顧占國, 李 軍, 梁金屏, 石福民

(河北省唐山市人民醫(yī)院頭頸外科, 河北 唐山 063000)

甲狀腺癌為內(nèi)分泌惡性腫瘤中常見的一種,約占全身惡性腫瘤的1.0%～5.0%,甲狀腺癌可按組織學(xué)分類為未分化型以及分化型,其中大約90%為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC),大部分DTC患者經(jīng)規(guī)范化治療后能獲得良好預(yù)后,5年生存率可達(dá)90%,但仍有部分病例預(yù)后不良,故早期評估DTC預(yù)后有一定臨床指導(dǎo)意義[1]。近些年生物學(xué)分子標(biāo)志物在DTC發(fā)生、疾病進(jìn)展及預(yù)后評估中受到廣泛關(guān)注,趨化因子4受體(Chemokine 4 receptor,CXCR4)在細(xì)胞分化、增殖、侵襲、浸潤及腫瘤生長等過程中發(fā)揮重要作用,CXCR4異常表達(dá)與分化型甲狀腺癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[2]。微纖維相關(guān)蛋白2(microfibril associated protein 2,MFAP2)是一種在組織穩(wěn)態(tài)、微纖維組裝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,其水平異常升高可促使細(xì)胞增殖、侵襲及遷移,并阻止細(xì)胞凋亡,是胰腺癌潛在的生物標(biāo)志物[3]。Krüppel樣因子4(Krüppel like factor 4,KLF4)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,在不同腫瘤中充當(dāng)抑癌或促癌基因,已有研究表明KLF4在肝癌、宮頸癌、腎癌、卵巢癌等腫瘤中呈低表達(dá),KLF4低表達(dá)能促進(jìn)腫瘤增殖[4]。目前國內(nèi)關(guān)于CXCR4、MFAP2、KLF4與DTC的系統(tǒng)報道較少,本研究擬研究CXCR4、MFAP2、KLF4在DTC中的表達(dá)及對預(yù)后的預(yù)測價值,希望為臨床診治DTC提供指導(dǎo),報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:本研究取得本院倫理委員會批準(zhǔn)。選擇我院2019年7月至2020年7月收治的113例DTC患者,術(shù)中留取其癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤切緣≥2cm),其中男28例、女85例;年齡為19～72歲,平均(54.29±6.11)歲;病理類型:乳頭狀癌82例、濾泡狀癌31例;瘤灶直徑:<2cm 51例,≥2cm 62例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期40例、Ⅲ期73例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75例;腫瘤分化程度:中高分化44例、低分化69例。納入標(biāo)準(zhǔn):①原發(fā)性腫瘤且為初次手術(shù),經(jīng)術(shù)后病理證實(shí);②意識清楚且認(rèn)知功能正常;③病歷資料完整;④簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①有其他部位惡性腫瘤;②有感染性或傳染性疾病;③良惡性結(jié)節(jié)并存;④入組前接受手術(shù)或放化療等;⑤合并終末期腎病、終末期肝病等影響生存期的疾病;⑥已出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移;⑦有頸部手術(shù)史或嚴(yán)重凝血功能障礙;⑧妊娠、哺乳期女性;⑨生存時間預(yù)計小于3個月。

1.2方 法

1.2.1收集資料:包括癌灶直徑(<2cm/≥2cm)、年齡(<50歲/≥50歲)、性別(男/女)、病理類型(乳頭狀癌/濾泡狀癌)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無/有)、腫瘤分化程度 (中高分化/低分化)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期/Ⅲ期)等。

1.2.2采用蛋白免疫印跡法檢測DTC組織及癌旁正常組織中CXCR4、MFAP2、KLF4表達(dá)水平:術(shù)中留取癌組織及癌旁正常組織液氮下保存,放于-80℃冰箱中保存待測。取組織標(biāo)本,RIPA裂解,提取總蛋白,BCA法測蛋白濃度,100℃下變性,SDS-PAGE電泳分離總蛋白,轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉2h,TBST洗滌(5min/次,3次),將其放入對應(yīng)的一抗(CXCR4、MFAP2、KLF4、GAPDH)以及一抗稀釋液(1∶500)混懸液中,4℃條件下孵育過夜,TBST洗滌(5min/次,3次),放入二抗以及二抗稀釋液(1∶2000)混懸液中,25℃條件下孵育120min,TBST洗滌(5min/次,3次),將超敏ECL發(fā)光液滴于膜上,行顯影、定影處理,以GAPDH為內(nèi)參,Image J軟件分析各目標(biāo)條帶灰度值。

1.2.3隨訪情況:DTC患者出院后,采用電話或者門診復(fù)查的方式隨訪3年,每半年隨訪1次,隨訪截止到2023年7月或死亡,統(tǒng)計DTC患者3年總生存情況。

2 結(jié) 果

2.1DTC組織及癌旁正常組織中CXCR4、MFAP2、KLF4表達(dá)情況:與癌旁正常組織比較,DTC組織CXCR4、MFAP2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05),KLF4蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 DTC組織及癌旁正常組織中CXCR4 MFAP2 KLF4表達(dá)情況

2.2癌組織中CXCR4、MFAP2、KLF4表達(dá)水平與DTC臨床病理特征的關(guān)系:性別、年齡、病理類型、癌灶直徑不同者CXCR4、MFAP2、KLF4蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),TNM分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤低分化者CXCR4、MFAP2蛋白表達(dá)量顯著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤中高分化者(P<0.05),TNM分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤低分化者KLF4蛋白表達(dá)量顯著低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤中高分化者(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織中CXCR4 MFAP2 KLF4表達(dá)水平與DTC臨床病理特征的關(guān)系

2.3CXCR4、MFAP2、KLF4對DTC預(yù)后的預(yù)測價值:113例DTC患者隨訪3年期間失訪8例,最終獲得隨訪者105例。死亡組患者CXCR4、MFAP2蛋白表達(dá)量顯著高于存活組(P<0.05),KLF4蛋白表達(dá)量顯著低于存活組(P<0.05)(表3)。繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),CXCR4、MFAP2、KLF4單獨(dú)或聯(lián)合預(yù)測DTC預(yù)后的AUC(95%CI)分別為0.692(0.562～0.823)、0.729(0.590～0.869)、0.766(0.622～0.910)、0.832(0.690～0.975),聯(lián)合預(yù)測的效能顯著優(yōu)于單項檢測(P<0.05)(表4、圖1)。

圖1 血清t-PA、CgA、LP-PLA2單獨(dú)或聯(lián)合預(yù)測PCI術(shù)后發(fā)生MACE的ROC曲線

表3 死亡組與存活組CXCR4 MFAP2 KLF4表達(dá)情況

表4 CXCR4 MFAP2 KLF4對DTC預(yù)后的預(yù)測價值

2.4Cox回歸模型單因素和多因素分析影響DTC預(yù)后的相關(guān)因素:Cox回歸分析顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、腫瘤低分化、CXCR4表達(dá)升高、MFAP2表達(dá)升高、KLF4表達(dá)降低是DTC預(yù)后的危險因素(P<0.05)。見表5。

3 討 論

趨化因子是一類能夠激活并趨化白細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子,可參與惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展,趨化因子的受體分別為CC受體、CXC受體、XC受體、CX3C受體。CXCR4屬于CXC受體,它的特異性配體為趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor,SDF-1)。CXCR4/SDF-1軸可以聚合癌細(xì)胞肌動蛋白絲,形成假偽足誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移,同時還可促使腫瘤血管形成,影響腫瘤生長[5]。本研究結(jié)果顯示,DTC組織CXCR4蛋白表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織,表明CXCR4在DTC中呈高表達(dá),與Wilhelm A等[6]報道中CXCR4的變化趨勢基本相同。同時,TNM分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤低分化者CXCR4蛋白表達(dá)量顯著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤中高分化者,提示CXCR4可能參與了DTC進(jìn)展過程。對其預(yù)后研究發(fā)現(xiàn),死亡組患者CXCR4蛋白表達(dá)量顯著高于存活組,且CXCR4表達(dá)升高是DTC預(yù)后的危險因素,說明CXCR4在DTC預(yù)后評估方面有一定潛力。分析原因可能為CXCR4可能與其特異性配體結(jié)合,形成CXCR4/SDF-1軸,促使DTC生長、浸潤及轉(zhuǎn)移,致其進(jìn)展和預(yù)后不良。

MFAP2也稱為微纖絲相關(guān)糖蛋白1,由183個氨基酸組成,它與細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的微纖維有關(guān),MFAP2缺陷將引起整合素-基質(zhì)之間的相互作用減少。MFAP2可通過激活TGF-β/SMAD2/3通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。MFAP2表達(dá)水平與超聲造影參數(shù)[達(dá)峰時間(time to peak,TTP)、峰值強(qiáng)度(peak intensity,PI)、平均通過時間(mean transit time,MTT)]有顯著關(guān)系,有助于早期評估甲狀腺癌預(yù)后[8]。本研究結(jié)果表明,分化型甲狀腺癌患者腫瘤組織中MFAP2呈高表達(dá),其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、TNM分期及3年總生存率相關(guān),結(jié)合Dong S Y等[9]的報道推測MFAP2可能通過促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲能力,降低細(xì)胞凋亡率,而促進(jìn)DTC發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后。

KLF4屬于Krüppel樣因子家族中的重要一員,分布于血管內(nèi)皮、巨噬細(xì)胞等中,能夠參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)進(jìn)程,在多種腫瘤形成與發(fā)展中有重要作用。結(jié)直腸癌患者KLF4低表達(dá)與總生存率降低相關(guān),KLF4可通過上調(diào)p21WAF1/Cip1以及下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[10]。KLF4能參與胃腸道上皮的增殖、分化及腫瘤形成的調(diào)節(jié),KLF4在胃癌中扮演抑癌基因角色。KLF4可通過抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Cysteine rich acidic secretory protein,SPARC)表達(dá)來抑制肺癌細(xì)胞侵襲。本研究結(jié)果顯示,DTC組織中KLF4蛋白表達(dá)量較癌旁正常組織低,且KLF4低表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、TNM分期及3年總生存率均有關(guān),提示KLF4參與DTC發(fā)生和發(fā)展,并推測KLF4在DTC病理過程中發(fā)揮抑癌作用,KLF4低表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)N-鈣粘蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2/9表達(dá)等有關(guān)[11]。

繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),CXCR4、MFAP2、KLF4單獨(dú)或聯(lián)合預(yù)測DTC預(yù)后的AUC(95%CI)分別為0.692(0.562～0.823)、0.729(0.590～0.869)、0.766(0.622～0.910)、0.832(0.690～0.975),可見聯(lián)合預(yù)測的效能顯著優(yōu)于單項檢測,提示CXCR4、MFAP2、KLF4聯(lián)合檢測有助于預(yù)測分化型甲狀腺癌預(yù)后。

綜上所述,分化型甲狀腺癌患者腫瘤組織中CXCR4、MFAP2呈高表達(dá),KLF4呈低表達(dá),其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、TNM分期及3年總生存率相關(guān),三者聯(lián)合檢測有助于預(yù)測分化型甲狀腺癌預(yù)后。本研究也有一定缺陷,如隨訪時間比較短、樣本數(shù)較少等,未來待完善。