白繼昌, 談力欣, 劉贊朝, 楊 洋, 朱亞軍

(1.河北省石家莊市第二醫(yī)院, 河北 石家莊 050000 2.河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科, 河北 石家莊 050000)

脂肪細(xì)胞通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌在脂肪和葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用。脂肪細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)的紊亂被認(rèn)為是代謝綜合征的發(fā)病機(jī)制[1]。此外,內(nèi)臟區(qū)域脂肪細(xì)胞的過度積累與腫瘤壞死因子α ( tumor necrosis factor a,TNF-α )的表達(dá)升高有關(guān)。與內(nèi)臟脂肪堆積相關(guān)的脂肪細(xì)胞對細(xì)胞因子產(chǎn)生的異常調(diào)節(jié)似乎導(dǎo)致了代謝綜合征中的血脂紊亂、高血壓和葡萄糖不耐受。脂肪細(xì)胞的大小根據(jù)代謝條件而變化。這種特征實際上似乎是肥胖和代謝綜合征發(fā)病機(jī)制的一個因素。這些細(xì)胞大小的變化伴隨著甘油三酯合成、游離脂肪酸(FFA)產(chǎn)生和細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化。較大的脂肪細(xì)胞傾向于分泌細(xì)胞因子IFN-γ和抵抗素,較小的脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素[2]。因此,脂肪細(xì)胞的大小似乎是脂肪組織中細(xì)胞因子產(chǎn)生類型的組織學(xué)標(biāo)志。研究表明,內(nèi)臟脂肪的堆積而非皮下脂肪的堆積,是由于堆積的脂肪細(xì)胞分泌TNF-α增多而引起系統(tǒng)性胰島素抵抗[3]。IFN-γ通過激活JAK/STAT途徑減弱人類脂肪細(xì)胞中的胰島素信號傳導(dǎo)、脂質(zhì)儲存和分化[4]。因此,脂肪細(xì)胞根據(jù)脂肪組織的積聚位置調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,脂肪細(xì)胞的功能變化隨后導(dǎo)致胰島素抵抗?；蛐酒治霭l(fā)現(xiàn),內(nèi)臟區(qū)域聚集的脂肪細(xì)胞表達(dá)多種基因,尤其是蛋白酶基因家族,導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[5]。因此,了解積聚在內(nèi)臟區(qū)域的脂肪細(xì)胞功能變化的潛在機(jī)制,了解分泌IFN-γ和其他細(xì)胞因子的細(xì)胞的特征是十分重要的。本研究的目的是確定哪些類型的脂肪細(xì)胞表達(dá)IFN-γ,并闡明內(nèi)臟脂肪細(xì)胞功能變化與高脂肪攝入有關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1從小鼠脂肪組織中分離脂肪細(xì)胞:從8周齡開始,給予雄性C57 BL/6 J小鼠(Charles River,MA)正常飲食或含有20%蛋白質(zhì)、20%碳水化合物和60%脂肪的高脂肪飲食(Research Diet,New Brunswick,NJ)。14d后處死兩組小鼠,此時對照組平均體重為25.1g,高脂喂養(yǎng)組平均體重為28.3g。取附睪、腸系膜或皮下脂肪組織,稱重,用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗,切碎,在含有4%牛血清白蛋白(BSA)和1mg/mL I型膠原酶(NITTA GELATIN,Osaka,日本)的Krebs-Ringer磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中37℃消化60min。將消化的組織通過250μm尼龍網(wǎng)過濾以去除未消化的組織,并以400rpm離心4min。洗滌漂浮的脂肪細(xì)胞部分,并用70μm尼龍過濾器將大脂肪細(xì)胞與小脂肪細(xì)胞分離。

1.2細(xì)胞培養(yǎng):3T3-L1細(xì)胞(American Type Culture Collection,美國)維持在含有25mM葡萄糖(DMEM-H)培養(yǎng)基(Sigma Chemicals,St.Louis,MO)的DMEM中,該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血清(Gemini Bio Products,美國)和慶大霉素硫酸鹽(Schering-Plough,美國),溫度為37℃,濕度為5%CO2/95%空氣。3T3-L1脂肪細(xì)胞參照前面描述的方法分化。

1.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA):將缺乏血清的3T3-L1脂肪細(xì)胞與由肉豆蔻酸鹽和棕櫚酸鹽組成的FFAs混合物(Sigma Chemicals)或500μM Zymosan A(Wako Chemicals,Osaka,Japan)孵育,并根據(jù)制造商的說明書(BioLegend,美國)對培養(yǎng)基中的小鼠TNF-a進(jìn)行測定。

1.4使用定量實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction ,RT-PCR)測量mRNA水平: 用ISOGEN(Nippon gene,日本)從附睪脂肪組織分離的脂肪細(xì)胞或3T3-L1脂肪細(xì)胞中分離總RNA。小鼠TLR2和TNF-a mRNA表達(dá)水平通過定量實時RT-PCR測定,基本上如前所述[6]。

1.5流式細(xì)胞儀分析:從脂肪組織中分離的脂肪細(xì)胞( 1×106個細(xì)胞)用4 %多聚甲醛固定,PBS洗滌。將固定的脂肪細(xì)胞與2μg鼠Toll樣受體2 ( toll-like receptor 2,TLR2 )單克隆抗體偶聯(lián)的藻紅蛋白( PE ) ( e-bioscience,美國)在Hanks平衡鹽溶液( HBSS )中室溫避光孵育60min。然后將小鼠TNF-α多克隆抗體(Rockland Immunochemicals,美國)偶聯(lián)異硫氰酸熒光素( FITC )與含有0.1 %皂甙( Wako chemicals,日本)的HBSS在室溫下避光孵育脂肪細(xì)胞60min。細(xì)胞用PBS洗滌3次,用FACS流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀( Becton-Dickinson )分析。使用與正常IgG綴合的PE或FITC孵育的細(xì)胞作為陰性對照。

1.6TLR2的siRNA敲除:用5nmoL TLR2 siRNA或Allstars陰性對照siRNA(Qiagen,德國)通過電穿孔轉(zhuǎn)染3T3-L1脂肪細(xì)胞。處理后的細(xì)胞立即在37℃,濕度為5%CO2/95%空氣。然后對細(xì)胞進(jìn)處理。

1.7蘇木精-伊紅染色和免疫組化分析:石蠟包埋后,切片(4μm厚度)用蘇木精-伊紅染色。使用ImageJ軟件計算胰島的大小。用抗TLR2和IFN-γ的特異性抗體(Santa Cruz,美國)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,以檢測脂肪組織中的炎癥因子和胰島素途徑蛋白表達(dá)。使用鏈霉親和素過氧化物酶組織染色SP試劑盒檢測抗體反應(yīng)性。免疫組化陽性染色定義為黃棕色。

1.8統(tǒng)計分析:本研究的數(shù)據(jù)以平均值±SE的形式表示。均值之間差異的顯著性通過使用Statistica軟件(Tulsa,OK)的單向或雙向方差分析和不平衡設(shè)計的Tukey檢驗進(jìn)行評估,或通過使用Statview軟件(Abacus Concepts,Berkeley)的雙尾不配對Student t檢驗進(jìn)行評估。P<0.05被認(rèn)為是具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1高脂攝入小鼠附睪脂肪中脂肪細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)與脂肪細(xì)胞肥大:為了解 IFN-γ基因表達(dá)與脂肪細(xì)胞肥大的關(guān)系,分析了高糖攝入對小鼠脂肪組織中 IFN-γ表達(dá)的影響。喂食高脂飲食2周的小鼠和喂食正常飲食的小鼠在口服葡萄糖負(fù)荷后血糖水平?jīng)]有顯著差異。胰島素耐受試驗表明,與對照組小鼠相比,喂食高脂肪飲食的小鼠胰島素敏感性降低。(胰島素負(fù)荷后30min,血糖水平分別為147.7±30.9mg/dL 和43.3±32.0mg/dL。)與正常組相比,高脂飲食組小鼠附睪脂肪組織中 IFN-γ mRNA 表達(dá)水平顯著升高(圖1A)。為了確定脂肪細(xì)胞中IFN-γ mRNA表達(dá)與其大小的關(guān)系,我們使用膠原酶處理,然后用2%四氧化鋨固定,測量了從附睪脂肪墊分離的脂肪細(xì)胞的直徑。喂食高糖的小鼠中的大脂肪細(xì)胞數(shù)量高于喂食正常飲食的小鼠(圖1B)。我們通過尼龍網(wǎng)篩過濾將分離的漂浮脂肪細(xì)胞分為兩組。小脂肪細(xì)胞被定義為直徑<70μm,而大脂肪細(xì)胞則被定義為具有>70μm的直徑。在喂食高脂肪飲食的小鼠中,兩組細(xì)胞中的IFN-γ mRNA表達(dá)水平均增加(圖1C)。一個值得注意的發(fā)現(xiàn)是,高脂肪攝入在較大脂肪細(xì)胞中的影響比在較小脂肪細(xì)胞中更明顯。這些結(jié)果表明,高糖攝入誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞,特別是大脂肪細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)。

圖1 附睪脂肪組織和脂肪細(xì)胞的細(xì)胞大小和IFN-γ mRNA表達(dá)。從正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)2周的小鼠中分離附睪脂肪組織。

2.2高脂肪飲食小鼠和正常飲食的小鼠在大脂肪細(xì)胞中基因表達(dá)譜的比較:為了闡明高脂肪攝入誘導(dǎo)分離脂肪細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)的機(jī)制,我們使用微陣列分析了高脂肪飲食小鼠和正常飲食小鼠的大脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)譜。對喂食高脂肪飲食的小鼠脂肪細(xì)胞中表達(dá)顯著增加的560個基因進(jìn)行了進(jìn)一步分析(圖2)。在這些基因中,我們關(guān)注TLR2基因,因為它對免疫細(xì)胞中IFN-γ mRNA表達(dá)的影響[9]。為了確定TLR2表達(dá)對分離的脂肪細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)的影響,我們使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測表達(dá)TLR2或IFN-γ的脂肪細(xì)胞的數(shù)量。在喂食正常飲食的小鼠的附睪脂肪組織中檢測到表達(dá)TLR2的脂肪細(xì)胞。我們還觀察到,在喂食高脂肪飲食的小鼠中,脂肪細(xì)胞的數(shù)量急劇增加(圖3A)。在高脂肪攝入的小鼠中,表達(dá)IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量也顯著增加(圖3B)。因此,我們試圖確定表達(dá)TLR2的細(xì)胞是否也表達(dá)IFN-γ。流式細(xì)胞術(shù)分析清楚地檢測到在所有小鼠中存在TLR2/IFN-γ共表達(dá)的脂肪細(xì)胞;然而,在高脂肪攝入的小鼠中,這些雙陽性脂肪細(xì)胞的數(shù)量急劇增加(圖3C-E)。因此,我們確定了TLR2和IFN-γ共表達(dá)的脂肪細(xì)胞的數(shù)量在小鼠中通過高脂肪攝入而增加。

圖2 正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)小鼠脂肪細(xì)胞中的差異表達(dá)基因

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析正?；蚋咧嬍承∈蟾讲G脂肪組織中表達(dá)TLR2 / IFN-γ的脂肪細(xì)胞。

從正?；蚋咧嬍澄桂B(yǎng)2周的小鼠中收集附睪脂肪組織,隨后分離脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞用4 %多聚甲醛固定,用PE標(biāo)記的抗小鼠TLR2抗體( FL2-H )和抗小鼠TIFN-γ抗體孵育,然后用FITC標(biāo)記的二抗( FL1-H )染色。從附睪脂肪組織制備的脂肪細(xì)胞暴露于PE偶聯(lián)的抗小鼠TLR2抗體( A )或抗小鼠INF-γ抗體,然后用FITC連接的二抗染色( B )。(C)將從喂食高脂肪飲食的小鼠制備的脂肪細(xì)胞暴露于PE綴合的抗兔正常IgG,然后用FITC連接的第二抗體染色作為陰性對照。來自喂食正常飲食(D)或高脂肪飲食(E)的小鼠的脂肪細(xì)胞暴露于PE綴合的抗小鼠TLR2抗體和抗小鼠IFN-γ抗體,然后用FITC連接的二抗體染色。

2.3TLR2/IFN-γ陽性脂肪細(xì)胞主要存在于內(nèi)臟脂肪組織中:我們還檢測了不同類型脂肪組織中TLR2/IFN-γ陽性脂肪細(xì)胞的比例(表1)。在附睪和腸系膜脂肪組織中,TLR2 / IFN-γ陽性脂肪細(xì)胞的比例分別為脂肪細(xì)胞總數(shù)的7.0 %和7.7 %。皮下脂肪中TLR2/ IFN-γ陽性脂肪細(xì)胞的比例較低(2.0%)。高脂肪飲食使附睪和腸系膜脂肪中TLR2/ IFN-γ陽性脂肪細(xì)胞分別增加到26.9%和18.5%。但皮下脂肪( 1.2 % )中雙陽性脂肪細(xì)胞比例無明顯變化。這些結(jié)果表明,TLR2 / IFN-γ陽性脂肪細(xì)胞主要存在于內(nèi)臟脂肪中,其數(shù)量隨著高脂攝入而增加。

表1 在正常飲食和高脂飲食小鼠的不同脂肪組織中共表達(dá)TLR2和IFN-γ的脂肪細(xì)胞的數(shù)量

2.4高脂肪飲食對小鼠胰腺功能及炎癥反應(yīng)的影響:H&E結(jié)果顯示,與正常飲食小鼠相比,高脂飲食組小鼠的胰島大小和空泡化有代償性增加(圖4A)。與正常飲食小鼠相比,高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的胰島面積顯著增加(圖4B)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與正常飲食小鼠相比,高脂飲食小鼠脂肪組織中TLR2和 IFN-γ的表達(dá)顯著提高(圖4C-D)。

圖4 高脂肪飲食對小鼠胰腺功能及炎癥反應(yīng)的影響

2.5FFAs誘導(dǎo)TLR2 mRNA表達(dá),TLR2激動劑誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌IFN-γ:與喂食正常飲食的小鼠相比,喂食高脂肪飲食的小鼠的血漿FFA水平增加(圖5A)。為了確定TLR2表達(dá)是否有助于脂肪細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá),我們檢測了FFA水平對3T3-L1脂肪細(xì)胞中TLR2表達(dá)與IFN-γ表達(dá)的影響。用棕櫚酸鹽和肉豆蔻酸鹽的混合物處理以時間依賴的方式誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞中TLR2 mRNA的表達(dá)(圖5B)。用已知的TLR2激活劑Zymosan A處理也誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌IFN-γ(圖5C)。為了分析TLR2表達(dá)對FFA誘導(dǎo)的IFN-γ表達(dá)的影響,我們通過用TLR2特異性siRNA預(yù)處理3T3L1脂肪細(xì)胞來敲低TLR2途徑。在用對照siRNA轉(zhuǎn)染的3T3-L1脂肪細(xì)胞中,FFAs誘導(dǎo)IFN-γ mRNA表達(dá)增加三倍。用TLR2特異性siRNA處理使FFA誘導(dǎo)的IFN-γ mRNA表達(dá)水平降低40%(圖5D)。因此,我們得出結(jié)論,TLR2的表達(dá)通過培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中的受體激活引起IFN-γ的表達(dá)。

圖5 FFA誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞中TLR2和IFN-γ的表達(dá)

3 討 論

本研究的目的是了解小鼠脂肪細(xì)胞在高脂肪攝入導(dǎo)致胰島素抵抗過程中的表型變化。本研究進(jìn)行了微陣列分析,以全面比較喂食高脂肪飲食或正常飲食的小鼠中脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)模式。本研究結(jié)果表明,TLR2和IFN-γ基因在高脂飲食的小鼠脂肪細(xì)胞中高度表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定出一組同時表達(dá)TLR2和IFN-γ蛋白的脂肪細(xì)胞。在喂食高脂肪飲食的小鼠中,共表達(dá)TLR2和IFN-γ的脂肪細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。附睪和腸系膜脂肪組織中共表達(dá)TLR2和IFN-γ的脂肪細(xì)胞數(shù)量也顯著高于皮下脂肪組織。在3T3-L1脂肪細(xì)胞中,FFA(棕櫚酸鹽和肉豆蔻酸鹽的混合物)誘導(dǎo)TLR2和IFN-γ mRNA表達(dá),而TLR2特異性siRNA抑制FFA誘導(dǎo)的IFN-γ mRNA的表達(dá)。

脂肪細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子,參與調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。肥胖個體的脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出分泌功能的改變,從而導(dǎo)致更高水平的細(xì)胞因子或促炎分子(包括TNFa、白細(xì)胞介素-6、血管緊張素原和抵抗素)的釋放[7-8]。此外, Wada T等研究指出,Ⅰ型和Ⅱ型IFN通過誘導(dǎo)不同的SOCS亞型誘導(dǎo)胰島素抵抗,IL-6通過增強(qiáng)STAT3介導(dǎo)的3T3-L1脂肪細(xì)胞中SOCS3的誘導(dǎo)而協(xié)同增強(qiáng)IFN-γ誘導(dǎo)的胰島素抵抗[9]。因此,我們重點(diǎn)研究了高脂肪攝入和脂肪細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)之間的關(guān)系,以闡明IFN-γ在積聚的內(nèi)臟脂肪組織中表與喂食正常飲食的小鼠相比,喂食高脂肪飲食的小鼠中的大脂肪細(xì)胞和小脂肪細(xì)胞都表達(dá)更高水平的IFN-γ mRNA。先前已經(jīng)表明,脂肪細(xì)胞肥大與胰島素抵抗有關(guān)[10]。然而,脂肪細(xì)胞中TNFa基因的表達(dá)與胰島素信號傳導(dǎo)受損有關(guān),而與脂肪細(xì)胞大小無關(guān)[11]。我們的研究結(jié)果表明,IFN-γ的表達(dá)在很大程度上取決于高脂肪攝入以及脂肪細(xì)胞肥大。微陣列分析表明,高脂肪飲食改變了大脂肪細(xì)胞中的各種基因。達(dá)誘導(dǎo)背后的機(jī)制。

除了IFN-γ表達(dá)外,喂食高脂肪飲食的小鼠的脂肪細(xì)胞中TLR2基因表達(dá)水平顯著增加。由于TLRs在固有免疫和適應(yīng)性免疫中的重要作用,其功能主要在免疫細(xì)胞中進(jìn)行研究[12-13]。最近的研究表明,TLR2基因多態(tài)性的不同頻率與胰島素抵抗及其相關(guān)疾病的高風(fēng)險顯著相關(guān)[14]。這些觀察結(jié)果以及我們的觀察結(jié)果表明,脂肪組織中TLR2的表達(dá)可能與人類的胰島素抵抗有關(guān)。棕櫚酸酯是一種飽和脂肪酸,可激活TLR2并誘導(dǎo)促炎途徑,導(dǎo)致肌管中的胰島素抵抗[15]。在本研究中,發(fā)現(xiàn)FFA刺激顯著增加了3T3-L1脂肪細(xì)胞中TLR2和IFN-γ mRNA的表達(dá)水平,并且脂肪細(xì)胞中的TLR2表達(dá)的敲低未能通過FFA增加IFN-γ基因的表達(dá)。因此,脂肪細(xì)胞中的TLR2信號被認(rèn)為是由FFA激活的。健康受試者的FFA升高會短暫誘導(dǎo)胰島素抵抗,肌肉細(xì)胞中的FFA暴露會通過NF-κB和蛋白激酶Cs激活炎癥途徑[16]。FFA水平的升高也可能激活脂肪細(xì)胞中的炎癥途徑,TLR2似乎通過誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生來促進(jìn)該途徑。

在本研究中,初步鑒定了內(nèi)臟脂肪組織中共表達(dá)IFN-γ和TLR2的脂肪細(xì)胞,并且脂肪細(xì)胞的數(shù)量因高脂肪攝入而增加。共表達(dá)IFN-γ和TLR2的脂肪細(xì)胞可能是脂肪組織中的“病理”細(xì)胞,參與代謝綜合征中胰島素抵抗的發(fā)展。細(xì)胞的進(jìn)一步表征將提供關(guān)于脂肪細(xì)胞在胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制中的作用的重要信息。