左 封, 李 晶, 白夢婷, 吳 悠, 陳偉棟

(湖北省武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院腎內(nèi)科, 湖北 武漢 430030)

糖尿病腎病(Diabetes nephropathy,DN)是一種由慢性高血糖導致的腎臟損傷,是糖尿病(DM)患者常見的并發(fā)癥之一。DN是終末期腎病(ESRD)的主要原因,在糖尿病患者中發(fā)病率和死亡率較高[1]。在病理學上,DN的特征是慢性腎臟炎癥和纖維化,導致細胞外基質(zhì)(ECM)在腎間質(zhì)中沉積和基底膜增厚。在目前的臨床工作中,由于沒有治療DN的有效藥物,大多數(shù)糖尿病患者最終會發(fā)展為終末期腎病。因此,開發(fā)治療DN的新的有效藥物對于患者而言至關重要。根據(jù)中醫(yī)觀念,糖尿病腎病的證型可分為氣虛、血瘀、陰虛、濁濕、痰濕、陽虛、血虛、氣滯[2]。臨床觀察顯示,氣虛所致血瘀是DN患者最常見的中醫(yī)證候。因此,補氣改善血液循環(huán)的中藥方劑已常用于DN的治療[3]。腎經(jīng)水腫湯(Shenjingshuizhong decoction)是一種調(diào)理腎經(jīng)的中藥方劑,有助于利尿消腫與健脾益腎。腎經(jīng)水腫湯的中藥組成如下:黃芪、桂枝、西洋參、茯苓皮、山藥、薏苡仁、防風、豬苓、地膚子與車前子。所有藥物均歸屬腎經(jīng),具有良好的保護腎臟的功效。有研究指出,腎經(jīng)水腫湯可以緩解腹膜透析患者的不適癥狀,提高患者的生活質(zhì)量[4]。盡管腎經(jīng)水腫湯在一些研究中顯示出對腎臟疾病的潛在益處,但其對DN的作用機制尚不清楚,仍需要進一步研究。因此,本研究探討腎經(jīng)水腫湯對DN大鼠的保護作用及調(diào)節(jié)機制,為腎經(jīng)水腫湯治療DN提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料及儀器:SPF級12周齡的SD雄性大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,購自北京斯貝福生物技術有限公司。腎經(jīng)水腫湯的中藥組成如下:黃芪、桂枝、西洋參、茯苓皮、山藥、薏苡仁、防風、豬苓、地膚子與車前子,所有藥物均為顆粒劑,購自江陰天江藥業(yè)有限公司。α-硫辛酸購自南京建成生物有限公司。鏈脲佐菌素(STZ),無菌檸檬酸緩沖液,3%水合氯醛,非抗凝管,4%多聚甲醛,高碘酸希夫染色液,硫酸,乙醇等購自美國sigma公司。RIPA裂解緩沖液,BCA試劑盒,5%脫脂奶粉,洗滌緩沖液(TBST),PBST緩沖液,ECL試劑盒等購自北京索萊寶公司。PVDF購自美國Invitrogen公司。所有抗體均購自美國Abcam公司。全自動生化分析儀(AU480)購自美國貝克曼公司。倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠模型建立與分組處理:所有動物試驗均參照《實驗動物護理和使用指南》[5]。動物研究獲得武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院動物倫理與福利委員會的批準(批準號:20220057)。將購入的60只SPF級12周齡的SD雄性大鼠(5只/籠)適應性飼養(yǎng)一周(光暗環(huán)境:12h/12h;飼養(yǎng)溫度:22℃～24℃;飼養(yǎng)濕度:50%～70%)。所有大鼠可以自由接觸足夠的食物和水。之后,將大鼠隨機分為6組(n=10/組):正常對照組、DN模型組、腎經(jīng)水腫湯低劑量組(1g/kg)、腎經(jīng)水腫湯中劑量組(2g/kg)、腎經(jīng)水腫湯高劑量組(4g/kg)與陽性對照組(α-硫辛酸,60mg/kg)。DN的建模方法參照前人的報道[6]。其中,DN模型組、腎經(jīng)水腫湯低、中、高劑量組與陽性對照組的50只大鼠通過腹膜內(nèi)單次注射60mg/kg STZ,72h之后利用尾靜脈采血法測定大鼠的血糖水平(血糖濃度 ≥ 16.70mmoL/L則提示DM大鼠建模成功)。3周后測定DM大鼠24h尿蛋白(24h尿蛋白 >30mg則提示DN大鼠建模成功)。正常對照組大鼠則通過腹膜內(nèi)單次注射等體積的無菌檸檬酸緩沖液。DN建模成功后,腎經(jīng)水腫湯低劑量(1g/kg)、中劑量(2g/kg)、高劑量(4g/kg)劑量組的30只大鼠飼喂混有相應劑量藥物的專用飼料,正常對照組與DN模型組大鼠飼喂正常基礎飼料。與此同時,陽性對照組大鼠通過腹膜內(nèi)注射α-硫辛酸(60mg·kg-1·d-1),1次/d,持續(xù)28d。

1.2.2記錄大鼠一般情況:在實驗干預過程中,對大鼠的精神狀態(tài)與體重進行觀察記錄。與此同時,在DN建模成功后第2天與28d干預結束后,分別利用尾靜脈采血法測定大鼠的血糖水平并記錄為初始血糖與末期血糖。

1.2.3檢測大鼠腎功能指標:在實驗干預結束后,將大鼠利用3%水合氯醛麻醉并固定。利用非抗凝管收集各組大鼠的外周血,并在2500r/min離心15min后,將得到的血清置于全自動生化分析儀檢測血清肌酐(Cr)與血清尿素氮(BUN)。將處理后的各組大鼠安樂死,收集腎臟組織并將其儲存在-80℃或石蠟包埋中,用于后續(xù)實驗。

1.2.4大鼠腎臟組織學檢查:收集各組大鼠的腎臟組織,利用生理鹽水清洗干凈后浸泡于4%多聚甲醛中固定。之后,將組織脫水,透明并包埋到石蠟組織中。將石蠟包埋的腎組織切成5μm厚的切片并用高碘酸希夫(PAS)染色。將組織切片浸泡在1%的高碘酸希夫染色溶液中,處理15min。清洗后,將組織切片浸泡在1%硫酸中進行水解10min。將組織切片在蒸餾水中洗凈,以去除水解產(chǎn)物。之后,將組織切片浸入逐漸濃度遞增的乙醇,然后用透明劑進行透明處理并封片。使用顯微鏡觀察染色結果(400×放大倍率),并記錄所看到的特征。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡測定相關蛋白水平:利用RIPA裂解液裂解各組大鼠的腎臟組織,分離組織中的總蛋白。利用BCA試劑盒評估蛋白質(zhì)濃度。之后,運用10% SDS-PAGE分離蛋白,并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。利用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液在室溫下封閉1h后,加入一抗:抗-促血管生成素1(anti-Ang-1)、抗-激活素樣激酶1(anti-ALK1)、抗-轉(zhuǎn)化生長因子-β(anti-TGF-β1)、和anti-β-actin,在4℃下孵育過夜。最后,用PBST清洗3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗并孵育2h。用ECL試劑盒檢測蛋白信號并用ImageJ軟件進行分析。

2 結 果

2.1腎經(jīng)水腫湯對大鼠一般情況及體重、血糖的影響:正常對照組大鼠的健康狀態(tài)良好,毛發(fā)油亮,反應靈敏,體型增長明顯。DN模型組大鼠飲水攝食量增加,排尿增加,毛發(fā)無光澤,行動緩慢,精神萎靡不振,體型消瘦。經(jīng)過各組藥物治療后,上述癥狀均有所減輕。在實驗干預前各組大鼠的體重無顯著性差異(P>0.05)。實驗干預后,與正常對照組相比,其余各組大鼠的體重均顯著下降(P<0.05)。與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯低、中、高劑量組與陽性對照組的體重均顯著提高,且具有濃度依賴性(P<0.05)。腎經(jīng)水腫湯高劑量組的體重與陽性對照組無顯著性差異(P>0.05)。此外我們發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,其余各組大鼠的血糖水平均顯著提高(P<0.05)。與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯低、中、高劑量組與陽性對照組的血糖水平均顯著下降,且降糖效果具有濃度依賴性(P<0.05)。腎經(jīng)水腫湯高劑量組的降糖效果與陽性對照組無顯著性差異(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠體重與血糖濃度比較

2.2腎經(jīng)水腫湯對大鼠腎功能指標的影響:結果顯示,與正常對照組相比,其余各組大鼠的Cr與BUN水平均顯著提高(P<0.05)。與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯低、中、高劑量組與陽性對照組的Cr與BUN水平均顯著下降,且具有濃度依賴性(P<0.05)。腎經(jīng)水腫湯高劑量組的Cr與BUN水平與陽性對照組無顯著性差異(P>0.05)。具體見表2。

表2 各組大鼠腎功能指標比較

2.3腎經(jīng)水腫湯對大鼠腎組織結構的影響:結果顯示,與正常對照組相比,其余各組大鼠的腎組織切片均顯示間質(zhì)增生,腎小球基底膜增厚。與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯低、中、高劑量組與陽性對照組的腎組織切片間質(zhì)增生和腎小球基底膜的增厚程度均明顯減弱,且具有濃度依賴性。腎經(jīng)水腫湯高劑量組與陽性對照組無顯著性差異。具體見圖1。

圖1 腎經(jīng)水腫湯對大鼠腎組織結構的影響

2.4腎經(jīng)水腫湯對大鼠腎臟組織中Ang-1表達以及TGF-β1/ALK1通路水平的影響:結果顯示,與正常對照組相比,DN模型組大鼠的腎臟組織中Ang-1、TGF-β1與ALK1的蛋白表達水平均顯著提高(P<0.01)。與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯低、中、高劑量組與陽性對照組的腎臟組織中Ang-1、TGF-β1與ALK1的蛋白表達水平均顯著下降,且具有濃度依賴性(P<0.05)。腎經(jīng)水腫湯高劑量組與陽性對照組無顯著性差異(P>0.05)。具體見圖2。

圖2 Ang-1、TGF-β1與ALK1蛋白表達情況分析

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),DN模型組大鼠呈現(xiàn)典型癥狀。經(jīng)過腎經(jīng)水腫湯治療后癥狀均有所減輕。這說明腎經(jīng)水腫湯對DN具有一定的治療作用。長期高血糖會引起腎小球濾過膜的損傷。隨著疾病的發(fā)展,血清Cr和BUN的升高則表明腎功能的損害加重[7]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,DN模型組大鼠的體重均顯著下降,血糖水平與血清Cr與BUN水平均顯著提高(P<0.05)。與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯治療組的體重均顯著提高,血糖水平與血清Cr與BUN水平均顯著下降(P<0.05),這說明腎經(jīng)水腫湯可以控制血糖水平并緩解DN大鼠的腎臟功能損傷。

在DN中,腎小球硬化和基底膜增厚可能導致腎間質(zhì)纖維化,引起腎小管的結構和功能的改變,進而影響水分和電解質(zhì)的平衡。傅松波[8]等發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可以改善DN大鼠的腎臟超微結構,緩解DN大鼠的腎損傷。我們發(fā)現(xiàn),DN模型組大鼠的腎組織間質(zhì)增生,腎小球基底膜增厚。與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯治療組的腎組織病變程度均顯著減弱(P<0.05)。這說明腎經(jīng)水腫湯可以緩解DN大鼠的腎臟損傷與腎結構變化,與傅松波[8]等的研究相似。郭曉玲[9]等的研究發(fā)現(xiàn),DN大鼠的腎臟組織中Ang-1的表達顯著上調(diào)。芪芍膠囊可以抑制DN大鼠腎組織中Ang-1的表達,進而起到腎保護作用。Mohammad等[10]研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可以抑制TGF-β1/ALK1信號通路,進而抑制DN大鼠的腎臟血管生成,并緩解DN大鼠的腎臟超微結構變化。本研究發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,DN模型組大鼠的腎臟組織中Ang-1、TGF-β1與ALK1的蛋白表達水平均顯著提高(P<0.01)。這些結果與郭曉玲[9]等的研究相似。此外,我們首次發(fā)現(xiàn)與DN模型組相比,腎經(jīng)水腫湯治療組的腎臟組織中Ang-1、TGF-β1與ALK1的蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)。這說明腎經(jīng)水腫湯通過抑制TGF-β1/ALK1信號通路進而降低DN大鼠的腎臟血管生成,與Mohammad等[10]的研究相呼應。

本文結果表明,腎經(jīng)水腫湯通過抑制TGF-β1/ALK1信號通路進而降低DN大鼠的血糖水平、腎功能損傷、腎臟血管生成與腎結構變化。證實腎經(jīng)水腫湯可能是治療DN的有效方劑。