杜佩珊, 姜愛雯, 田艷珍, 趙東坡, 毛建云, 宋永建

(1.河北省張家口市第一醫(yī)院, 河北 張家口 075000 2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部, 河北 張家口 075000)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia reperfusion injury,MIRI)是臨床中常見缺血性心血管疾病的病理生理表現(xiàn),大約有40%的心肌組織壞死由心肌再灌注損傷引起,改善MIRI損傷可為心血管疾病的治療帶來益處[1]。miRNAS被證實(shí)在MIRI的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,miR-30b屬于miR-30家族中的重要成員,其在心臟表達(dá)中高度保守,研究指出[2],miR-30b在心力衰竭患者中表達(dá)下降,且與主動(dòng)脈炎、心肌肥厚小鼠病理密切相關(guān),但是其在MIRI中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。炎癥小體被證實(shí)是心肌缺血再灌注損傷的重要成分。炎性小體由NLRP、Caspase-1、細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)促蛋白(ASC)等組成,上述物質(zhì)相互作用,共同激活炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與心肌細(xì)胞損傷,介導(dǎo)MIRI進(jìn)程[3]。據(jù)報(bào)道,miR-30b通過靶向NLPR3炎癥小體信號(hào)通路來介導(dǎo)肺纖維進(jìn)程,二者在MIRI進(jìn)程中是否具有調(diào)控機(jī)制有待研究[4]。基于上述討論,本研究進(jìn)一步探究了miR-30b、NLRP3炎癥小體之間的關(guān)系以及二者在MIRI進(jìn)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象:選取12周SPF級(jí)SD大鼠50只作為研究對(duì)象,體重范圍250～300g,均購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(冀)2022-7-001。大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng),晝夜交替,室內(nèi)溫度控制在23～25℃,相對(duì)濕度50～70%,可自由進(jìn)食水;本研究涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由倫理委員會(huì)批準(zhǔn);實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)大鼠的處理方式均參照《關(guān)于善待動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)要求及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑:胰蛋白酶購自上海玉博生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)、甘油明膠封片劑、BCA蛋白濃度測定盒、SDS-PAGE凝膠設(shè)備、電泳緩沖液、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒等均購自美國Gibco公司;鼠抗人NLRP3、ASC、Caspase-1抗體、GAPDH抗體購自美國ABC公司;辣根過氧化化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購自上海碧云天有限公司;NLRP3炎癥小體信號(hào)通路抑制劑CY-09購自上海工程有限公司;CK-MB、LDH、cTnI ELISA檢測試劑盒購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;蘇木精-伊紅染色液、TUNEL檢測試劑盒均購自美國ABC公司。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器:RT-PCR檢測儀、Mini PRO型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡均購自美國Beckman公司;超聲心動(dòng)圖檢測儀、流式細(xì)胞儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、微量可調(diào)節(jié)儀器、生物組織石蠟包埋機(jī)等均購自美國Beckman公司。

1.2方 法

1.2.1動(dòng)物分組及藥劑干預(yù):各組大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)將其分為五組,分別為Sham組、MIRI組、miR-30b mimics組、CY-09組、miR-30b mimics+CY-09組;其中Sham組大鼠僅僅做開胸進(jìn)行動(dòng)脈穿線處理;MIRI組大鼠進(jìn)行開胸處理,并且行做灌裝動(dòng)脈前降支的結(jié)扎以及再灌注造模處理;miR-30b mimics組大鼠首先進(jìn)行miR-30b過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染,在其大鼠左心室的前壁采用六點(diǎn)法注射腺病毒載體(miR-30b mimics,1×109PFU);CY-09組大鼠亦首先進(jìn)行NLRP3信號(hào)通路抑制劑CY-09注射,在其大鼠左心室的前壁采用六點(diǎn)法注射CY-09(miR-30b mimics,50μg/100g);miR-30b mimics+CY-09組大鼠分別在對(duì)應(yīng)位置注射miR-30b mimics、CY-09;在其轉(zhuǎn)染后的3d后構(gòu)建MIRI模型。

1.2.2MIRI模型制備及造模成功標(biāo)準(zhǔn)[9]: 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥(40mg/kg),麻醉后采取仰臥位,頸部切口分離氣管,連接微型人工呼吸機(jī),四肢下固定電極檢測心電圖。沿著大鼠胸骨正中位置將皮膚、胸骨切開,暴露心臟,定位左冠狀動(dòng)脈的前降支,采用醫(yī)用縫合線進(jìn)行結(jié)扎,45min后進(jìn)行再灌注30min處理。后續(xù)在心電圖上觀察到出現(xiàn)室性期前收縮、室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)等再灌注心率失常等表現(xiàn),超聲心動(dòng)圖以抬高的ST段下降以及T波恢復(fù)為再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3檢測指標(biāo)

序列結(jié)果用NCBI在線工具Blast在Gene Bank內(nèi)與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對(duì)，并用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.1超聲心動(dòng)圖檢測心功能因子:各組大鼠在MIRI模型建立后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測,麻醉后固定仰臥在37℃的恒溫加熱板內(nèi),胸部處理后加少量耦合劑,設(shè)定檢測頻率為12.00MHz,探頭10s,檢測各組大鼠左心室舒張末壓(Left ventricular end diastoilc pressur,LVEDP)、左心室內(nèi)壓峰值(Left ventricular sustolic pressure,LVSP)、壓力上升最大變化速率(+dp/dtmax)及壓力下降最大變化速率(-dp/dtmax),每個(gè)數(shù)值連續(xù)測量3個(gè)完整的心動(dòng)周期后取平均值。

1.3.2ELISA檢測心肌損傷因子水平:處死大鼠,取腹部主動(dòng)脈血,精確配置相關(guān)實(shí)驗(yàn)用工作液、洗滌液,采用標(biāo)準(zhǔn)濃度樣本配制出具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品,將其添加到對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔內(nèi),設(shè)置空白對(duì)照孔。采用PBS溶液洗滌3次后添加相應(yīng)生物素CK-MB、LDH、cTnI抗體,在37℃下反應(yīng)1.5h;加入酶結(jié)合物工作液進(jìn)行二抗反應(yīng);將顯色底物加入,反應(yīng)30mins后加入終止液;在450nm的波長下測定各個(gè)孔的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,最終計(jì)算CK-MB、LDH、cTnI的水平。

1.3.3HE染色評(píng)估大鼠心肌組織病理形態(tài):心肌組織石蠟塊切片均在4μm厚,經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度濃度脫水后進(jìn)行蘇木精染色5min后,經(jīng)純水洗滌、1%鹽酸乙醇分化2s后進(jìn)行返藍(lán)、伊紅染色2min;經(jīng)過純水洗滌、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、切片風(fēng)干以及中性膠封片后,在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態(tài)。

1.3.4TUNEL檢測大鼠心肌組織凋亡情況:心肌組織石蠟塊切片均在4μm厚,經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度濃度脫水后放入包埋劑進(jìn)行低溫成型處理,冷凍切片機(jī)連續(xù)切片。采用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5QRT-PCR檢測大鼠心肌組織內(nèi)miR-30b的mRNA表達(dá):取心肌組織制備懸浮液,Trizol法提取總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA,miR-30b正向引物:5-TGCTGGACCTTTCGGACTCT -3,反向引物:5-ATGGCTGGACCTGGATGCC -3,上述引物均由上海生物工程有限公司提供。嚴(yán)格按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書的配置反應(yīng)體系,將其置于ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測儀檢測;qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min,循環(huán)1次,95℃預(yù)變性15s,在60℃下退火60s,72℃延伸30s,循環(huán)40次,以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-30b的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6Western-blot檢測NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)取材后加入RIPA裂解液進(jìn)行心肌組織懸浮液裂解處理,提取蛋白質(zhì),上樣蛋白緩沖溶液,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白,將檢測蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,采用5%的脫脂牛奶封閉2.5h,TBST清洗3次;將PVDF膜與一抗在5℃下孵育過夜,采用TBST清洗;PVDF膜與熒光二抗孵育1.5h,經(jīng)TBST清洗后采用紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描,采用Image軟件進(jìn)行灰度分析;其中一抗稀釋比例NLRP3(1∶1500)、ASC(1∶1000)、Caspase-1(1∶1500)、GAPDH(1∶1500)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌組織內(nèi)miR-30b的mRNA表達(dá)分析:結(jié)果顯示,與Sham組相比,MIRI模型建立可以下調(diào)大鼠心肌組織內(nèi)miR-30b的mRNA表達(dá)(P<0.05);miR-30b的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以明顯上調(diào)大鼠心肌組織內(nèi)miR-30b的mRNA表達(dá)(P<0.05);為下文的研究提供基礎(chǔ),結(jié)果詳見圖1。

2.2各組大鼠心功能參數(shù)比較:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調(diào)心功能參數(shù)LVEDP數(shù)值,下調(diào)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax數(shù)值(P<0.05);miR-30b過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以下調(diào)LVEDP數(shù)值,上調(diào)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax數(shù)值(P<0.05);二者聯(lián)合體現(xiàn)出最低LVEDP數(shù)值,最高LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax數(shù)值(P<0.05);miR-30b過表達(dá)及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以提升MIRI大鼠心臟功能,結(jié)果詳見表1。

表1 超聲心動(dòng)圖檢測各組大鼠心功能參數(shù)比較分析

2.3各組大鼠心肌損傷因子水平比較:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調(diào)心肌損傷因子(CK-MB、LDH、cTnI)水平(P<0.05);miR-30b過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以下調(diào)血清CK-MB、LDH、cTnI因子水平(P<0.05);二者聯(lián)合組大鼠血清內(nèi)體現(xiàn)出最低CK-MB、LDH、cTnI因子水平(P<0.05);miR-30b過表達(dá)及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以抑制MIRI大鼠心肌損傷,結(jié)果詳見表2。

表2 ELISA法檢測各組大鼠心肌損傷因子水平比較

2.4各組大鼠心肌組織病理形態(tài)分析:Sham組大鼠心肌形態(tài)較為正常;MIRI模型的建立可以導(dǎo)致心肌組織排列紊亂,出現(xiàn)心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象;miR-30b過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以改善MIRI大鼠心肌組織病理形態(tài),二者聯(lián)合組大鼠心肌形態(tài)改善力度最大,心肌細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象得到大幅度降低;miR-30b過表達(dá)及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以改善MIRI大鼠心肌組織損傷狀態(tài),結(jié)果詳見圖2。

圖2 HE染色分析各組大鼠心肌組織病理形態(tài)分析(×100)

2.5各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡程度比較:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調(diào)大鼠心肌組織凋亡程度(P<0.05);miR-30b過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以下調(diào)大鼠心肌組織凋亡能力(P<0.05);二者聯(lián)合可以進(jìn)一步降低大鼠心肌組織凋亡程度(P<0.05);miR-30b過表達(dá)及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以抑制MIRI大鼠心肌組織凋亡程度,結(jié)果詳見圖3。

圖3 TUNEL法檢測各組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡能力分析(×50)

2.6miR-30b對(duì)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路活性的影響:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調(diào)大鼠心肌組織內(nèi)NLPR3炎癥小體信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)(P<0.05);miR-30b過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及NLRP3信號(hào)通路被阻斷均可以下調(diào)大鼠心肌組織內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)(P<0.05);二者聯(lián)合可以進(jìn)一步降低大鼠心肌組織內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)(P<0.05);miR-30b可以靶向抑制MIRI大鼠心肌組織內(nèi)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路活性,結(jié)果詳見圖4、表3。

表3 Western-blot檢測各組大鼠心肌組織內(nèi)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路活性

圖4 Western-blot檢測各組大鼠心肌組織內(nèi)NLRP3信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白活性表達(dá)

3 討 論

心血管疾病目前已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的關(guān)鍵因素。MIRI病理現(xiàn)象可以導(dǎo)致機(jī)體心肌代謝紊亂及結(jié)構(gòu)的重塑,加重心臟功能的障礙及結(jié)構(gòu)的紊亂性,使得心血管疾病的臨床治療遇到重重阻礙[5];目前大量的科研人員致力于探索MIRI發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,已經(jīng)取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展,炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、鈣離子紊亂等均在MIRI發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。研究指出,miRNAs在心血管疾病中發(fā)揮了重要價(jià)值,miR-30家族被證實(shí)在機(jī)體炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及細(xì)胞凋亡中扮演了重要角色,同時(shí)與多種缺血性疾病的進(jìn)程密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)miR-30a在心肌梗死大鼠中的表達(dá)明顯降低,同時(shí)隨著其表達(dá)水平的降低,機(jī)體心肌纖維化、心功能衰退現(xiàn)象逐漸明顯[6-7]。miR-30b作為miR-30家族中另外一個(gè)重要成員,被證實(shí)了炎癥類疾病、缺血缺氧性腦部疾病中均發(fā)揮重要作用,但是其在MIRI進(jìn)程中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究[8]。

本研究采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支再恢復(fù)血流的經(jīng)典方式構(gòu)建了MIRI大鼠心肌損傷模型,進(jìn)一步確定了miR-30b表達(dá)對(duì)MIRI大鼠心肌損傷的影響。在腺病毒過表達(dá)轉(zhuǎn)染中我們發(fā)現(xiàn)MIRI模型的建立可以明顯降低miR-30b的表達(dá),證實(shí)了miR-30b在心肌缺血再灌注損傷后表達(dá)下調(diào),通過轉(zhuǎn)染miR-30b過表達(dá)腺病毒發(fā)現(xiàn)miR-30b在心肌組織內(nèi)的表達(dá)再次提升,為后續(xù)研究其對(duì)缺血再灌注損傷的心肌組織的保護(hù)作用提供基礎(chǔ)。

研究表明,心臟功能參數(shù)LVDEP、LVSP、±dp/dtmax等指標(biāo)可以較好的反應(yīng)機(jī)體的心臟功能,其中LVDEP可以充分反應(yīng)機(jī)體左心室的負(fù)荷情況,間接反映左心室的舒張功能;LCSP則主要反映心肌組織的收縮能力,±dp/dtmax可以對(duì)心臟室壁張力的變化速度進(jìn)行反應(yīng),可以用來評(píng)估心肌組織收縮期、舒張期的收縮能力大小[9]。在本研究中,結(jié)果顯示,MIRI模型的建立可以明顯上調(diào)LVDEP指標(biāo),下調(diào)LVSP、±dp/dtmax等指標(biāo),miR-30b的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象,再次降低LVDEP指標(biāo),上調(diào)LVSP、±dp/dtmax等指標(biāo)。進(jìn)一步對(duì)各組大鼠的心肌損傷標(biāo)志物進(jìn)行了分析,研究顯示cTnI、CK-MB、LDH等均屬于心肌細(xì)胞特異性損傷的分子標(biāo)志物,外周血中cTnI、CK-MB、LDH升高主要來源之一為心肌細(xì)胞的損傷。在本次的研究中我們得出,miR-30b的過表達(dá)可以明顯逆轉(zhuǎn)MIRI組大鼠外周血中cTnI、CK-MB、LDH水平提升的趨勢,再次下調(diào)MIRI組大鼠外周血中cTnI、CK-MB、LDH的水平[10]。病理學(xué)結(jié)果分析顯示,MIRI模型的建立可以導(dǎo)致心肌組織排列紊亂,出現(xiàn)心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,心肌組織凋亡程度明顯提升,而miR-30b過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以改善MIRI大鼠心肌組織病理形態(tài),降低心肌組織的凋亡程度。綜上可以看出,miR-30b可以改善缺血再灌注損傷所引起的心臟功能低下的表現(xiàn),對(duì)缺血再灌注損傷的心肌組織具有保護(hù)作用。

NLRP3炎癥小體在機(jī)體諸多炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,屬于炎癥類型疾病中最為廣泛涉及的炎癥小體類型,其關(guān)鍵的蛋白體系主要有感受器蛋白NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-related speck protein,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1)等[11]。數(shù)據(jù)顯示,NLRP3炎癥小體復(fù)合物的激活與缺血再灌注損傷密切相關(guān),心肌缺血再灌注過程中大量的白細(xì)胞會(huì)向心肌組織募集,進(jìn)而參與到炎癥反應(yīng)并且釋放出炎癥因子,加劇心臟功能的紊亂性[12]。在心腦血管疾病中,NLRP3炎癥體被激活且表達(dá)水平提升,進(jìn)而介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,加速病理進(jìn)展。本研究顯示,當(dāng)NLRP3信號(hào)通路被抑制后,MIRI大鼠的心肌損傷得到一定改善,大鼠心臟功能LVSP、±dp/dtmax指標(biāo)得到明顯上調(diào),心肌損傷因子cTnI、CK-MB、LDH水平降低,同時(shí)心肌組織排列紊亂,出現(xiàn)心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞空泡化及炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象亦得到較大程度的緩解,可見,NLRP3炎癥小體信號(hào)通路活性在MIRI建立后被激活,且參與到MIRI病理進(jìn)展中。

研究指出,miRNAs對(duì)心血管疾病的調(diào)控機(jī)制與下游的靶向基因密切相關(guān),NLRP3炎癥小體在諸多炎癥性疾病中受到miRNAs分子的靶向調(diào)控[13]。為了證實(shí)在miR-30b與NLRP3在改善MIRI大鼠缺血再灌注心肌損傷中的作用機(jī)制,我們將二者聯(lián)合應(yīng)用到MIRI大鼠中,結(jié)果顯示,miR-30b的過表達(dá)可以明顯抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá),其與信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可以進(jìn)一步降低NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá);且miR-30b、NLRP3信號(hào)通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可以進(jìn)一步提升MIRI大鼠的心臟功能,改善心肌組織細(xì)胞的病理損傷。綜上可以看出,miR-30b通過靶向抑制MLPR3炎癥小體的激活改善缺血再灌注損傷所引起的心臟功能低下、心肌細(xì)胞損傷加劇的表現(xiàn),對(duì)缺血再灌注損傷的心肌組織起到保護(hù)作用,值得臨床進(jìn)一步研究。