張 靜, 任 榮, 帕提古麗·阿斯討拜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院腎病科, 新疆 烏魯木齊 830011)

糖尿病腎病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥,是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的重要原因之一[1]。表觀遺傳因素在DKD的進(jìn)展中起到重要作用[2]。N6-甲基腺苷(m6A)是最豐富的RNA內(nèi)部修飾,甲基轉(zhuǎn)移酶樣3 (Methyltransferase-like 3,METTL3)構(gòu)成 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的核心組分,負(fù)責(zé)催化 RNA 發(fā)生 m6A 修飾[3]。已有研究表明,METTL3參與DKD的進(jìn)程[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)METTL3可以通過(guò)調(diào)控miRNA在DKD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5]。其中miR-126參與了DKD的發(fā)生發(fā)展[6]。但關(guān)于METTL3與miR-126在DKD中的調(diào)控機(jī)制尚不明確。研究因此,本次研究擬通過(guò)建立糖尿病腎病大鼠模型,以METTL3為切入點(diǎn),探討METTL3調(diào)控miR-126影響糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究,為臨床 DKD 的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠,體重(300±20)g,雌雄各半,6～8周齡。動(dòng)物來(lái)源湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):42000600048916,SCXK(鄂)2022-0065,倫理證明編號(hào)為202220159。

1.2試驗(yàn)試劑:尿素氮(BUN)含量檢測(cè)試劑盒,Solarbio,中國(guó);尿蛋白測(cè)試試劑盒,南京建成,中國(guó);TGF-β1 ELISA試劑盒,Cusabio,中國(guó);smad2抗體、smad3抗體、smad7抗體、METTL3抗體,Proteintech,中國(guó);GAPDH,Bioswamp Goat anti-Rabbit IgG,Bioswamp,中國(guó);TIANScript RT Kit,SuperReal PreMix Plus(SYBR Green),天根,中國(guó);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,Solarbio,中國(guó)。

1.3方 法

1.3.1動(dòng)物模型建立:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,隨機(jī)分為兩組,模型組與對(duì)照組。對(duì)照組喂食正常飼料,模型組給與高脂飼料喂養(yǎng)4周,在第二周摘除左側(cè)腎臟,注射青霉素防止感染。術(shù)后3周給與 30mg/kg STZ 腹腔注射,連續(xù)3d,誘導(dǎo)DKD。若FBG ≥ 16.7moL/L,則判斷糖尿病模型制備成功;然后,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng),4周后測(cè)定尿白蛋白,尿白蛋白≥30mg/24h 即判斷DKD模型制備成功。

1.3.2動(dòng)物分組及處理:將模型組大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為3組(每組8只):DKD組、DKD+siMETTLE3組和DKD+siMETTL3 NC組。siMETTL3 NC 組和siMETTL3組,尾靜脈分別注射METTL3干擾對(duì)照慢病毒和METTL3干擾慢病毒,注射20μL,病毒滴度為 1×108TU/mL,每周注射1次,連續(xù)4周。對(duì)照組和模型組注射等量生理鹽水。

1.3.3標(biāo)本采集:在取材前收集尿液。心臟采血,靜置30min后,以3000r/ min離心10min,分離血清后于-20℃保存。所有大鼠麻醉處死后,獲得腎臟組織,0.9%氯化鈉溶液中清洗后,一部分腎組織通過(guò)4%多聚甲醛固定,另一部分腎組織于-80℃保存。

1.3.4生化指標(biāo)檢測(cè):采用生化檢測(cè)方法測(cè)空腹血糖 (FBG)、尿素氮 (BUN)、24h尿蛋白(UTP)的水平。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同分組細(xì)胞中miR126相對(duì)表達(dá)量:設(shè)計(jì)miR-126的熒光定量PCR引物。miR-126 loop primer:GTCGTATCC-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCGTACC,Forward primer:TGCGCCATTATTACTTTTGGT,Reverse primer:CCAGTGCAGGGTCC GAGG TATT;U6 Forward primer:CGCTTCGGCAGCACATATAC,Reverse primer:AAATATGGAACGC TTCACGA。加入4 × gDNA wiper Mix 4μL、RNA 2μg,RNAase-free Water加入至15μL,在42℃環(huán)境下進(jìn)行2min的反應(yīng),繼續(xù)加入5 × HiScript Ⅱ Select qRT SuperMix Ⅱ 4μL、Oligo (dT)23VN /mirna loop primer (10μM) 1μL,在溫度為50℃環(huán)境下,進(jìn)行15min的分離,再在85℃環(huán)境下進(jìn)行5s的分離,隨后將獲取得到的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于冰上或冷藏備用。qPCR的反應(yīng)試劑及步驟:Forward primer 10μM和Reverse primer 10μM各加入0.4μL,2XSYBR Select Master Mix (2×) 加入10μL,RNase-free water 加入4.8μL,cDNA template 加入4μL,50×ROX Reference Dye 2 加入0.4μL,配制成20μL 體系混合均勻。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)計(jì)反應(yīng)參數(shù),參數(shù)如下:95℃,10min,95℃,15s,60℃ 60s,95℃,15s,40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法統(tǒng)計(jì)分析qPCR結(jié)果。

1.3.6Western blot檢測(cè)METTL3、smad2、smad3、smad7的蛋白表達(dá)情況:將不同分組組織裂解、離心、BCA定量后,檢測(cè)METTL3、smad2、smad3、smad7的蛋白表達(dá)。方法:配置5%濃縮膠和12%分離膠、樣本變性加樣、電泳和轉(zhuǎn)膜,將膜裝入 5% TBST封閉液,制置室溫?fù)u床2h,加5mL一抗稀釋液,4℃過(guò)夜。10mL二抗 ( 1∶1000稀釋 ) 置于搖床上2h。顯色于暗室中壓片曝光顯影。結(jié)果用BandScan分析膠片灰度值,分別計(jì)算檢測(cè)蛋白條帶與參比蛋白條帶強(qiáng)度比值( % )。

1.3.7ELISA檢測(cè)血清中TGF-β1表達(dá):實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,組織勻漿,取上清。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔,每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50μL;待測(cè)樣本孔中先加入樣本稀釋液40μL,再加入待測(cè)樣本10μL。37℃溫育30min。每孔中加入檢測(cè)抗體50μL,充分混勻,37℃溫育30min。每孔加顯色劑A 50μL,顯色劑B 50μL,振蕩混勻后,37℃避光顯色10min,每孔加終止液50μL。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠體重、血糖、尿蛋白、尿素氮的變化:大鼠血糖結(jié)果顯示,DKD組的大鼠血糖水平、尿素氮、24h尿蛋白含量高于Control組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DKD+siMETTL3的血糖水平、尿素氮、24h尿蛋白含量低于DKD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠體質(zhì)量結(jié)果顯示,DKD組的體質(zhì)量低于Control組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DKD+ siMETTL3組的大鼠體質(zhì)量高于DKD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體重、血糖、尿蛋白、BUN的變化

2.2各組大鼠miR-126表達(dá)水平的比較:實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,DKD組的miR-126的表達(dá)水平低于Control組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DKD+siMETTL3組的miR-126的表達(dá)水平高于DKD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠miR-126表達(dá)水平的比較

2.3各組大鼠TGF-β、METTLE3、smad2、smad3、smad7表達(dá)水平的比較:采用ELISA檢測(cè)不同分組中TGF-β,Western blot檢測(cè)不同分組中METTLE3、smad2、smad3、smad7的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DKD組的TGF-β、METTLE3、smad2、smad3的表達(dá)水平高于Control組,smad7的表達(dá)水平低于Control組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DKD+siMETTL3組的TGF-β、METTLE3、smad2、smad3的表達(dá)水平低于DKD組,smad7的表達(dá)水平高于DKD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3A-F。

圖3 各組大鼠TGF-β、METTLE3、smad2、smad3、smad7表達(dá)水平的比較

3 討 論

m6A修飾是由m6A WER(“writer”,“Erasers”和“Readers”)蛋白介導(dǎo)的動(dòng)態(tài)可逆修飾過(guò)程,可以影響幾乎所有類(lèi)型腎細(xì)胞的生物學(xué)功能,參與DKD的發(fā)生發(fā)展[7]。METTL3是一類(lèi)writer蛋白,在糖尿病腎病患者腎活檢足細(xì)胞中升高,并與腎損傷相關(guān)[8]。敲除METTL3可顯著降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥和凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),DKD大鼠腎臟組織中METTL3的表達(dá)水平顯著升高,通過(guò)siRNA干擾后,METTL3的表達(dá)水平降低。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),DKD組的血糖、尿素氮、24h尿蛋白含量顯著升高,體質(zhì)量降低。這與袁瑾的研究結(jié)果一致[9]。通過(guò)siRNA干擾后,可以顯著降低血糖、尿素氮、24h尿蛋白,提高大鼠體質(zhì)量。表明糖尿病腎病可促進(jìn)腎臟組織中METTL3的表達(dá),METTL3也可以對(duì)糖尿病腎病發(fā)揮調(diào)控功能。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miRNA可被METTL3介導(dǎo)的m6A修飾調(diào)控,影響miRNA的穩(wěn)態(tài)[10]。已知,METTL3的異常表達(dá)可以調(diào)控miRNA的成熟進(jìn)程,進(jìn)而調(diào)控miRNA的表達(dá)水平,影響疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)在高糖細(xì)胞模型中METTL3可以調(diào)控miR-126的表達(dá)水平,但在DKD動(dòng)物水平兩者之間的調(diào)控關(guān)系尚不清楚[6]。本研究發(fā)現(xiàn),在DKD大鼠腎臟組織中miR-126的表達(dá)水平顯著降低,干擾METTL3后,miR-126的表達(dá)水平顯著升高。表明了METTL3可以在DKD大鼠模型中調(diào)控miR-126的表達(dá)影響疾病的進(jìn)展。

腎臟纖維化是DKD發(fā)生發(fā)展的主要病理特征及核心事件[12]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (TGF-β1)是DKD纖維化的關(guān)鍵調(diào)控因子,TGF-β1的過(guò)表達(dá)可以激活下游效應(yīng)Smad通路,刺激腎小球和腎小管細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積,促進(jìn)腎臟纖維化,影響腎功能。本研究發(fā)現(xiàn),DKD誘導(dǎo)TGF-β1、smad2、smad3,抑制smad7的表達(dá)。通過(guò)siRNA干擾后,發(fā)生回復(fù)。Smad2和smad3是促纖維化因子,而smad7是抗纖維化因子。故本次研究結(jié)果表明,抑制METTL3可以有效的抑制DKD腎臟組織的纖維化。

綜上所述,在DKD中METTL3高表達(dá),干擾METTL3可以促進(jìn)miR-126的表達(dá)活性,抑制TGF-β/smad通路,改善病理特征,緩解DKD的進(jìn)展,這為DKD的機(jī)制研究提供了新的方向。