨基酸序列一致性為99.73%,與T.gondiiME49株致密顆粒蛋白GRA9相似性為27.5%。

M,DNA marker;1,hEtGRA12基因片段;2,hEtGRA9基因片段。M, DNA maker; 1, hEtGRA12 gene fragment; 2, hEtGRA9 gene fragment.圖1 hEtGRA12、hEtGRA9基因的克隆Fig.1 Cloning of hEtGRA12 gene and hEtGRA9 gene

對(duì)hEtGRA12基因進(jìn)行同源數(shù)據(jù)庫(kù)OrthoDB(https://www.expasy.org/resources/orthodb)分析,結(jié)果表明,頂復(fù)合器門GRA12蛋白在艾美耳屬和肉孢子蟲科均存在(圖2-A)。下載相應(yīng)的基因和蛋白序列,采用MEGA 11軟件進(jìn)行比對(duì)分析,并用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示,hEtGRA12蛋白氨基酸序列與剛地弓形蟲(T.gondii)、犬新孢子蟲(Neosporacaninum)、貝氏貝諾孢子蟲(Besnoitiabesnoiti)、豬囊等孢球蟲(Cystoisosporasuis)致密顆粒蛋白GRA12物種間相似性為28.8%～39.6%(圖2-B),hEtGRA12與剛地弓形蟲致密顆粒蛋白GRA12(TgGRA12)氨基酸序列間相似性最高,約為40%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明,hEtGRA12種間與TgGRA12親緣關(guān)系最近(圖2-C)。利用EMBL-EBI中成對(duì)序列比對(duì)工具(https://wwwdev.ebi.ac.uk/Tools/jdispatcher/)對(duì)hEtGRA9蛋白進(jìn)行相似性比對(duì)分析,結(jié)果表明hEtGRA9與TgGRA9、BbGRA9蛋白序列相似性分別為27.5%、29.5%(圖3)。

A,同源性分析;B,序列相似性分析;C,親緣關(guān)系分析,△表示hEtGRA12蛋白序列。A, Analysis of homolog; B, Analysis of sequence similarity; C, Analysis of kinship, △ represented sequence of hEtGRA12 protein.圖2 hEtGRA12蛋白同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Homology and phylogenetic analysis of hEtGRA12 protein

A,hEtGRA9與TgGRA9蛋白序列相似性分析;B,hEtGRA9與BbGRA9蛋白序列相似性分析?！?hEtGRA9蛋白序列;▲,TgGRA9蛋白序列;◆,BbGRA9蛋白序列。A, Sequence similarity analysis of hEtGRA9 and TgGRA9 protein; B, Sequence similarity analysis of hEtGRA9 and BbGRA9 protein. ●,Sequence of hEtGRA9 protein; ▲, Sequence of TgGRA9 protein; ◆, Sequence of BbGRA9 protein.圖3 hEtGRA9蛋白序列相似性分析Fig.3 Sequence similarity analysis of hEtGRA9 protein

2.2 hEtGRA12、hEtGRA9蛋白具有保守功能結(jié)構(gòu)域

生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果顯示,hEtGRA12蛋白含有395個(gè)氨基酸,其中酸性氨基酸(Asp+Glu)38個(gè)、堿性氨基酸(Arg+Lys)45個(gè);分子式為C1977H3054N558O569S19,原子總數(shù)6 177;理論分子量、等電點(diǎn)分別為44.35 ku、9.03;親水指數(shù)為-0.237,屬于親水性蛋白;含有疏水性信號(hào)肽,位于1～24位氨基酸(圖4-A);無跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4-B);含有多個(gè)親水性較高的區(qū)域,其中較為典型的主要有108、147、234位氨基酸,均位于-3.0～-4.0的超強(qiáng)親水性區(qū)域(圖4-C);在該蛋白的395個(gè)氨基酸中,130個(gè)氨基酸可能形成α螺旋(32.91%),97個(gè)氨基酸形成延伸鏈(24.56%),168個(gè)氨基酸形成無規(guī)則卷曲(42.53%)(圖4-D);存在17個(gè)可能的抗原表位(圖4-E)。

A,信號(hào)肽預(yù)測(cè);B,跨膜區(qū)預(yù)測(cè);C,親/疏水性分析;D,二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),藍(lán)色代表α螺旋,紫色代表無規(guī)則卷曲,紅色代表延伸鏈;E,抗原表位預(yù)測(cè)。圖5同。A, Prediction of signal peptide; B, Prediction of transmembrane region; C, Analysis of hydrophilic/hydrophobic; D, Prediction of secondary structure, blue represented α-helix, purple represented random coi, red represented extended strand; E, Prediction of antigen epitope. The same as in figure 5.圖4 hEtGRA12蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.4 Bioinformatics analysis of EtGRA12 protein

生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果顯示,hEtGRA9蛋白含有369個(gè)氨基酸,其中酸性氨基酸(Asp+Glu)60個(gè)、堿性氨基酸(Arg+Lys)46個(gè);分子式為C1713H2719N533O560S7,原子總數(shù)5 532;理論分子量、等電點(diǎn)分別為39.97 ku、5.16;親水指數(shù)為-0.856,屬于親水性蛋白;含有疏水性信號(hào)肽,位于1～25位氨基酸(圖5-A);無跨膜結(jié)構(gòu)域(圖5-B);含有多個(gè)親水性較高的區(qū)域,其中較為典型的主要有119、230、307、363位氨基酸,均位于-3.0～-4.0的超強(qiáng)親水性區(qū)域(圖5-C);在該蛋白的369個(gè)氨基酸中,187個(gè)氨基酸可能形成α螺旋(50.68%),18個(gè)氨基酸形成延伸鏈(4.88%),164個(gè)氨基酸形成無規(guī)則卷曲(44.44%)(圖5-D);存在9個(gè)可能的抗原表位(圖5-E)。

圖5 hEtGRA9蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.5 Bioinformatics analysis of hEtGRA9 protein

hEtGRA12、hEtGRA9均有信號(hào)肽、α螺旋,超強(qiáng)親水性區(qū)域,均屬于親水性蛋白,對(duì)TgGRA12、TgGRA9蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)也同樣具有信號(hào)肽、在二級(jí)結(jié)構(gòu)上也均只有α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)模式組成(圖6),且同屬于親水性蛋白,提示hEtGRA12、hEtGRA9在蛋白功能結(jié)構(gòu)域上與TgGRA12、TgGRA9具有一定的保守性。

綠色,信號(hào)肽;藍(lán)色,α螺旋;紫色,無規(guī)則卷曲;紅色,延伸鏈。Green, Signal peptide; Blue, α-Helix; Purple, Random coil; Red, Extended strand.圖6 蛋白功能結(jié)構(gòu)域保守性分析Fig.6 Conservative analysis of protein functional domain

2.3 hEtGRA12、hEtGRA9基因的原核表達(dá)

將pMD19T-hEtGRA12質(zhì)粒和pET32a(+)表達(dá)載體用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切,用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-hEtGRA12,經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定有目的基因片段(圖7-A),表明原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。pET32a-hEtGRA12重組表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,用超聲破碎儀破碎,離心后分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,結(jié)果顯示,獲得了63.6 ku的目的重組蛋白rhEtGRA12(圖7-B)。

A,pET32a(+)-hEtGRA12質(zhì)粒雙酶切鑒定;B,hEtGRA12蛋白的表達(dá)純化;C,pET32a(+)-hEtGRA9質(zhì)粒雙酶切鑒定;D,hEtGRA9蛋白的表達(dá)純化。M1,DNA marker;M2,蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1,pET32a(+)-hEtGRA12質(zhì)粒;2,pET32a(+)-hEtGRA12質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;3,未純化的hEtGRA12蛋白;4～5,純化的hEtGRA12蛋白;6,pET32a(+)-hEtGRA9質(zhì)粒;7,pET32a(+)-hEtGRA9質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;8,未純化的hEtGRA9蛋白;9,純化的hEtGRA9蛋白。A, Identification of pET32a (+)-hEtGRA12 plasmid by double enzyme digestion; B, Expression and purification of hEtGRA12 protein; C, Identification of pET32a (+)-hEtGRA9 plasmid by double enzyme digestion; D, Expression and purification of hEtGRA9 protein; M1, DNA maker; M2, Protein maker; 1, pET32a (+)-hEtGRA12 plasmid; 2, Digestion product of pET32a(+)-hEtGRA12 plasmid; 3, Unpurified hEtGRA12 protein; 4-5, Purified hEtGRA12 protein; 6, pET32a(+)-hEtGRA9 plasmid; 7, Digestion product of pET32a(+)-hEtGRA9 plasmid; 8, Unpurified hEtGRA9 protein; 9, Purified hEtGRA9 protein.圖7 hEtGRA12、hEtGRA9基因的重組表達(dá)Fig.7 Recombinant expression of hEtGRA12 and hEtGRA9 genes

使用同樣的方法和相對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶構(gòu)建hEtGRA9基因重組表達(dá)質(zhì)粒,并進(jìn)行蛋白的表達(dá)純化。結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-hEtGRA9(圖7-C),獲得了約67.00 ku的重組蛋白,與理論蛋白分子量59.46 ku存在差異,推測(cè)重組蛋白rhEtGRA9存在翻譯后修飾(圖7-D)。

2.4 rhEtGRA12、rhEtGRA9重組蛋白的抗原性

Western blot結(jié)果表明,重組蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9能夠被雞抗柔嫩艾美耳球蟲陽(yáng)性血清識(shí)別,表明具有較好的反應(yīng)原性(圖8-A、8-B)。

A,重組蛋白rhEtGRA12 Western blot分析;B,重組蛋白rhEtGRA9 Western blot分析;M,蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn);1、4,陰性雞血清;2、3,抗柔嫩艾美耳球蟲陽(yáng)性雞血清;C,鼠抗rhEtGRA12、鼠抗rhEtGRA9多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)。A, Western blot analysis of recombinant protein rhEtGRA12; B, Western blot analysis of recombinant protein rhEtGRA9; M, Protein marker; 1 and 4, Negative chicken serum; 2 and 3, Anti-Eimeria tenella positive chicken serum; C, Detection of mouse anti-rhEtGRA12 and mouse anti-rhEtGRA9 polyclonal antibody titers.圖8 rhEtGRA12、rhEtGRA9抗原性分析Fig.8 Antigenicity analysis of rhEtGRA12 and rhEtGRA9

以獲得的多抗和鼠陰性血清為一抗,以HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,再經(jīng)過顯色、終止反應(yīng),最后在酶標(biāo)儀中讀取D450。取4個(gè)鼠抗rhEtGRA12、鼠抗rhEtGRA9血清和2個(gè)鼠陰性血清的平均值作圖,結(jié)果表明,小鼠體內(nèi)均產(chǎn)生了高水平的抗體(圖8-C),抗體效價(jià)為1∶102 400,表明rhEtGRA12、rhEtGRA9重組蛋白具有較好的免疫原性。

3 討論

致密顆粒蛋白是頂復(fù)合器門原蟲特有的亞細(xì)胞器致密顆粒分泌的重要功能蛋白,具有較高的免疫學(xué)應(yīng)用價(jià)值,然而目前尚未有關(guān)于球蟲致密顆粒蛋白的確切報(bào)道,僅有些許假定致密顆粒蛋白的報(bào)道。本研究通過序列相似性比對(duì)和功能結(jié)構(gòu)域保守性分析從E.tenella北京株發(fā)掘并成功克隆了2個(gè)雞球蟲假定致密顆粒蛋白基因hEtGRA12、hEtGRA9;序列相似性比對(duì)結(jié)果顯示,hEtGRA12、hEtGRA9與Houghton株對(duì)應(yīng)的基因編碼的氨基酸序列一致性分別為100%、99.73%,而與頂復(fù)合器門其他原蟲致密顆粒蛋白GRA12、GRA9物種間相似性分別為28.8%～39.6%、27.5%～29.5%,表明hEtGRA12、hEtGRA9基因在種內(nèi)具有高度保守性,在種間具有不同程度差異性,提示球蟲中的致密顆粒蛋白除了具有頂復(fù)合器門原蟲共性的功能外,還可能具有獨(dú)特的種內(nèi)功能。弓形蟲致密顆粒蛋白之間或與已知功能的蛋白之間沒有顯著相似性,也沒有共同的保守結(jié)構(gòu)域,但基于它們?cè)谥旅茴w粒內(nèi)獨(dú)特的共定位被定義為GRA蛋白家族,但大多數(shù)均包含一個(gè)與它們分泌情況相關(guān)的N端疏水信號(hào)肽和α螺旋[17]。本研究中hEtGRA12、hEtGRA9蛋白均含有疏水信號(hào)肽,且α螺旋結(jié)構(gòu)占比很高,對(duì)TgGRA12、TgGRA9蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)也同樣具有信號(hào)肽,在二級(jí)結(jié)構(gòu)上也均只有α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)模式組成,且同屬于親水性蛋白,提示hEtGRA12、hEtGRA9在蛋白功能結(jié)構(gòu)域上與TgGRA12、TgGRA9具有一定的保守性,進(jìn)而提示hEtGRA12、hEtGRA9可能為雞球蟲真正的致密顆粒蛋白。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的無規(guī)則卷曲指不能被歸入明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)如折疊片或螺旋的多肽區(qū)段,因其肽鏈沒有一定規(guī)律且易變形,大多位于蛋白分子表面,因此利于與抗體結(jié)合,同時(shí)也是潛在的抗原表位。hEtGRA12、hEtGRA9蛋白序列無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)將近占全部結(jié)構(gòu)的一半,表明它們具有很好的潛在抗原表位。氨基酸殘基因其親/疏水性可分為親水性氨基酸和疏水性氨基酸,疏水性氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)內(nèi)部,主要構(gòu)成了蛋白質(zhì)折疊的主要?jiǎng)恿31]。親水性氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)表面,連續(xù)的高親水氨基酸殘基通常構(gòu)成一側(cè)線性抗原表位,因此它也是判斷B細(xì)胞抗原表位的常用參數(shù)[32]。hEtGRA12、hEtGRA9蛋白均具有多個(gè)超強(qiáng)親水性區(qū)域,可構(gòu)成一側(cè)線性抗原表位。通過抗原決定簇預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到hEtGRA12、hEtGRA9分別有17、9個(gè)潛在的抗原決定簇,進(jìn)一步說明hEtGRA12、hEtGRA9蛋白可能具有很好的免疫原性,具有成為候選抗原分子的潛力。蛋白異源表達(dá)是通過分子生物學(xué)技術(shù)將外源基因克隆到人工載體上,構(gòu)建出異源表達(dá)體系,從而獲得特定蛋白的一種方法。大腸埃希菌具有遺傳背景清楚、易培養(yǎng)、廉價(jià)、繁殖速度快、蛋白高表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),已成為很多異源蛋白表達(dá)的首選[33]。本研究通過大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白rEtGRA12、rhEtGRA9,rEtGRA12、rhEtGRA9可與雞抗E.tenella陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),表明重組蛋白rEtGRA12、rhEtGRA9均具有較好的反應(yīng)原性。本研究還利用純化的蛋白免疫小鼠制備多抗,檢測(cè)小鼠血清中抗rEtGRA12、rhEtGRA9抗體水平,結(jié)果表明,可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的抗體水平,再次驗(yàn)證了這2種重組蛋白具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性,具有成為抗雞球蟲病優(yōu)秀疫苗抗原分子的潛力。

雖然NCBI已公布了柔嫩艾美耳球蟲假定致密顆粒蛋白基因EtGRA9(ETH_00028350),但是已有研究證明該基因并不是真正的致密顆粒蛋白基因。Hu等[34]利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的柔嫩艾美耳球蟲分泌蛋白的基因標(biāo)記法對(duì)假定的EtGRA9基因進(jìn)行研究,結(jié)果在囊泡中發(fā)現(xiàn)了EtGRA9的標(biāo)記信號(hào),而未在致密顆粒中發(fā)現(xiàn),表明EtGRA9是一種分泌蛋白,可以幫助柔嫩艾美耳球蟲子孢子從孢子囊中釋放,并可能在子孢子和裂殖子入侵過程中發(fā)揮重要作用,并非真正的球蟲致密顆粒蛋白。本研究根據(jù)序列相似性和保守的功能結(jié)構(gòu)重新假定了一種EtGRA9基因(ETH_00031740),并命名為hEtGRA9。本研究中hEtGRA12基因(ETH_00023950)目前已有了相關(guān)研究報(bào)道,Mu等[35]構(gòu)建了基因ETH_00023950的真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到雞肝癌(LMH)細(xì)胞,然后對(duì)轉(zhuǎn)染后的LMH細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果表明,該基因改變了LMH細(xì)胞2 680個(gè)基因的表達(dá),說明該基因具有很高的研究?jī)r(jià)值。雖然hEtGRA12基因已經(jīng)被初步研究過,但其克隆到的序列與Houghton株相比,存在堿基差異,并由此導(dǎo)致提前終止翻譯。本研究克隆到的基因其蛋白序列與Houghton株相比一致性100%,在功能上可能會(huì)與Mu等[35]的研究有所差異,所以很有必要進(jìn)一步研究該基因的相關(guān)生物學(xué)特性。

本研究利用分子克隆手段獲得了E.tenella北京株hEtGRA12、hEtGRA9基因編碼區(qū)的全長(zhǎng)序列,并通過生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)和方法對(duì)hEtGRA12、hEtGRA9蛋白進(jìn)行了分析,獲得了重組蛋白rhEtGRA12、rhEtGRA9并鑒定了其抗原性。這兩種重組蛋白具有很好的抗原性,后續(xù)研究擬對(duì)其定位和免疫效果進(jìn)行評(píng)估。本研究在一定程度上為球蟲致密顆粒蛋白基因功能和免疫應(yīng)用深入研究奠定了基礎(chǔ)。