王晨靜, 郭曉丹, 馬振禹, 黃秀英, 張 偉

(河北省保定市第二醫(yī)院病理科, 河北 保定 071000)

膀胱癌屬于泌尿系統(tǒng)易發(fā)腫瘤,發(fā)病率及病死率均較高[1]。脂類生物因子在腫瘤遠(yuǎn)處擴(kuò)散進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,其中鞘胺醇激酶1(Sphingosine kinascs-1,SPHK1)可以通過調(diào)控鞘脂代謝的平衡在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT等諸多生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[2]。據(jù)報(bào)道,SPHK1通過調(diào)控腫瘤的微環(huán)境以及對(duì)EMT來誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的遷移侵襲能力,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,由SPHK1參與介導(dǎo)的信號(hào)通路在食管癌、結(jié)直腸癌及肝癌的遠(yuǎn)處擴(kuò)散進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3]。腫瘤微環(huán)境相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophage,TAMs)與腫瘤細(xì)胞活性密切相關(guān),其中M2型巨噬細(xì)胞屬于腫瘤間質(zhì)中的非腫瘤性質(zhì)的細(xì)胞亞群,發(fā)揮促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[4];目前SPHK1、M2型巨噬細(xì)胞極化與惡性腫瘤發(fā)展密切相關(guān),但是二者在膀胱癌中的機(jī)制尚未闡明。本研究探討SPHK1對(duì)M2巨噬細(xì)胞極化作用的調(diào)控以及對(duì)膀胱癌細(xì)胞EMT的影響機(jī)制,為臨床研究提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象:選取小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7及膀胱癌細(xì)胞系T24進(jìn)行原代培養(yǎng),選取P3代單層細(xì)胞納入研究。

據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鄉(xiāng)村女教師在教育目的、學(xué)生、課程、教師角色四個(gè)維度的信念得分均略高于鄉(xiāng)村男教師，而男教師在教學(xué)信念方面的得分略高于女教師。從整體來看，男女教師的教育信念在五個(gè)維度上的差異均不顯著(p>0.05)，說明其沒有性別差異。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑:杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶購自上海玉博生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)、甘油明膠封片劑、BCA蛋白濃度測(cè)定盒、SDS-PAGE凝膠設(shè)備、電泳緩沖液、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒等均購自美國Gibco公司;鼠抗人SPHK1、CD206、ArgI、Survivin、MMP-2、MMP-9、E-Cadherin、Vimentin、N-Cadherin抗體、GAPDH抗體購自美國ABC公司;辣根過氧化化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購自上海碧云天有限公司;Transwell染色劑、免疫熒光相關(guān)試劑、MTT檢測(cè)試劑盒均購自美國ABC公司;LV-SPHK1、si-SPHK1慢病毒載體及陰性對(duì)照組病毒均購自上海吉?jiǎng)P基因有限公司。

檢測(cè)到缸套內(nèi)壁的表面粗糙度約Ra1.6（Rz6.3），活塞環(huán)外壁的表面粗糙度為Ra0.4（Rz1.6）。經(jīng)過8h的磨合后，檢測(cè)到缸套內(nèi)壁的表面粗糙度約Ra0.4（Rz1.6），峰值減少值為：

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器:RT-PCR檢測(cè)儀、Mini PRO型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡均購自美國Beckman公司,流式細(xì)胞儀、臺(tái)式高速離心機(jī)、微量可調(diào)節(jié)儀器、生物組織石蠟包埋機(jī)、流式細(xì)胞儀等均購自美國Beckman公司。

本文對(duì)我館的讀者類型從兩個(gè)維度進(jìn)行分類：首先是不同層次的讀者，包括本?？粕?、研究生與教職工等；其次是不同學(xué)院的讀者，包括國際經(jīng)貿(mào)學(xué)院、國際商務(wù)外語學(xué)院、金融管理學(xué)院、會(huì)計(jì)學(xué)院等。借助Matlab等工具對(duì)不同的讀者借閱人數(shù)分布在2014—2018年的變化狀況進(jìn)行分析，得到的結(jié)果如圖3和圖4所示。

1.4.1巨噬細(xì)胞Raw264.7培養(yǎng):Raw264.7置于DMEM培養(yǎng)基中,向培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、10mmoL/LPBS緩沖溶液及100U/mL的青霉素和鏈霉素,在37℃、5%CO2、適宜飽和濕度環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng),2～3d更換培養(yǎng)液,選取傳代培養(yǎng)到第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞,計(jì)數(shù)備用。

2.2SPHK1表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞極化類型的影響

2.1SPHK1在巨噬細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染分析:與Control-NC組相比,SPHK1在巨噬細(xì)胞內(nèi)得到成功過及沉默表達(dá),LC-SPHK1組SPHK1蛋白表達(dá)提升,si-SPHK1組SPHK1蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05),見圖1。*P<0.05,與Control-NC組相比。

2.3.3腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá):與Control-NC組相比,SPHK1過表達(dá)會(huì)提升T24細(xì)胞內(nèi)Survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)(P<0.05);SPHK1沉默則會(huì)降低T24細(xì)胞內(nèi)Survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)(P<0.05);SPHK1過表達(dá)可以促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞的遷移及侵襲能力,見圖6。

采用單隱含層的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中輸入層和輸出層均采用2個(gè)神經(jīng)節(jié)點(diǎn)，隱含層采用20個(gè)神經(jīng)節(jié)點(diǎn)。隱含層與輸入層之間的傳遞函數(shù)為Sigmoid函數(shù)，輸出層與隱含層之間的傳遞函數(shù)為Purelin函數(shù)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)采用的訓(xùn)練函數(shù)為trainlm函數(shù)，最大訓(xùn)練歷元為5 000，訓(xùn)練精度要求為1.0 e-8。誤差曲線見圖1，計(jì)算精度統(tǒng)計(jì)見表1。

2 結(jié) 果

1.4.3巨噬細(xì)胞Raw264.7與膀胱癌細(xì)胞系T24進(jìn)行共培養(yǎng):選取傳代培養(yǎng)到第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞與各組巨噬細(xì)胞系Raw264.7進(jìn)行共培養(yǎng),時(shí)間為48h。

圖1 Western-blot檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞內(nèi)SPHK1蛋白表達(dá)

1.4.2SPHK1過表達(dá)、沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞系Raw264.7:取上述第三代Raw264.7細(xì)胞系,反復(fù)吹打細(xì)胞完全消化;在3000rpm/min下離心5min后重懸處理;巨噬細(xì)胞接種到6孔板內(nèi),接種量為2mL,在37℃下培養(yǎng)24h,直到細(xì)胞匯合度達(dá)到30%及以上,各個(gè)孔內(nèi)加入感染增強(qiáng)液A、P各40μL,接著加入載體SPHK1過表達(dá)(LV-SPHK1)、沉默質(zhì)粒(si-SPHK1)及空白質(zhì)粒(NC),均勻振蕩后將放置在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。12h后更換為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,慢病毒轉(zhuǎn)染72h后進(jìn)行項(xiàng)目分析。

2.2.1Western-blot檢測(cè):與Control-NC組相比,SPHK1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以上調(diào)M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、ArgI蛋白表達(dá)(P<0.05);SPHK1沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以下調(diào)M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、ArgI蛋白表達(dá)(P<0.05),見圖2。

圖2 Western-blot檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)

2.3SPHK1調(diào)控M2巨噬細(xì)胞極化對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物活性的影響

圖3 免疫熒光化學(xué)分析各組巨噬細(xì)胞內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物蛋白熒光強(qiáng)度(×200)。

2.2.2免疫熒光強(qiáng)度分析:與Control-NC組相比,SPHK1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以上調(diào)M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、ArgI蛋白熒光強(qiáng)度;SPHK1沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以下調(diào)M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、ArgI蛋白熒光強(qiáng)度;提示SPHK1可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞極化類型轉(zhuǎn)變,見圖3。

2.3.1腫瘤細(xì)胞增殖活性:隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組膀胱癌T24細(xì)胞均體現(xiàn)出增殖活性提升趨勢(shì)(P<0.05);細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h以后,與Control-NC組相比,SPHK1過表達(dá)會(huì)提升T24細(xì)胞增殖活性,SPHK1沉默則會(huì)降低T24細(xì)胞增殖活性(P<0.05)見表1、圖4。

表1 MTT法檢測(cè)各組膀胱癌T24細(xì)胞增殖活性

圖4 MTT檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞增殖活性

2.3.2腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力分析:與Control-NC組相比,SPHK1過表達(dá)會(huì)提升T24細(xì)胞的遷移能力及侵襲能力,SPHK1沉默則會(huì)降低T24細(xì)胞遷移能力及侵襲能力(P<0.05);SPHK1過表達(dá)可以促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞的遷移及侵襲能力,見圖5。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)、Transell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組膀胱癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力

1.4.4觀察指標(biāo):①免疫熒光檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá):采用多聚甲醛(45g/L)固定細(xì)胞,PBS溶液進(jìn)行清洗,之后加入封閉液體封閉1h,組成為0.30g BSA+5mL PBS+2.5μL Triton后將其甩干;加入1.5μL一抗(CD206:1∶1000,ArgI:1∶1000),在4℃的冰箱內(nèi)孵育過夜,PBS溶液清洗三次,加入CD206、ArgI二抗(1∶500)孵育1h,采用DAPI進(jìn)行染色5min,后經(jīng)PBS溶液清洗后置于熒光顯微鏡下觀察誘導(dǎo)結(jié)果。②Western-blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá):取材后加入RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞懸浮液裂解處理,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白,將檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,采用5%的脫脂牛奶封閉2.5h,TBST清洗3次;將PVDF膜與一抗在5℃下孵育過夜,采用TBST清洗;PVDF膜與熒光二抗孵育1.5h,,經(jīng)TBST清洗后采用紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描,采用Image軟件進(jìn)行灰度分析;一抗稀釋比例SPHK1(1∶1500)、CD206(1∶1500)、Arg-I(1∶1000)、GAPDH(1∶1500)。③MTT法檢測(cè)T24細(xì)胞增殖能力:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T24細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔約含1×104個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24h后加入20μL(5mg/mL)MTT液,在37o室溫下內(nèi)培養(yǎng)4h,棄掉培養(yǎng)液;加入DMSO 150μL,震蕩培養(yǎng),采用酶標(biāo)儀對(duì)其光密度OD(波長(zhǎng)450nm)進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算細(xì)胞增殖能力。④劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:移取10mg已滅菌處理的蒸餾水,將蒸餾水定容于規(guī)格為100mL的容量瓶后,獲得1mg per m的5-氟尿嘧啶溶液;移液器獲取50mL劑量的5-氟尿嘧啶溶液,使單層細(xì)胞出現(xiàn)一字劃痕,加入預(yù)先配置獲得的5-氟尿嘧啶溶液;利用顯微鏡完成取圖,進(jìn)行分析。⑤Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞采用PBS漂洗三次,制備單細(xì)胞懸浮液,5×105個(gè)細(xì)胞/mL,臺(tái)盼藍(lán)染色。在Transwell培養(yǎng)板上接種100μL細(xì)胞懸浮液,加入無血清培養(yǎng)基200μL。培養(yǎng)24h后,采用濕棉簽擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜表面的細(xì)胞,取出上室,用線拴住,做好標(biāo)記;蘇木素染色1min,梯度乙醇脫水(70～100%),二甲苯透明;在高倍鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野,計(jì)算平均數(shù)。⑥Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá):其中一抗稀釋比例Survivin(1∶1500)、MMP-2(1∶1500)、MMP-9(1∶1000)、E-Cadherin(1∶1500)、Vimentin(1∶1500)、N-Cadherin(1∶1500)、GAPDH(1∶1500),其余步驟同②所示。

圖6 Western-blot檢測(cè)各組膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3.4腫瘤細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白表達(dá):與Control-NC組相比,SPHK1過表達(dá)會(huì)提升T24細(xì)胞內(nèi)Vimentin、N-Cadherin蛋白表達(dá),降低E-Cadherin蛋白表達(dá)(P<0.05);SPHK1沉默則會(huì)降低T24細(xì)胞內(nèi)Vimentin、N-Cadherin蛋白表達(dá),提升E-Cadherin蛋白表達(dá)(P<0.05);SPHK1過表達(dá)可以促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞EMT進(jìn)程,見圖7。

1.4方 法

圖7 Western-blot檢測(cè)各組膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白濃度表達(dá)

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)的研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌的病理發(fā)展及遠(yuǎn)處擴(kuò)散是一個(gè)復(fù)雜的病理過程,受到諸多因素影響[5]。鞘磷脂的活性代謝產(chǎn)物鞘氨醇激酶1(SPHK1)屬于調(diào)節(jié)體內(nèi)鞘磷脂代謝的關(guān)鍵酶類物質(zhì)之一,在多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)。腫瘤局部微環(huán)境可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化,進(jìn)而促進(jìn)TAMs向促腫瘤方向的M2型極化,在多種腫瘤組織中的TAMs均具有M2型巨噬細(xì)胞的特征[6]。SPHK1可以調(diào)控腫瘤微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞成分改變,但是否對(duì)巨噬細(xì)胞的極化類型及發(fā)展趨勢(shì)具有影響目前涉及較少[7]。本論文結(jié)果SPHK1在巨噬細(xì)胞內(nèi)得到成功過表達(dá)或者沉默處理,SPHK1的過表達(dá)可以促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206及ArgI的表達(dá)及熒光強(qiáng)度,反之亦然,由此看出,SPHK1可以促進(jìn)M2細(xì)胞的極化比例,對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。

狗蛋匆匆跑下山，任山谷里的野風(fēng)在耳邊吟唱。他笑了，在外學(xué)習(xí)四年后終于毫不遮擋地笑了，那爽朗的笑聲和在風(fēng)中更加悅耳。

腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一,SPHK1的表達(dá)不僅可以改變脂類分子的動(dòng)態(tài)平衡,亦可以影響腫瘤細(xì)胞的周期[8]。研究結(jié)果顯示,SPHK1的過表達(dá)可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖,反之亦然;SPHK1的過表達(dá)亦可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力,上調(diào)細(xì)胞遷移侵襲蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá),可以總結(jié)到,SPHK1通過影響提升M2巨噬細(xì)胞的極化來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,為膀胱腫瘤的遠(yuǎn)處擴(kuò)散提供病理基礎(chǔ)。

利用篩選出的13對(duì)引物，對(duì)缺齒蓑蘚11個(gè)居群106份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了150個(gè)位點(diǎn)，其中148個(gè)為多態(tài)位點(diǎn)。11個(gè)居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率為45.95% ～ 81.08%，其中最高的是浙江溫州烏巖嶺居群，最低的是浙江金華大盤山居群，物種總多態(tài)位點(diǎn)百分率為98.67%。

轉(zhuǎn)移是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵性標(biāo)志之一,細(xì)胞外基質(zhì)的降解、EMT、腫瘤血管的生成、腫瘤微環(huán)境的改善等均會(huì)導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[9]。EMT的存在使得癌細(xì)胞更加具有侵略性,進(jìn)而體現(xiàn)出更加強(qiáng)烈的侵襲性。目前靶向EMT信號(hào)通路可以給與癌癥治療起到重要理論支持[10]。SIP信號(hào)通路可以對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT做出應(yīng)答,SPHK1可以通過加速E-Cadherin溶酶體的降解來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移,進(jìn)而誘導(dǎo)EMT,同時(shí)SPHK1的過表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤的發(fā)生,刺激癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、血管的生成、增殖及存活進(jìn)程[11]。本研究結(jié)果顯示,T24細(xì)胞內(nèi)SPHK1的過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT,提升Vimentin、N-Cadherin蛋白表達(dá),降低E-Cadherin蛋白表達(dá);反之亦然;上述的數(shù)據(jù)再次提示SPHK1在膀胱癌EMT中發(fā)揮重要的作用,SPHK1通過促進(jìn)EMT進(jìn)程來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,最終促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處擴(kuò)散能力。

綜上我們得出,SPHK1過表達(dá)可以提升M2型巨噬細(xì)胞極化程度,促進(jìn)膀胱癌腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力及EMT進(jìn)程,最終提升膀胱癌的遠(yuǎn)處擴(kuò)散能力;在后續(xù)的研究中我們將致力于進(jìn)一步探究表觀遺傳學(xué)-免疫因素與腫瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制,為更多的癌癥患者的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。