宋 鵬,李理想,江厚龍,王 茹,李 慧,趙鵬宇,張 均,*,秦平偉,任江波,陳慶明

(1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,河南 洛陽 471023; 2.重慶煙草科學(xué)研究所,重慶 400715; 3.重慶市煙草公司 彭水縣分公司,重慶 409600)

煙草是嗜鉀類作物,充足的鉀素供應(yīng)可增強(qiáng)卷煙的色澤、燃燒性和持火力[1];因此,煙葉中的鉀含量也常被用作衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[2]。炭疽病、氣候斑病等病害直接影響煙葉的品質(zhì)與經(jīng)濟(jì)效益。有研究表明,鉀元素與煙株的抗逆能力關(guān)系密切[3],增施鉀肥可通過提高作物的抗病性[4-5]進(jìn)而提高煙葉的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益[6-7]。

目前,提高煙葉鉀含量的途徑主要包括應(yīng)用鉀高效品種、增加鉀肥施用量、優(yōu)化肥料配方和鉀肥施用方法與時(shí)間等[8-10]。然而,施入土壤的鉀肥大部分易被土壤固定或隨水淋失,既導(dǎo)致鉀肥利用率下降,又造成鉀肥資源的浪費(fèi)[11-12]。近年來,人們嘗試用生物菌劑的方法來提高作物鉀含量。側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)是一種好氧的產(chǎn)孢細(xì)菌[13],具有可抑制多種病蟲害、培養(yǎng)周期短、生產(chǎn)方便等特點(diǎn),是常見的生防菌之一[14-15]。研究表明,芽孢桿菌具有解鉀[16]、促生[17]、降解污染物[18]等多種功能,施用芽孢桿菌可改善作物根區(qū)土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)[19]。然而,關(guān)于施用側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)煙株鉀含量、抗病性的影響及其生理機(jī)制的研究還鮮見報(bào)道。為此,本研究以煙草品種K326為試驗(yàn)材料,在煙草移栽期施用側(cè)孢短芽孢桿菌,研究不同施用方式對(duì)烤后煙葉鉀含量及葉片抗病性、光合色素含量、抗逆生理指標(biāo)的影響,探究側(cè)孢短芽孢桿菌的最佳施用方式,旨在為煙草種植過程中微生物制劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在重慶市彭水苗族土家族自治縣龍?zhí)拎l(xiāng)雙星村(29°08′73″N,108°00′65″E)煙田進(jìn)行。試驗(yàn)地肥力中等,條件良好,土壤pH值為5.58,有機(jī)質(zhì)、全氮含量分別為21.0、0.97 g·kg-1,堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為85.7、8.39、145.7 mg·kg-1。當(dāng)?shù)貙賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候,多年平均氣溫14.5 ℃,年平均降水量1 200 mm。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

供試煙草品種為K326,由重慶市煙草公司彭水縣分公司提供。供試微生物菌株為側(cè)孢短芽孢桿菌HA-2(CGMCC編號(hào)24130),經(jīng)發(fā)酵、離心濃縮、噴霧干燥制備菌粉,有效活菌數(shù)約為8×1010CFU·g-1,由河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院特色生物資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室提供。

UV-2600i紫外可見分光光度計(jì),日本Shimadzu;Gr36石墨消解儀,上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司;FP640火焰光度計(jì),上海精密儀器儀表有限公司;Forma 88700V超低溫冰箱,美國Thermo Fisher;5810R高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf;MGC-450光照培養(yǎng)箱,鄭州生元儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)置4個(gè)處理,每個(gè)處理重復(fù)3次,共計(jì)12個(gè)小區(qū),每個(gè)小區(qū)4行,株距50 cm,行距1.2 m,四周設(shè)置保護(hù)行。2021年4月27日在煙草移栽期按照各處理的設(shè)計(jì)開展試驗(yàn):T1(對(duì)照),不施用側(cè)孢短芽孢桿菌;T2(浸根處理),將煙苗根部放入側(cè)孢短芽孢桿菌稀釋液(1 g·L-1)中浸根4 h,之后移栽覆土;T3(灌根處理),煙苗移栽后,在煙苗根部半徑5 cm范圍內(nèi)均勻灌入100 mL質(zhì)量濃度為1 g·L-1的側(cè)孢短芽孢桿菌稀釋液;T4(浸根+灌根),移栽前,將煙苗根部放入側(cè)孢短芽孢桿菌稀釋液(1 g·L-1)中浸根4 h,煙苗移栽后,在煙苗根部半徑5 cm范圍內(nèi)均勻灌入100 mL質(zhì)量濃度為1 g·L-1的側(cè)孢短芽孢桿菌稀釋液。

各處理除側(cè)孢短芽孢桿菌的施用方式不同外,其余田間栽培管理措施均按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。從2021年7月5日第一次煙葉達(dá)到成熟采烤水平至2021年8月26日采烤完成,共采收5次。

1.4 指標(biāo)測定

分別在烤煙移栽后30 d(團(tuán)棵期)、60 d(旺長期)、90 d(成熟期)在每個(gè)處理小區(qū)取代表性烤煙5株,用剪刀剪取葉片,采用丙酮法測定新鮮煙葉的葉綠素和類胡蘿卜素含量,采用氮藍(lán)四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性,采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(MDA)含量。上述指標(biāo)均以鮮重計(jì)。

分別在烤煙移栽后的30、60、90 d,在每個(gè)小區(qū)取5株代表性烤煙的根系,105 ℃殺青,68 ℃烘至質(zhì)量恒定,備用。于采收結(jié)束時(shí),取烤后上部煙葉(B2F)、中部煙葉(C3F)各2.5 kg,備用。將上述樣品粉碎,過20目篩,用火焰光度計(jì)法測定鉀含量。

烤煙移栽后60 d,依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》,田間調(diào)查供試煙株氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的發(fā)生情況,計(jì)算發(fā)病率與病情指數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù),采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析,對(duì)有顯著(P<0.05)差異的,采用Duncan法進(jìn)行多重比較。用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)煙株鉀含量的影響

各處理煙株根系的鉀含量隨時(shí)間推進(jìn)表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(圖1)。移栽30 d時(shí),T4處理煙株根系鉀含量達(dá)到測定時(shí)段內(nèi)的最大值(2.89%),顯著高于其他處理,較T1增加16.58%,T1、T2、T3處理間無顯著差異;移栽60 d時(shí),T2、T3處理煙株根系鉀含量與T1、T4處理的差異均不顯著,T4處理煙株根系鉀含量較T1顯著增加18.88%;移栽90 d時(shí),T2、T3、T4處理煙株根系鉀含量較T1分別顯著增加39.98%、38.20%和28.85%。綜上,施用側(cè)孢短芽孢桿菌可提高煙株根系的鉀含量,總的來看,以浸根+灌根的施用方式整體表現(xiàn)最佳,單獨(dú)浸根或灌根的施用方式對(duì)根系鉀含量的影響主要表現(xiàn)在中后期。

同一時(shí)間柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same letters indicate significant difference between treatments at P<0.05 on the same day. The same as below.圖1 不同處理對(duì)煙株根系鉀含量的影響Fig.1 Effect of treatments on potassium content in tobacco root

施用側(cè)孢短芽孢桿菌可提高烤后煙葉的鉀含量(圖2)。T2處理烤后上部葉、中部葉的鉀含量與T1均無顯著差異;T3處理烤后上部葉的鉀含量較T1顯著提高29.77%,中部葉的鉀含量與T1無顯著差異;T4處理烤后上部葉和中部葉的鉀含量分別較T1顯著提高29.86%、67.36%。不同施用方式下作用效果的差異可能與側(cè)孢短芽孢桿菌在根系中的定殖狀況、作用時(shí)效有關(guān)。

圖2 不同處理對(duì)烤后煙葉鉀含量的影響Fig.2 Effect of treatments on potassium content in cured tobacco leaves

總的來看,浸根+灌根的處理較單獨(dú)灌根或浸根的處理更利于提高烤后煙葉的鉀含量。

2.2 施用側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)烤煙抗病性的影響

移栽60 d,施用側(cè)孢短芽孢桿菌處理的煙株氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的發(fā)病率均較T1處理顯著下降(表1)。在這幾種病害中,氣候斑病的發(fā)病率最高,葉斑病的發(fā)病率最低。與T1處理相比:T2、T3、T4處理氣候斑病的發(fā)病率分別下降2.60、3.01、4.32百分點(diǎn),T4處理氣候斑病的病情指數(shù)顯著降低;T2、T3、T4處理炭疽病的發(fā)病率分別下降0.76、1.17、2.11百分點(diǎn),T4處理炭疽病的病情指數(shù)顯著降低;T2、T3、T4處理赤星病的發(fā)病率分別下降1.43、1.82、4.08百分點(diǎn),T2、T3、T4處理赤星病的病情指數(shù)顯著降低,且T4處理赤星病的病情指數(shù)還顯著低于T2和T3處理;T2、T3、T4處理葉斑病的發(fā)病率分別下降2.87、2.53、3.24百分點(diǎn),T2、T3、T4處理葉斑病的病情指數(shù)顯著降低?？偟膩砜?T4處理下煙株對(duì)上述各種病害的抗病性最好。

表1 不同處理對(duì)煙株抗病性的影響Table 1 Effects of treatments on disease resistance of tobacco

2.3 施用側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)煙葉光合色素的影響

移栽30～90 d時(shí),各處理煙葉的葉綠素含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(圖3),在移栽60 d時(shí)達(dá)到測定時(shí)段內(nèi)各處理下的最大值。移栽30 d時(shí),T4處理煙葉的葉綠素含量較T1處理顯著提高16.39%,T2、T3處理煙葉的葉綠素含量與T1、T4處理均無顯著差異;移栽60 d時(shí),T2、T3、T4處理煙葉的葉綠素含量較T1顯著提高8.48%～13.21%,且T4處理煙葉的葉綠素含量還顯著高于T2;移栽90 d時(shí),T2、T3、T4處理煙葉的葉綠素含量同樣較T1顯著提高,其中,T4處理煙葉的葉綠素含量較T1處理顯著提高18.81%。綜上,浸根+灌根的處理可顯著提高移栽30～90 d內(nèi)煙葉的葉綠素含量。

圖3 不同處理對(duì)煙葉葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of treatments on chlorophyll content in tobacco leaves

移栽30～90 d時(shí),各處理煙葉的類胡蘿卜素含量同樣表現(xiàn)出先升后降的趨勢(圖4)。移栽30 d時(shí),T2、T3、T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量較T1顯著提高10.49%～22.84%。移栽60 d時(shí),T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量最高,較T1處理顯著提高21.01%;T2處理煙葉的類胡蘿卜素含量與T1無顯著差異。移栽90 d時(shí),T2、T3、T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量均較T1顯著提高,且以T4處理煙葉的類胡蘿卜素含量最高,較T1處理顯著提高35.41%。綜上,浸根+灌根的施用方式最利于提高煙葉的類胡蘿卜素含量。

圖4 不同處理對(duì)煙葉類胡蘿卜素含量的影響Fig.4 Effect of treatments on carotenoid content in tobacco leaves

2.4 施用側(cè)孢短芽孢桿菌對(duì)煙葉抗氧化酶活性及MDA含量的影響

移栽30 d時(shí),T4處理煙葉的SOD活性較T1處理顯著提高9.63%(圖5),但其余處理間無顯著差異。隨著生育時(shí)期推進(jìn),煙葉的SOD活性逐漸增高,處理間的差異越大。移栽60、90 d時(shí),T2、T3、T4處理煙葉的SOD活性均顯著高于T1,且以T4處理煙葉的SOD活性最高,分別較T1處理顯著增加14.44%、18.31%。

圖5 不同處理對(duì)煙葉超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.5 Effect of treatments on superoxide dismutase (SOD) activity in tobacco leaves

測定期內(nèi),各處理煙葉的POD活性隨時(shí)間推進(jìn)呈逐漸升高的趨勢(圖6)。移栽30、60 d時(shí),僅T4處理煙葉的POD活性顯著高于T1,增幅分別為11.62%、12.17%。移栽90 d時(shí),T2、T3、T4處理煙葉的POD活性較T1處理顯著增加4.87%～13.81%,以T4處理煙葉的POD活性最高,且顯著高于T2處理?？偟膩砜?測定期內(nèi)T4處理煙葉的POD活性始終最高,說明該施用方式提升煙葉POD活性的效果最佳。

圖6 不同處理對(duì)煙葉過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.6 Effect of treatments on peroxidase (POD) activity in tobacco leaves

移栽30～90 d,煙葉的MDA含量隨時(shí)間推進(jìn)總體呈遞增趨勢(圖7),且各時(shí)期都以T1處理煙葉的MDA含量最高。移栽30 d時(shí),T2處理煙葉的MDA含量與T1無顯著差異,T4處理煙葉的MDA含量較T1處理顯著降低30.99%。移栽60 d時(shí),T2、T3、T4處理煙葉的MDA含量均顯著低于T1,且以T4處理最低,較T1處理顯著降低29.39%。移栽90 d時(shí),T2、T3、T4處理葉片的MDA含量分別較T1顯著降低9.45%、14.47%、20.76%,且T4處理葉片的MDA含量還顯著低于T2和T3處理?？偟膩砜?施用側(cè)孢短芽孢桿菌可降低葉片的MDA含量,單獨(dú)采用浸根或灌根方式的效果無顯著差異,浸根+灌根處理的效果最佳。

3 討論

提高煙葉鉀含量有利于提升烤煙品質(zhì)[20]。為了實(shí)現(xiàn)煙葉增鉀提質(zhì)的目標(biāo),生產(chǎn)上已廣泛采用增施鉀肥、優(yōu)化施鉀方式、增加追肥次數(shù)[21-22]等措施,并導(dǎo)致鉀肥過量施用、資源浪費(fèi)和用工成本增加等問題[23]。研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌是一種典型的根際促生菌,側(cè)孢短芽孢桿菌具有解鉀的功能,同時(shí)具有防病及促生作用。劉芳等[24]研究表明,微生物菌劑配施腐殖酸鉀可顯著增加土壤的速效鉀含量,提高作物鉀含量。芽孢桿菌與煙株根際的解鉀細(xì)菌具有親和性[25],施用側(cè)孢短芽孢桿菌可在干旱條件下促進(jìn)玉米鉀累積,提高其抗旱性與產(chǎn)量[17]。煙株中上部葉的鉀含量偏低,多與生育后期土壤供鉀不足、根系吸收減少有關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn),施用側(cè)孢短芽孢桿菌可促進(jìn)根系鉀吸收,提高根系鉀含量,顯著提高烤后煙中上部葉的鉀含量,其中,以浸根+灌根方式的效果最佳,但與灌根方式相比,二者上部葉的鉀含量差異不顯著,這可能是由于雖然浸根+灌根處理增加了根系及中部葉的鉀含量,但由于生物競爭,上部葉獲得的鉀素來源少,因而效果不及中部明顯。

在當(dāng)前的煙葉生產(chǎn)中,由于煙田土壤微生物結(jié)構(gòu)破壞、土壤酶活性降低及作物抗性下降,病害頻繁發(fā)生,嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量、品質(zhì)和種植效益[27]。側(cè)孢短芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),對(duì)植物病原真菌及細(xì)菌均有一定的抑制作用[28],可以預(yù)防番茄青枯病的發(fā)生[29],對(duì)煙草黑脛病菌也具有抑制作用[30]。本研究發(fā)現(xiàn),施用側(cè)孢短芽孢桿菌可提高煙株的鉀含量,提高其對(duì)氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的抗性。這與董艷等[31]的研究結(jié)果相似。不同施用方式相比,以浸根+灌根的效果最佳。

作物的養(yǎng)分吸收利用和抗病性均與其抗逆能力有關(guān)。光合作用可間接反映作物的長勢與抗逆性[32]。葉綠素a、b分別是光反應(yīng)的中心色素分子和捕光色素分子,類胡蘿卜素是內(nèi)源抗氧化劑,可淬滅活性氧,防止細(xì)胞膜脂過氧化[33]。作物體內(nèi)的SOD和POD可維持活性氧平衡、清除H2O2,保持細(xì)胞膜穩(wěn)定性[34-35],而MDA的大量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞造成傷害,引起植物生長發(fā)育受阻[36]。改善作物抗逆能力,提高SOD、POD活性,有利于降低其膜脂過氧化程度,提高作物的抗逆能力。施用微生物菌劑可改善作物的土壤環(huán)境,提高土壤微生物數(shù)量[37],進(jìn)而促進(jìn)作物葉綠素?zé)晒鈪?shù)的提高,增強(qiáng)其對(duì)有效光的利用[38-40]。蘇煜等[41]研究發(fā)現(xiàn),增施枯草芽孢桿菌可顯著提升烤煙的光合作用效率,強(qiáng)化碳代謝。肖雨沁等[42]研究表明,施用側(cè)孢短芽孢桿菌可顯著提高煙苗的SOD、POD和過氧化氫酶(CAT)活性,降低MDA含量,促進(jìn)煙苗根系發(fā)育,培育壯苗,提升煙葉品質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),科學(xué)施用側(cè)孢短芽孢桿菌可顯著提高葉片的光合色素含量和抗氧化酶活性,降低MDA含量,從而提高煙草的抗逆能力。

綜上,本研究以不施用側(cè)孢短芽孢桿菌作為對(duì)照,研究浸根、灌根及浸根+灌根對(duì)煙草鉀含量、抗病性及葉片生理特征的影響。結(jié)果表明,以浸根+灌根的方式施用側(cè)孢短芽孢桿菌可以提高烤后煙葉的鉀含量,提高葉片光合色素含量,及SOD、POD活性,降低MDA含量,增強(qiáng)煙株對(duì)氣候斑病、炭疽病、赤星病和葉斑病的抗性。研究結(jié)果可為烤煙的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供新的思路和參考。