張 艷, 馬 文, 楊 卉, 萬 方

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院, 貴州 貴陽 550004)

肺纖維化是一種以獨特的組織病理學(xué)模式為特征的異質(zhì)性疾病,包括大量伴有各種肺結(jié)締組織生長的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,其中間質(zhì)性肺病(ILD)和特發(fā)性肺纖維化(IPF)是最嚴(yán)重和不可逆的疾病,伴有肺實質(zhì)進(jìn)行性纖維化[1]。目前,臨床上常用有氧療法和機械通氣等非藥物治療,以及吡非尼酮和尼達(dá)尼布等抗纖維化和抗氧化藥物進(jìn)行干預(yù),但療效較差。探尋治療肺纖維化的有效藥物和靶點,仍然是臨床亟需解決的難題。研究表明,調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡是纖維化疾病治療干預(yù)的有價值戰(zhàn)略點[2]。依托泊誘導(dǎo)蛋白2.4(EI24)被鑒定為p53的靶基因,能夠減弱NF-κB活性,導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄終止,延緩肺纖維化進(jìn)展,且靶向EI24作為抗纖維化因子可能成為PF的新治療方法。橙皮苷是中藥陳皮中的活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物學(xué)活性。既往研究已證實了橙皮苷對肝纖維化的保護(hù)作用涉及多種機制,如PI3K/Akt-Nrf2-ARE途徑介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥[3]和NF-κB途徑介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[4]。然而,其對肺纖維化的影響及作用機制尚未完全明確。本研究旨在探討橙皮苷對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的保護(hù)作用,并從EI24介導(dǎo)的ECM和Th1/Th1平衡方面探討了相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物:雄性Sprague-Dawley大鼠(200g～220g,6～8周齡)從安徽金太陽藥業(yè)有限公司購買,許可證號SYXK(皖)2020-007。實驗動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實驗環(huán)境,自由獲取大鼠食物和水,將溫度保持在20℃～22℃,濕度維持在55%,交替循環(huán)12h光照/黑暗。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:2201238)。

1.2藥物與試劑:橙皮苷(≥98%,貨號CFN98839)從武漢ChemFaces購買。吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司,批號:H20133376),配制成0.012g/mL的混懸液備用。硫酸博萊霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批號:B107423),用生理鹽水溶解成1mg/mL濃度的溶液備用。從上海碧云天生物技術(shù)有限公司購買轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素4-(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、I型膠原蛋白(Col-I)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒。羥脯氨酸(HYP)檢測試劑盒從南京建成生化研究所獲得?？笶I24抗體和抗GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.3分組及模型構(gòu)建:適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,將60只大鼠隨機分成6組,每組10只:假手術(shù)組、模型組、吡非尼酮組(陽性對照,0.12g/kg吡非尼酮)、低劑量橙皮苷組(12mg/kg)、中劑量橙皮苷組(24mg/kg)和高劑量橙皮苷組(36mg/kg)。除假手術(shù)組外,其他組采用氣管內(nèi)注射博萊霉素建立肺纖維化大鼠模型[5]。所有大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉后,于氣管分叉處注射博萊霉素(5mg/kg)。假手術(shù)組注射相同體積的生理鹽水。注射24h后,大鼠灌胃給予吡非尼酮(0.12g/kg)或不同劑量的橙皮苷(濃度分別為12mg/kg、24mg/kg、36mg/kg),1次/d,連續(xù)28d。同時,假手術(shù)組和模型組尾靜脈注射同等體積生理鹽水。每周對大鼠稱重。

1.4肺功能測定:最后一次給藥完成后,進(jìn)行肺功能測定。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(35mg/kg)麻醉后,行氣管切開術(shù)后氣管插管,連接呼吸機,設(shè)置呼吸比為20∶10,呼吸頻率為65次/min。以30cm H2O壓力控制方式檢測大鼠的用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)、呼氣流量峰值(PEF)。

1.5標(biāo)本采集:肺功能測定完成后,大鼠注射過量戊巴比妥鈉后處死收集肺組織。稱重肺組織后,計算肺指數(shù):肺指數(shù)(%)=(肺重量/體重)×100%。將左肺組織固定于4%多聚甲醛溶液中用于組織學(xué)分析,右肺于冷生理鹽水中清洗后,迅速冷凍于液氮中以進(jìn)行生化研究。

1.6肺組織病理損傷檢測:肺組織固定3d后脫水并包埋于石蠟中。將石蠟包埋的組織樣本切成4μm厚的切片,隨后行蘇木精伊紅(HE)染色和Masson染色,觀察肺組織結(jié)構(gòu)、炎性細(xì)胞浸潤水平和肺纖維化程度。HE染色切片通過半定量組織學(xué)方法記錄肺泡炎癥評分,而纖維化評分則根據(jù)Masson染色切片進(jìn)行分級。

1.7炎癥介質(zhì)和膠原蛋白水平檢測:將右肺組織勻漿后,于4℃下3000r/min離心10min后獲得上清液樣品,置于-80℃保存。采用相關(guān)檢測試劑盒檢測血清TNF-α、IL-6、IL-4、TGF-β1、IFN-γ、Col I和HYP的水平。結(jié)果以ng/mg蛋白或pg/mg蛋白表示。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測:右肺組織勻漿后制備的細(xì)胞懸浮液于4℃、3000r/min離心5min后,棄上清,收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞重懸后,用FITC標(biāo)記的抗CD4抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色,經(jīng)固定和透化后,用CD4-PE-Cy5抗體染色30min,用IFN-γ-PE或IL-4-FITC抗體分別對Th1或Th2細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。用1.5%多聚甲醛固定后,上流式細(xì)胞儀測定Th1和Th2細(xì)胞的百分比。

1.9蛋白免疫印跡分析:將大鼠部分右肺組織在含PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中制備組織勻漿,冰浴后于4℃下以10000r/min離心20min。蛋白質(zhì)用雙喹啉酸法進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。隨后,將膜用 5%脫脂牛奶阻斷2h。隨后,將膜用一抗于4℃下孵育過夜。洗滌后,再將膜用過氧化物酶結(jié)合的二抗于室溫下孵育2h。洗滌后,用增強化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒對膜進(jìn)行顯影。使用GAPDH作為內(nèi)部參照。采用Image J對條帶圖像進(jìn)行分析。

1.10實時定量PCR(qRT-PCR):用TRNzol試劑(天根生物技術(shù),中國北京)從細(xì)胞和組織中提取總RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)THUNDERBIRD qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒說明書制備20μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增。熱循環(huán)條件如下:在95℃下保持30s進(jìn)行預(yù)變性,在95℃下保持5s、在60℃下保持30s、循環(huán)40次,在61℃下采集熒光。將CT值歸一化為GAPDH,并用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1橙皮苷改善肺纖維化大鼠的肺功能:對大鼠的肺功能進(jìn)行測量發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組的FVC、PEF、FEV明顯降低(P<0.05);與模型組相比,吡非尼酮組、中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組的FVC、PEF、FEV均明顯升高(P<0.05)。此外,與假手術(shù)組相比,模型組的肺指數(shù)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組的肺指數(shù)明顯降低(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠肺功能比較

2.2橙皮苷改善肺纖維化大鼠的肺組織纖維化:大鼠肺組織Masson染色顯示,假手術(shù)組大鼠肺切片膠原纖維分布正常,苯胺藍(lán)染色量較少;模型組肺泡間隔、支氣管和血管周圍區(qū)域藍(lán)色膠原沉積明顯;而吡非尼酮和橙皮苷處理可使膠原纖維束沉積減少。纖維化評分顯示,與假手術(shù)組相比,假手術(shù)組模型組纖維化評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,吡非尼酮組、中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組的纖維化評分顯著降低(P<0.05)。進(jìn)一步分析TGF-β1、Col I和HYP的水平發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組肺組織中TGF-β1、Col I和HYP的含量顯著假手術(shù)組升高(P<0.05);與模型組相比,吡非尼酮組、中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組肺組織中TGF-β1、Col I和HYP的含量顯著降低(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 各組小鼠肺組織Masson染色(×400)

表2 各組小鼠肺組織中纖維化評分和相關(guān)標(biāo)志物水平比較

2.3橙皮苷改善肺纖維化大鼠的肺組織病理損傷:HE染色可觀察到,假手術(shù)組肺組織上皮結(jié)構(gòu)完整,氣管周圍無炎細(xì)胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)完整,大小均勻。在模型組中可觀察到大量炎細(xì)胞浸潤至黏膜下層和肌層、肺泡擴張融合、肺泡間隙明顯增厚、肺泡直徑增大等特征性病理改變。低劑量橙皮苷組的病理變化與模型組相似,但有小幅緩解;吡非尼酮組和高劑量橙皮苷組肺上皮結(jié)構(gòu)基本完好,氣管周圍很少有炎細(xì)胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)基本完好(圖2)。肺泡炎癥定量分析顯示,與假手術(shù)組相比,模型組肺泡炎癥評分顯著假手術(shù)組升高(P<0.05);與模型組相比,吡非尼酮組、中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組的肺泡炎癥評分顯著降低(P<0.05)。進(jìn)一步分析肺組織炎癥細(xì)胞因子含量發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組IL-6和TNF-α水平均顯著假手術(shù)組升高(P<0.05);與模型組相比,吡非尼酮組、中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組的IL-6和TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 各組小鼠肺組織HE染色(×400)

表3 各組小鼠肺組織炎癥評分和炎癥細(xì)胞因子水平的比較

2.4橙皮苷促進(jìn)纖維化大鼠肺組織中EI24的表達(dá):結(jié)果發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組EI24 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組中EI24 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖3、圖4、表4。

圖3 各組大鼠肺組織中EI24 mRNA表達(dá)的電泳圖

圖4 各組大鼠肺組織中EI24蛋白的表達(dá)免疫印跡分析圖

表4 各組大鼠肺組織中EI24 mRNA和蛋白表達(dá)的比較

2.5橙皮苷調(diào)節(jié)肺纖維化大鼠肺組織中Th1/Th2平衡:流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠肺組織中CD4+IFN-γ+ Th1細(xì)胞亞群占比明顯降低,而CD4+IL-4+ Th2細(xì)胞亞群占比明顯升高(P<0.05);與模型組相比,中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組大鼠肺組織中Th1細(xì)胞亞群占比明顯升高,而Th2細(xì)胞亞群占比明顯降低(P<0.05)。進(jìn)一步分析Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4水平發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,模型組肺組織中IFN-γ水平顯著降低,而IL-4水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,中劑量橙皮苷組和高劑量橙皮苷組肺組織中IFN-γ水平顯著升高,而IL-13和IL-4水平顯著降低(P<0.05)。圖5、圖6和表5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺纖維化大鼠肺組織Th1細(xì)胞亞群占比

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺纖維化大鼠肺組織Th2細(xì)胞亞群占比

表5 各組大鼠肺組織中Th1/Th2細(xì)胞亞群占比和相應(yīng)細(xì)胞因子水平的比較

3 討 論

肺纖維化作為呼吸系統(tǒng)中的“類腫瘤疾病”,具有較高的病死率,嚴(yán)重威脅人類健康。目前,已獲批的抗纖維化藥物僅有吡非尼酮和尼達(dá)尼布,但僅能延緩疾病的進(jìn)展,并不能完全治愈,且存在諸多不良副作用,如胃和腸道出血以及嚴(yán)重腹瀉。因此,研究從急性肺部炎癥到肺纖維化轉(zhuǎn)變的分子機制,探尋多機制抗肺纖維化發(fā)展的藥物,仍是目前臨床研究的重點與難點。

ECM是一種在合成與降解之間動態(tài)平衡狀態(tài)下機械支持肺結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu),由多種蛋白質(zhì)和糖蛋白組成。ECM蛋白沉積增加是肺組織發(fā)生不可逆變化的明顯跡象之一,可導(dǎo)致慢性炎癥性肺部疾病(如哮喘、COPD)和IPF患者發(fā)生肺纖維化[6]。Col-I是ECM的主要成分之一,而HYP是膠原蛋白的代謝產(chǎn)物,當(dāng)肺纖維化發(fā)生時,它們都能直接反映膠原蛋白的沉積。已證實,在肺纖維化形成過程中,Col-I通常過度表達(dá),其過度積累是纖維化肺的重要特征之一,而抑制Col-I積累可能對肺纖維化有顯著的保護(hù)作用[7]。TGF-β1作為ECM積累的主要調(diào)節(jié)因子,是纖維化的潛在關(guān)鍵驅(qū)動因素,已被證實參與調(diào)控肺纖維化進(jìn)展中的細(xì)胞內(nèi)Col-I異常沉積[8]。本研究中在模型大鼠中也觀察到肺組織中TGF-β1、Col-I和HYP含量的增加。而與模型組相比,橙皮苷組大鼠肺泡炎癥和肺膠原沉積的形態(tài)均有所減輕,且橙皮苷能夠顯著抑制Col-I的積累,提示了橙皮苷在肺組織中的抗纖維化作用。橙皮苷是一種二氫黃酮衍生物,具有多種藥理作用。此外,橙皮苷通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激在急性支氣管炎中發(fā)揮肺保護(hù)作用[9]。在腎纖維化、肝纖維化動物模型中均觀察到橙皮苷的抗纖維化作用[10]。服用博萊霉素后,大鼠肺組織中的炎癥細(xì)胞浸潤增加,且炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的含量也增加了。而橙皮苷可顯著降低博萊霉素誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞浸潤和炎性細(xì)胞因子分泌,表明橙皮苷可以顯著減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥。這些結(jié)果提示,橙皮苷能夠抑制博萊霉素引起的ECM沉積和炎癥反應(yīng),減輕肺纖維化大鼠的病理變化。

本研究發(fā)現(xiàn),與模型組相比,橙皮苷組肺組織中的EI24 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高。EI24是一種由依托泊苷以依賴于p53的方式誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答基因,在機體多種組織中都至關(guān)重要。在小鼠神經(jīng)中條件性敲除EI24會導(dǎo)致小鼠電傳導(dǎo)和行為異常;在小鼠肝臟中條件性敲除EI24會導(dǎo)致嚴(yán)重肝腫大和肝細(xì)胞肥大;在小鼠胰島中條件性敲除EI24會導(dǎo)致胰島素分泌下降和血糖紊亂。此外,EI24通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡而作為腫瘤抑制因子,其低表達(dá)與乳腺癌的侵襲密切相關(guān)。有研究表明,EI24能抑制成纖維細(xì)胞分化為活化的肌成纖維細(xì)胞,減少膠原合成,增加膠原降解,從而抑制ECM蛋白在腎組織內(nèi)沉積。近來研究證實,EI24在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型及TGF-β1處理的小鼠肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào),而體內(nèi)和體外EI24的上調(diào)可通過抑制EMT過程和ECM的產(chǎn)生來減弱肺纖維化。基于這些研究推測,橙皮苷可通過上調(diào)EI24轉(zhuǎn)錄和翻譯,減少成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及ECM蛋白沉積。

近年來,免疫系統(tǒng)在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用受到廣泛關(guān)注。研究表明,Th1/Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)通過影響成纖維細(xì)胞的活化、增殖和膠原沉積參與肺纖維化發(fā)展。與既往研究一致,本研究中肺纖維化小鼠表現(xiàn)出Th2細(xì)胞占比增多、Th1/Th2細(xì)胞失衡的現(xiàn)象。而橙皮苷治療后肺纖維化小鼠肺部Th2細(xì)胞占比減少、Th1細(xì)胞占比增加,Th1/Th2細(xì)胞失衡在一定程度上得到改善。Th1/Th2平衡可通過將細(xì)胞因子IFN-γ代表Th1、IL-4代表Th2來評估。作為主要Th1細(xì)胞因子之一的IFN-γ能抑制成纖維細(xì)胞的增殖和ECM膠原蛋白的生成。在體內(nèi)給予IFN-γ可導(dǎo)致纖維化動物模型中ECM的減少。Th2細(xì)胞因子IL-4作為一種重要的促炎細(xì)胞因子,則被證實能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白,并在調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此,IL-4和IFN-γ被認(rèn)為是肺成纖維細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子。在本研究中,與假手術(shù)組相比,模型組IFN-γ水平降低,IL-4水平增加,且IFN-γ/IL-4比率明顯下降,提示Th2反應(yīng)的增強和Th1反應(yīng)的受限,進(jìn)一步證實肺纖維化中Th1/Th2免疫細(xì)胞失衡現(xiàn)象。此外,與模型組相比,橙皮苷可以提高IFN-γ的水平,并逆轉(zhuǎn)IFN-γ/IL-4的比例。因此,推測橙皮苷可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡來改善博萊霉素誘導(dǎo)的炎癥和肺纖維化。

綜上所述,橙皮苷能夠減弱博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠炎癥細(xì)胞浸潤、促炎細(xì)胞因子釋放和ECM過度沉積,其機制可能是通過調(diào)控EI24和Th1/Th2免疫細(xì)胞平衡來實現(xiàn)。因此,橙皮苷對肺纖維化具有潛在的保護(hù)作用。然而,肺纖維化發(fā)病機制復(fù)雜,仍需要進(jìn)一步的研究來闡明橙皮苷潛在的作用靶點和相關(guān)機制。