鄭競(jìng)雄, 楊 陽(yáng), 孫光蕊, 趙寶山, 侯繼申, 梁宗英, 王 敏

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 河北 承 德 067000 2.河北省胸科醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室, 河北 石家莊 050000)

食管癌是世界上最致命的惡性腫瘤之一,數(shù)十年以來(lái),其發(fā)病率激增[1]。雖然食管癌的診療技術(shù)有所突破,但令人扼腕的是其預(yù)后仍然很差。靶向治療是食管癌治療的一種新方式,為患者提供了新的希望。因此,深入研究食管癌的發(fā)病機(jī)制,并不斷探索新的治療靶點(diǎn),這對(duì)于提高食管癌的治療水平具有至關(guān)重要的臨床意義[2]。MicroRNA( microRNA,miR)作為一種非編碼RNA,可以通過調(diào)控靶基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄,并可以與基因結(jié)合并發(fā)揮其功能。眾所周知,miRNA在多種腫瘤中表達(dá)異常,不僅參與癌癥的形成,更加促進(jìn)了癌癥的滋生和發(fā)展。據(jù)證實(shí),miR-145-5p被證實(shí)具有抑癌作用,可以通調(diào)控靶基因的表達(dá),參與調(diào)節(jié)肝癌等腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[3]。Survivin是一種真核蛋白,它能有效抑制細(xì)胞的凋亡。在諸多惡性腫瘤中,Survivin展現(xiàn)出驚人的抗凋亡能力,可以通過精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的不斷繁衍生息[4]。研究發(fā)現(xiàn),Survivin在食管癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中呈高表達(dá)趨勢(shì),且與食管癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5]。因此,進(jìn)一步探究miR-145-5p對(duì)食管癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為是否具有促進(jìn)作用及其能否靶向調(diào)控Survivin的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用,值得深入研究。本研究旨在揭示miR-145-5p對(duì)Survivin的靶向調(diào)控對(duì)食管癌生物學(xué)行為的影響,并且闡述食管癌可能的發(fā)生機(jī)制,期望能為食管癌的治療和預(yù)防提供更深層次的理論支持。

1 資料與方法

1.1一般資料:承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科2020年1月至2022年1月共15例食管鱗狀細(xì)胞癌患者,男性13例,女性2例,年齡47～71歲,平均(61.33±6.46)歲。以癌組織為實(shí)驗(yàn)組,采用同一患者癌旁組織為對(duì)照組(距癌組織邊緣大于8cm的正常食管上皮黏膜)。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前或術(shù)后經(jīng)病理科明確診斷食管鱗狀細(xì)胞癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他部位惡性腫瘤病史和或術(shù)前經(jīng)過放療、化療及其他抗腫瘤藥物治療的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并獲得研究患者的知情同意。

1.2試劑:廣州索友百生物科技有限公司提供試劑,包括食管癌TE-1細(xì)胞和正常食管黏膜上皮HEEC細(xì)胞系;miR-145-5p模擬物購(gòu)自由上海雅吉生物科技有限公司;LipofectamineTM3000 Transfection Reagent(sjzwd-007)購(gòu)自石家莊旺迪生物科技有限公司;Survivin、BCL2、MDM2和Caspase-3抗體購(gòu)自廣州泰勒生物科技有限公司,PCR試劑盒和雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒夠自杭州百替生物技術(shù)有限公司。

1.3方 法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組:F12K培養(yǎng)基中,按照常規(guī)方法接種細(xì)胞,并將其放置在5% CO2、37℃孵育箱中,生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將TE-1細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中,使用LipofectamineTM3000試劑盒將miR-145-5p的模擬物和陰性對(duì)照物分別轉(zhuǎn)染TE-1細(xì)胞中,繼續(xù)孵育48h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析miR-145-5p與Survivin的靶向關(guān)系:利用生物信息學(xué)TargetScan預(yù)測(cè)miR-145-5p與Survivin結(jié)合位點(diǎn)。在分子生物學(xué)和基因突變技術(shù)輔助下,構(gòu)建熒光報(bào)告基因載體,包括野生型和突變型miR-145-5p。將不同細(xì)胞組接種于24個(gè)小孔板內(nèi),然后用熒光報(bào)告載體、miR-145-5p表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒對(duì)TE-1細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染。經(jīng)過24h培養(yǎng),進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè),包括螢火蟲和海腎熒光素酶值。通過二者數(shù)值比例,計(jì)算出細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.3.3RT-qPCR:提取組織或細(xì)胞總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量試劑盒檢測(cè)mRNA的表達(dá);(U6作為miR-145-5p內(nèi)參,GAPDH作為Survivin內(nèi)參),相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct計(jì)算;引物見表1。

表1 各基因的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)引物

1.3.4Western blot實(shí)驗(yàn):提取蛋白并測(cè)定蛋白濃度。制備電泳蛋白樣液,行凝膠電泳。將分離的蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF膜上。封閉2h后加入一抗,搖床溫育過夜。次日加入二抗,洗膜后,凝膠系統(tǒng)曝光顯影。

1.3.5MTT實(shí)驗(yàn):選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液,并進(jìn)行計(jì)數(shù)。將l000個(gè)/孔密度接種于96孔板,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)轉(zhuǎn)染;于2、12、24、36、48h觀察細(xì)胞狀態(tài),在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)拿出孔板,每孔加入5mg/mL MTT液體30μL室溫孵育。4h后添加二甲基亞砜(每孔150μL),80r/min搖勻。在結(jié)晶消失之后,需要利用酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)在570nm 處的細(xì)胞吸光度(OD值)。用時(shí)間作為橫坐標(biāo),吸光度作為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù):使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,并將其制作成單細(xì)胞懸液。在計(jì)算細(xì)胞數(shù)后,將每個(gè)孔接種8×103個(gè)細(xì)胞,將其置于96孔板中,并加入每孔100μL。正常培養(yǎng),每孔細(xì)胞密度達(dá)到80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染;48h后,取出細(xì)胞并用不含EDTA的胰蛋白酶消化,使其變成為單細(xì)胞液,將細(xì)胞懸液離心,去除上方液體。加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,分別加入5μL的Annexin V-APC和5μL的7-AAD染液,混勻;室溫、避光反應(yīng)20min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.7劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn):選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液,并進(jìn)行計(jì)數(shù)后接種于24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿孔底。應(yīng)用無(wú)菌移液槍頭留下劃痕,使用PBS洗去脫落細(xì)胞并拍照。48h后觀察細(xì)胞,在倒置顯微鏡下拍照并測(cè)量劃痕的寬度。

1.3.8Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn):使用制好的基質(zhì)膠包被上室24h,于上室接種各組細(xì)胞混懸液(細(xì)胞數(shù):2×104個(gè)/孔),下室添加DMEM 500μL。經(jīng)培養(yǎng)48h后,棄培養(yǎng)基;使用無(wú)菌棉簽去除上室未穿膜細(xì)胞。對(duì)下層細(xì)胞進(jìn)行多聚甲醛溶液固定處理,并用結(jié)晶紫染色。通過倒置顯微鏡,在隨機(jī)選取的5個(gè)視野下觀察細(xì)胞,并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),析因設(shè)計(jì)資料采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1食管癌組織和細(xì)胞中miR-145-5p的表達(dá):與癌旁組織相比,miR-145-5p在食管癌組織中的表達(dá)下降(19.01±1.85 vs 9.46±1.57)(t=4.623,P<0.05),見圖1A;與正常食管黏膜上皮HEEC細(xì)胞相比,TE-1細(xì)胞中miR-145-5p表達(dá)顯著降低(1.13±0.07 vs 0.44±0.08)(t=2.674,P<0.05),見圖1B。

圖1 miR-145-5p在食管癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2食管癌組織和細(xì)胞中:Survivin的表達(dá) 與癌旁組織相比,食管癌組織中Survivin 的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(13.91±1.74 vs 4.51±1.08)((t=3.531,P<0.05),見圖2A;與正常食管黏膜上皮HEEC細(xì)胞相比,食管癌TE-1細(xì)胞中Survivin相對(duì)表達(dá)量明顯上升(1.28±0.07 vs 0.36±0.06)(t=2.013,P<0.05),見圖2B。

圖2 Survivin在食管癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3驗(yàn)證miR-145-5p與Survivin靶向關(guān)系:使用TargetScan生物信息學(xué)網(wǎng)預(yù)測(cè)miR-145-5p與Survivin互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),詳見圖3;雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-145-5p表達(dá)質(zhì)粒的TE-1細(xì)胞中,共轉(zhuǎn)染野生型熒光報(bào)告基因載體的TE-1細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);而熒光報(bào)告基因載體的TE-1細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)變化(P>0.05)。在轉(zhuǎn)染miR-145-5p陰性表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒的TE-1細(xì)胞中兩組熒光素酶活性均未見明顯改變(P>0.05)。見圖4。

圖3 TargetScan預(yù)測(cè)miR-145-5p與靶基因Survivin的結(jié)合位點(diǎn)

圖4 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-145-5p與Survivin的靶向關(guān)系

2.4miR-145-5p表達(dá)變化對(duì)Survivin mRNA表達(dá)的影響:RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,TE-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物增加miR-145-5p的表達(dá),并降低Survivin 的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05);轉(zhuǎn)染miR-145-5p陰性對(duì)照物組與未轉(zhuǎn)染組相比,miR-145-5p和Survivin 的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 miR-145-5p表達(dá)變化對(duì)Survivin mRNA表達(dá)的影響

2.5上調(diào)miR-145-5p對(duì)食管癌細(xì)胞存活能力的影響:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在12h、24h、36h和72h時(shí)間點(diǎn),轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物組570nm吸光度值細(xì)胞吸光度值(OD值)均小于陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組,細(xì)胞存活能力降低(P<0.05);而陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖6。

圖6 上調(diào)miR-145-5p對(duì)TE-1細(xì)胞存活能力的影響

2.6上調(diào)miR-145-5p對(duì)食管癌細(xì)胞遷移能力的影響:劃痕愈合結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物組的細(xì)胞遷移距離明顯短于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照物組,兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照物組和未轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞遷移距離無(wú)差異。見圖7。

圖7 上調(diào)miR-145-5p表達(dá)對(duì)TE-1細(xì)胞遷移能力的影響

2.7上調(diào)miR-145-5p對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲能力的影響:與miR-145-5p陰性對(duì)照物組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比,轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05);轉(zhuǎn)染miR-145-5p陰性對(duì)照物組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05),見圖8。

圖8 上調(diào)miR-145-5p表達(dá)對(duì)TE-1細(xì)胞侵襲能力的影響

2.8miR-145-5p上調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞術(shù)顯示,轉(zhuǎn)染TE-1細(xì)胞48h后,miR-145-5p模擬物組細(xì)胞凋亡率明顯增高,與轉(zhuǎn)染miR-145-5p陰性對(duì)照物組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖9。

圖9 上調(diào)miR-145-5p表達(dá)對(duì)TE-1細(xì)胞凋亡的影響

2.9上調(diào)miR-145-5p對(duì)Survivin、BCL2、MDM2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響:與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比,轉(zhuǎn)染miR-145-5p模擬物組TE-1細(xì)胞Survivin、BCL2和MDM2蛋白水平顯著下降,但Caspase-3表達(dá)水平上升(P<0.05);轉(zhuǎn)染miR-145-5p陰性對(duì)照物組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比,各種蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖10。

圖10 上調(diào)miR-145-5p表達(dá)對(duì)凋亡通路相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

因缺乏早期臨床癥狀,導(dǎo)致食管癌往往在中晚期時(shí)才被確診,錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)機(jī)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在手術(shù)、放化療和免疫治療方面有了長(zhǎng)足的進(jìn)步,可以在一定程度上延長(zhǎng)食管癌患者的生存期,但總體來(lái)看,患者的預(yù)后仍讓人感到無(wú)奈。因此,發(fā)現(xiàn)能夠提高食管癌早期診斷率和預(yù)后評(píng)估的新指標(biāo)對(duì)食管癌治療至關(guān)重要,具有重要意義和作用。食管癌是一種不可小覷的疾病,其發(fā)生和發(fā)展過程中,細(xì)胞成分的水平常常會(huì)發(fā)生變化。這些變化既可以被用于食管癌的檢測(cè),也可用于惡性狀態(tài)預(yù)后的監(jiān)測(cè)。更讓人振奮的是這些變化也為食管癌的基因靶向治療提供了新的思路,幫我們攻克食管癌的難關(guān)。

Survivin是一種凋亡抑制基因,在人體腫瘤中多呈高表達(dá),可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和凋亡[6]。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn),Survivin的高表達(dá)程度與食管癌分期、細(xì)胞分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性,這些關(guān)聯(lián)得到了相關(guān)研究文獻(xiàn)的支持[7]。以前的研究發(fā)現(xiàn),miRNA能夠與靶基因結(jié)合,調(diào)控其表達(dá),進(jìn)而對(duì)腫瘤的形成和發(fā)展產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[8]。國(guó)內(nèi)研究人員發(fā)現(xiàn),Survivin在食管癌組織中具有高度表達(dá)性,與miR-143、miR-145的表達(dá)具有相關(guān)性[9]。然而,miR-145能否作為上游分子,以Survivin為靶點(diǎn)加速食管癌的進(jìn)展?其中具體機(jī)制尚存未知。

在miR-145的RNA雙鏈結(jié)構(gòu)中存在著一條前導(dǎo)鏈,即miR-145-5p,其在各種腫瘤組織中的表達(dá)情況各不相同,具有對(duì)不同靶基因產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用[10]。近幾年,已有不少研究表明miR-145-5p在膀胱癌及胃癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用[11-12]。然而,miR-145-5p在食管癌中的研究卻相對(duì)較少,并且該RNA在該疾病中的的確切作用尚不清楚。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-145-5p在食管癌組織中的表達(dá)水平較低,而Survivin則呈現(xiàn)高水平,這與封敏等[9]學(xué)者的研究結(jié)果相一致。在細(xì)胞系中進(jìn)一步證實(shí),miR-145-5p在食管癌TE-1細(xì)胞中的表達(dá)率較低,而Survivin表達(dá)率較高。這表明miR-145-5p和Survivin的差異可能與食管癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Survivin基因存在一個(gè)與miR-145-5p互補(bǔ)的位點(diǎn),可能是調(diào)控Survivin的上游分子。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí),共轉(zhuǎn)染野生型Survivin-3’ UTR載體能夠明顯降低食管癌TE-1細(xì)胞的熒光素酶活性,而共轉(zhuǎn)染突變型載體的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)變化。這說明Survivin是miR-145-5p的靶基因。此研究還發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-145-5p可以有效地抑制了Survivin的表達(dá),迫使細(xì)胞走向凋亡。同時(shí),過表達(dá)miR-145-5p不僅有效地抑制了食管癌細(xì)胞的存活能力,也抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲能力;這說明miR-145-5p的高表達(dá)降低了Survivin的表達(dá),從而有效地抑制食管癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,表明了其在治療食管癌方面具有顯著的潛力。

惡性腫瘤的形成和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程,而細(xì)胞凋亡則在其中發(fā)揮著重要作用。將腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)到凋亡過程中是治療腫瘤的重要途徑之一,因?yàn)檫@種方式能夠遏制惡性腫瘤的進(jìn)展[13]。腫瘤細(xì)胞的凋亡是通過一系列的凋亡通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在這個(gè)過程中,有一些分子發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,例如BCL2、MDM2和Caspase-3等。正是這些重要的凋亡分子,為我們預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡提供了重要的分子標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-145-5p可降低Survivin的表達(dá),BCL2和MDM2蛋白的表達(dá)明顯降低,但Caspase-3蛋白表達(dá)增加。這個(gè)結(jié)果提示,miR-145-5p的高表達(dá)會(huì)抑制Survivn進(jìn)而激活凋亡通路,從而引發(fā)食管癌的凋亡。

綜上所述,miR-145-5p的過表達(dá)能夠調(diào)節(jié)Survivn的表達(dá),進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通路,有效地遏制食管癌細(xì)胞存活、侵襲及轉(zhuǎn)移,從而充分展現(xiàn)了miR-145-5p作為治療食管癌的新靶點(diǎn)的巨大潛力。本研究深入探究miR-145-5p和Survivin在食管癌中的相互作用機(jī)制,為尋找食管癌靶向治療的新靶點(diǎn)提供了重要參考。然而,今后工作中需要更加深入的研究來(lái)驗(yàn)證miR-145-5p和Survivn在體內(nèi)的功能,以期解開二者調(diào)控食管癌機(jī)制的奧秘。