劉紅英, 解發(fā)桃, 魏艷君

(攀鋼集團(tuán)總醫(yī)院消化內(nèi)科, 四川 攀枝花 617000)

食管癌發(fā)于食管上皮,是臨床常見的消化道惡性腫瘤疾病,由于食管鱗癌患者的早期癥狀并不具備特異性患者就診時(shí)大多已發(fā)展至食管癌中晚期,其治療效果及預(yù)后均較差,死亡率較高[1]。因此尋找能夠調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的藥物及信號(hào)通路具有重要意義。喬松素(Pinocembrin,Pin)是從植物和蜂膠中提取的一種黃酮類天然化合物,大量研究表明,Pin具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌以及抗氧化損傷作用[2],與此同時(shí),Pin還能夠抑制卵巢癌、結(jié)直腸癌等癌細(xì)胞的增殖及遷移進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用[3],因此推測(cè)Pin可能也與食管鱗癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展有關(guān)。有學(xué)者深入研究發(fā)現(xiàn),Pin主要是通過磷脂酰肌醇3激酶/Akt、NF-κB等信號(hào)傳導(dǎo)通路來發(fā)揮抗癌、抗炎作用[4]。Janus酪氨酸激酶2(Janus activated kinase 2,JAK2)/信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是常見的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路,廣泛參與了細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生理活動(dòng),與炎性疾病、治療耐藥性及腫瘤疾病的發(fā)生及進(jìn)展過程具有一定的相關(guān)性[5]。蔣可心等[6]的研究則顯示,JAK2/STAT3信號(hào)通路也與食管癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。但目前關(guān)于JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的具體影響規(guī)律研究較少,因此,本研究將基于JAK2/STAT3信號(hào)通路探究Pin對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器:人KYSE-410細(xì)胞(貨號(hào):CL-0586,武漢益普生物科技有限公司);Broussonin E(貨號(hào):B30325,上海源葉生物科技有限公司);RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào):PM150110,武漢益普生物科技有限公司);CCK-8細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):BES-4202,上海博爾森生物科技有限公司);GAPDH(貨號(hào):ab181602)、p-JAK2(貨號(hào):278663)、JAK2(貨號(hào):32101)、p-STAT3(貨號(hào):278670)、STAT3(貨號(hào):267373)一抗均購自美國abcam公司;光學(xué)顯微鏡(型號(hào):WMJ-9950,上海無陌光學(xué)儀器有限公司);酶標(biāo)儀(型號(hào):Spectra Max,上海逍鵬生物科技有限公司);BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):KYSE-410細(xì)胞采用含有10%胎牛血清和1% P/S的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37℃,5% CO2,待細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%后進(jìn)行傳代,選取傳至第三代且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8檢測(cè)Pin對(duì)細(xì)胞的毒性:將KYSE-410細(xì)胞接種在96孔板中(2×103個(gè)細(xì)胞/孔)培養(yǎng)24h后,分別加入濃度為0、20、40、60、80μmoL/L的Pin培養(yǎng)72h,然后每孔中加入10μL的CCK-8溶液,并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,最后使用酶標(biāo)儀測(cè)量在460nm處的吸光度,并計(jì)算細(xì)胞存活率及半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3細(xì)胞分組:將1.2.1中細(xì)胞隨機(jī)分為KYSE-410組、Pin低濃度(Pin-L)組、Pin中濃度(Pin-M)組、Pin高濃度(Pin-H)組、Pin-H+JAK2激活劑(Pin-H+Broussonin E)組。KYSE-410組為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的KYSE-410細(xì)胞;Pin-L組、Pin-M組和Pin-H組分別用20μmoL/L、40μmoL/L和60μmoL/L的Pin培養(yǎng)[4];Pin-H+Broussonin E組采用60μmoL/L的Pin和20μmoL/L的JAK2激活劑Broussonin E培養(yǎng)[7]。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況:將1.2.2中各組KYSE-410細(xì)胞以1×104/孔的密度分別接種至96孔板中,并加入100μL培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,隨后加入10μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)液在450nm處的吸光度,記錄數(shù)值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5克隆平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成數(shù)量:將1.2.2中各組細(xì)胞以每孔5×102/孔的密度接種至6孔板中,培養(yǎng)14 d后棄去培養(yǎng)液并采用4%甲醛溶液固定細(xì)胞,結(jié)晶紫染色液染色后拍照,并采用Image J軟件分析圖像以計(jì)算菌落形成數(shù)量。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移及侵襲能力:遷移實(shí)驗(yàn):將1.2.2中各組細(xì)胞接種至Transwell上室中(1×104個(gè)細(xì)胞/孔),并于上室中加入無血清的培養(yǎng)基,下室加入含有10% FBS的培養(yǎng)基,在37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,培養(yǎng)結(jié)束后用棉簽除去上室膜內(nèi)的細(xì)胞,并用4%甲醇固定穿過膜且粘附在膜外的細(xì)胞,再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色、PBS洗滌。侵襲實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞接種至含有基質(zhì)膠的Transwell上室中培養(yǎng),其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)一樣。最后在倒置顯微鏡下觀察遷移和侵襲的細(xì)胞,隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×200)觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù),計(jì)算各組細(xì)胞的遷移及侵襲數(shù)。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況:將各組細(xì)胞接種至6孔板中進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行重懸、收集,用PBS洗滌,隨后再次重懸于300μL含有5μL Annexin V和5μL碘化丙錠(PI)的緩沖液孵育30min。采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.8Western blot檢測(cè)JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá):取1.2.2中各組細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,經(jīng)蛋白水解液提取總蛋白并檢測(cè)含量,隨后將細(xì)胞置于98℃下煮沸10min使其變性后通過10% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離,轉(zhuǎn)膜。結(jié)束后加入脫脂牛奶封閉1h。加入p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3一抗(稀釋濃度均為1∶1000),4℃孵育過夜,再于室溫下加入二抗(稀釋濃度為1∶2000)孵育1h,ECL試劑盒顯色后,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,采用凝膠成像分析系統(tǒng)和Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值,得到蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1Pin對(duì)細(xì)胞毒性的影響:與0μmoL/L相比,20、40、60、80μmoL/L的Pin處理組的細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。Pin處理KYSE-410細(xì)胞24h后的IC50為64.77μmoL/L。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為20、40、60μmoL/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中Pin低、中、高濃度組。見表1。

表1 Pin對(duì)細(xì)胞毒性的影響

2.2Pin對(duì)KYSE-410細(xì)胞存活率的影響:相較于KYSE-410組,Pin-L組、Pin-M組和Pin-H組細(xì)胞存活率均有不同程度的降低(P<0.05),而Pin-H+Broussonin E組細(xì)胞存活率高于Pin-H組(P<0.05),見表2。

表2 各組KYSE-410細(xì)胞存活率

2.3Pin對(duì)KYSE-410細(xì)胞克隆形成數(shù)量的影響:與KYSE-410組相比,Pin-L組、Pin-M組和Pin-H組細(xì)胞克隆數(shù)量減少(P<0.05),而Pin-H+Broussonin E組細(xì)胞克隆數(shù)量多于Pin-H組(P<0.05)。見圖1和表3。

圖1 各組KYSE-410細(xì)胞克隆形成能力

表3 各組KYSE-410細(xì)胞克隆形成數(shù)量

2.4Pin對(duì)KYSE-410細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響:Pin-L組、Pin-M組和Pin-H組細(xì)胞的遷移及侵襲數(shù)量少于KYSE-410組(P<0.05),但Pin-H+Broussonin E組細(xì)胞的遷移及侵襲數(shù)量相較于Pin-H組增多(P<0.05)。見圖2和表4。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組KYSE-410細(xì)胞的遷移和侵襲能力(×200)

表4 各組KYSE-410細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)量

2.5Pin對(duì)KYSE-410細(xì)胞凋亡率的影響:Pin-L組、Pin-M組和Pin-H組細(xì)胞凋亡率高于KYSE-410組(P<0.05),而Pin-H+Broussonin E組細(xì)胞凋亡率低于Pin-H組(P<0.05)。見圖3和表5。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組KYSE-410細(xì)胞凋亡情況

表5 各組KYSE-410細(xì)胞凋亡率

2.6各組細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:相較于KYSE-410組,Pin-L組、Pin-M組和Pin-H組細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3值降低(P<0.05),而Pin-H+Broussonin E組高于Pin-H組(P<0.05)。見圖4和表6。

圖4 各組KYSE-410細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)條帶

表6 各組KYSE-410細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

食管鱗癌約占食管癌總數(shù)的95%,患者早期癥狀通常不具備特異性,容易出現(xiàn)誤診、漏診等情況,而隨著病情發(fā)展,患者出現(xiàn)吞咽困難、胸痛等癥狀就診時(shí),往往已處于食管癌中晚期,針對(duì)此類患者臨床常采用手術(shù)以及放、化療等治療方式,但治療效果較差,且后期容易發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,威脅患者的生命健康。而目前食管鱗癌的發(fā)生機(jī)制尚不明確,并無明確治療靶點(diǎn),因此尋找能夠調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的信號(hào)通路及藥物將有助于改善臨床治療效果及患者的預(yù)后狀態(tài)[8]。

Pin是一種天然黃酮類化合物,主要從植物中分離提取,其作用于人體時(shí)無不良副作用,機(jī)體對(duì)Pin的耐受性較好,能夠發(fā)揮抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡等廣泛的生物學(xué)功能[9]。而近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn),Pin還能夠通過相關(guān)受體及信號(hào)通路來抑制卵巢癌、黑色素瘤等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移,對(duì)細(xì)胞癌變也能起到抑制作用[10]。本研究結(jié)果顯示,隨著Pin濃度的增加,KYSE-410細(xì)胞的存活率、克隆細(xì)胞形成數(shù)量、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量相較于KYSE-410組均有不同程度的降低,而細(xì)胞凋亡率逐漸升高。此結(jié)果初步提示,Pin能夠?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞惡性進(jìn)展起到抑制作用。為進(jìn)一步了解Pin對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的具體調(diào)控機(jī)制,繼續(xù)對(duì)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了探究。

JAK2/STAT3信號(hào)通路與細(xì)胞的生長、增殖等生理學(xué)活動(dòng)密切相關(guān),能夠參與并調(diào)控炎性疾病、神經(jīng)損傷等疾病的發(fā)生,不僅如此,JAK2/STAT3信號(hào)通路還能夠調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,從而影響胃癌、膽囊癌等多種惡性腫瘤疾病的進(jìn)展[11-12]。本研究結(jié)果顯示,Pin-L組、Pin-M組和Pin-H組細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3值相較于KYSE-410組降低,提示Pin能夠?qū)AK2/STAT3信號(hào)通路起到抑制作用。隨后在高濃度Pin的基礎(chǔ)上于培養(yǎng)基中添加了Broussonin E,結(jié)果顯示,Broussonin E的加入逆轉(zhuǎn)了Pin對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的抑制作用,且Pin-H+Broussonin E組細(xì)胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值高于Pin-H組,表明Pin可能是通過抑制JA2K/STAT3信號(hào)通路來抑制食管鱗癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。殷星等[13]的研究結(jié)果也顯示,銀杏內(nèi)酯B能夠通過阻遏JAK2/STAT3信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用,這與本研究結(jié)果一致。

綜上所述,Pin可能通過抑制JA2K/STAT3信號(hào)通路來抑制食管鱗癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展,此結(jié)果為臨床提供了食管鱗癌治療新靶點(diǎn)。但Pin對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的調(diào)控作用可能還存在其他信號(hào)通路,后續(xù)將繼續(xù)研究Pin對(duì)食管鱗癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的具體作用機(jī)制。