崔永建, 李 艷, 王巧梅, 唐 慶

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊 830002)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)的定義為髖部骨密度(bone mineral density,BMD)T評(píng)分為-2.5或更低[1]。OP(即“多孔骨”)會(huì)增加骨骼脆性和骨折的易感性。OP影響全球2億女性,每年導(dǎo)致890多萬例骨折。一半的絕經(jīng)后婦女在其一生中發(fā)生過至少一次OP相關(guān)骨折[2]。盡管安慰劑對(duì)照試驗(yàn)表明,雷洛昔芬可減少婦女椎體骨折,但雌激素類似物治療OP與腦血管意外和靜脈血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān),國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)治療指南因此建議不使用雌激素類似物[3]。而指南推薦的藥物包括雙膦酸鹽、地諾單抗和特立帕肽等,與安慰劑組相比,可將骨折的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)降低至0.40～0.60。然而長(zhǎng)期服用上述藥物,仍存在不確定的潛在風(fēng)險(xiǎn)[4]。隨著社會(huì)老齡化加劇,未來對(duì)更為安全有效、可長(zhǎng)期服用以治療OP預(yù)防骨折的新藥物的需求持續(xù)增加。臨床組織病理學(xué)能夠觀察到年齡相關(guān)性O(shè)P患者骨形成減少和骨髓脂肪積累增加。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化而非向成骨細(xì)胞分化,在一定程度上導(dǎo)致了OP[5]。經(jīng)典Wnt(the wingless/int1)信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成。Wnt信號(hào)通路的激活是由配體、受體和共受體的結(jié)合決定的。WNT3A等配體可與七次跨膜受體蛋白Frizzled(FZD)家族成員形成復(fù)合物,再結(jié)合單次跨膜共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6),以激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,并介導(dǎo)包括個(gè)體發(fā)育、成骨分化、骨形成等在內(nèi)的多個(gè)過程[6]。WNT3A是多種潛在的、具有改善OP骨密度的藥物的作用靶點(diǎn)。如冬凌草苷(oridonin)是一種改善免疫力、維持免疫系統(tǒng)平衡、改善組織微循環(huán)的中藥有效化合物。它可通過上調(diào)WNT3A/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)血管發(fā)生和骨組織供血,改善OVX小鼠骨密度[7]。FZD2是Frizzled(FZD)家族成員,是一種重要的Wnt信號(hào)通路受體蛋白。已報(bào)道的關(guān)于FZD2的病理生理學(xué)功能主要是激活經(jīng)典Wnt/β-Catenin信號(hào)通路,介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程。但最近研究發(fā)現(xiàn)FZD2雜合突變通過WNT經(jīng)典和非經(jīng)典信號(hào)通路兩種方式導(dǎo)致人類胚胎肢體和顱面骨骼顯性發(fā)育不良,這種遺傳病被稱為Robinow綜合征和2型顯性發(fā)育不良(OMOD2)。說明FZD2至少對(duì)于個(gè)體胚胎發(fā)育過程中的肢體發(fā)育至關(guān)重要[8]。然而FZD2的基因突變或表達(dá)下調(diào)是否參與骨質(zhì)疏松癥的致病機(jī)理,或者FZD2的表達(dá)可在治療中發(fā)揮保護(hù)功效,尚未有深入研究。在本研究中,首先通過對(duì)雌二醇(17β-Estradiol,E2)治療OVX誘導(dǎo)的OP小鼠模型后,其后肢脛骨中Wnt信號(hào)通路相關(guān)配體和受體表達(dá)水平的測(cè)定,探討配體WNT3A通過穩(wěn)定和激活FZD2增加成骨細(xì)胞骨形成的活性和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料:24只雌性6～8周齡C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量23±2g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司(中國(guó))。腺病毒pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP載體購(gòu)自上海和元生物(中國(guó)),腺病毒顆粒包裝也委托其代為完成。shRNA-FZD2和shRNA-NT由上海生工生物(中國(guó))設(shè)計(jì)和合成。一抗:抗WNT3A多抗(貨號(hào)PA5-87468)、抗FZD2多抗(貨號(hào)38-4700)、抗Active-β-Catenin和β-Catenin多抗(貨號(hào)71-2700)、抗ALP多抗(貨號(hào)PA5-106391)、抗Runx2多抗(貨號(hào)PA5-82787)、抗磷酸化(phospho-,p-)STAT3單抗(貨號(hào)12-9033-42)、抗STAT3多抗(貨號(hào)PA5-84386)、抗p-JAK2 (Tyr119)多抗(貨號(hào)PA5-105889)、抗JAK2多抗(貨號(hào)44-406G)、抗泛素(ubiquitin,Ub)多抗(貨號(hào)PA3-16717)和抗β-actin多抗(貨號(hào)PA5-78715)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific(美國(guó))。山羊抗兔IgG二抗(貨號(hào)XY0650)購(gòu)自上海信裕生物(中國(guó))。Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖能力測(cè)定試劑盒(貨號(hào)KTC011001)湖北艾美捷生物科技有限公司(中國(guó))。

1.2方 法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)于22±3℃恒溫、45%～65%恒濕、配備12h/12h光照/黑暗循環(huán)的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。小鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料,可以自由取食和飲水。每6只小鼠一個(gè)鼠籠。對(duì)小鼠實(shí)施OVX誘導(dǎo)OP之前,先適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2雙側(cè)卵巢摘除術(shù)(OVX)誘導(dǎo)建立OP小鼠模型:小鼠手術(shù)前禁食12h。手術(shù)開始前對(duì)小鼠施以2%異氟烷麻醉。向小鼠皮下注射克林霉素(45μg/g體重)預(yù)防手術(shù)感染。將小鼠俯臥位置于37℃恒溫加熱墊上并固定,剔除背部毛發(fā)并消毒皮膚。用無菌手術(shù)刀在小鼠背部肋弓向下1cm的脊柱側(cè)面1cm處切開一個(gè)切口,暴露腹腔。撥開性腺周圍脂肪組織,找到卵巢,然后結(jié)扎雙側(cè)卵巢周圍的血管并摘除雙側(cè)卵巢。逐層縫合傷口。假手術(shù)(Sham)組僅實(shí)施背部脊柱側(cè)面切口和縫合。小鼠手術(shù)后連續(xù)3d向其飲用水中添加曲馬多(25mg/L)進(jìn)行鎮(zhèn)痛。手術(shù)后監(jiān)測(cè)小鼠死亡和恢復(fù)情況,并繼續(xù)飼養(yǎng)7周誘導(dǎo)OP。

1.2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和處理方式:24只小鼠隨機(jī)分為4組,每組6只。對(duì)照(Control)組,對(duì)小鼠不做任何處理。假手術(shù)(Sham)組,僅對(duì)小鼠實(shí)施背部脊柱側(cè)面切口和縫合。OVX組,對(duì)小鼠實(shí)施OVX并連續(xù)飼養(yǎng)7周誘導(dǎo)建立OP小鼠模型。OVX+E2 Treatment組,誘導(dǎo)建立OP小鼠模型后,腹腔注射給予小鼠雌二醇(E2)(10μg kg/day),連續(xù)治療6周。結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.4Western blot:處死小鼠,立即解剖獲取小鼠左、右后肢脛骨,剔除肌肉和結(jié)締組織,將脛骨浸沒于EDTA溶液中,在4℃冷室中脫鈣處理滿2周。加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,在液氮中研磨制備骨組織勻漿。在完成SDS-PAGE凝膠電泳和半干電轉(zhuǎn)印后,使用5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉,室溫1h。向膜上滴加一抗工作液,4℃孵育過夜。次日,向膜上滴加二抗工作液,室溫孵育1h?？贵w工作液稀釋度如下:抗WNT3A一抗(稀釋度1∶1500)、FZD2一抗(稀釋度1∶1000)、Active-β-Catenin和β-Catenin一抗(稀釋度1∶1500)、ALP一抗(稀釋度1∶2000)、Runx2一抗(稀釋度1∶1500)、p-STAT3(稀釋度1∶1000)、STAT3(稀釋度1∶1500)、p-JAK2(稀釋度1∶1000)、JAK2(稀釋度1∶1500)和β-actin一抗(稀釋度1∶2000);山羊抗兔IgG二抗(稀釋度1∶8000)。使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液顯影目的條帶。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng):MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃恒溫、濕潤(rùn)、通入5% CO2的細(xì)胞孵育箱中維持培養(yǎng)。

1.2.6免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation,co-IP):向處于指數(shù)生長(zhǎng)期的MC3T3-E1細(xì)胞中加入WNT3A(5nmoL/L)處理6h,然后進(jìn)行co-IP測(cè)定。使用冰預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次,然后加入免疫沉淀裂解緩沖液(20 mM Tris-HCl pH7.5,150 mM NaCl,1mM EDTA,10μM/mL 100×Halt蛋白酶,磷酸酶抑制劑混合物)裂解細(xì)胞。4℃,10,000 ×g離心5min,取上清液。加入偶聯(lián)有抗IgG抗體(1μg)或抗泛素(ubiquitin,Ub)抗體(1μg)的Protein A-Sepharose至全細(xì)胞裂解物上清液中,置于4℃下緩慢攪拌孵育過夜。次日,向Protein A-Sepharose-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀中加入3×SDS樣品緩沖液,在37℃下孵育5min解離蛋白質(zhì)。然后使用抗FZD2抗體(稀釋度1∶1000)或抗Ub抗體(稀釋度1∶2000)或抗β-actin抗體(稀釋度1∶1500)進(jìn)行免疫印跡(Immuno blot,IB)檢測(cè)。

1.2.7構(gòu)建腺病毒-shRNA-FZD2載體和轉(zhuǎn)染:使用腺病毒pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP載體構(gòu)建腺病毒-shRNA-FZD2載體或其對(duì)照組腺病毒-shRNA-NT載體。shRNA-FZD2:5’-CCTCATGAACAAGTTCGGTTT-3’,shRNA-NT:5’-CCGGCTCACTGGTCTCCACTC-3’。委托上海和元生物代為進(jìn)行腺病毒顆粒包裝。種2.5×105細(xì)胞于6孔板中,待其貼壁培養(yǎng)過夜。次日,向MC3T3-E1細(xì)胞中加入WNT3A(5nmoL/L)處理6h后,更換細(xì)胞培養(yǎng)液為含6μg/mL polybrene和腺病毒顆粒(1×109PFU /mL,10μL)(腺病毒-shRNA-FZD2或腺病毒-shRNA-NT)的新鮮培養(yǎng)液,處理細(xì)胞4h。再次更換回新鮮的含10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液,連續(xù)培養(yǎng)48h后采用Western blot法測(cè)定其對(duì)FZD2的敲低效率。

1.2.8Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖能力測(cè)定:使用CCK-8細(xì)胞增殖能力測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。具體實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書中的指導(dǎo)進(jìn)行即可。

2 結(jié) 果

2.1E2治療的OVX小鼠脛骨組織中WNT3A和FZD2水平均上調(diào):如(圖1A)所示,與Sham組相比,OVX組小鼠脛骨組織中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2表達(dá)水平均被下調(diào)(P<0.05);與OVX組相比,OVX+E2 Treatment組小鼠脛骨組織中上述蛋白因子的表達(dá)水平均被上調(diào)(P<0.05)。Sham組與Control組相比,小鼠脛骨組織中上述蛋白因子的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖1 小鼠脛骨組織中成骨分化相關(guān)蛋白因子表達(dá)水平測(cè)定

2.2WNT3A處理增加MC3T3-E1細(xì)胞中FZD2的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化:如(圖2A)所示,與Control組相比,WNT3A Treatment組MC3T3-E1細(xì)胞中FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表達(dá)水平均升高(P<0.05)。如(圖2B)所示,與Control組相比,WNT3A Treatment組MC3T3-E1細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)。

圖2 WNT3A處理后MC3T3-E1細(xì)胞中成骨分化相關(guān)蛋白因子表達(dá)水平測(cè)定。

2.3WNT3A處理增加MC3T3-E1細(xì)胞中FZD2的穩(wěn)定性:如(圖3A-左圖和右圖)所示,在Input對(duì)照組中,WNT3A處理(-/+)的MC3T3-E1細(xì)胞中FZD2和Ub的表達(dá),IB檢測(cè)均為陽性;且與WNT3A處理(-)的細(xì)胞相比,WNT3A處理(+)的細(xì)胞中FZD2的表達(dá)水平升高(P<0.05)。如(圖3A-中圖和右圖)所示,在WNT3A處理(-)的IP:IgG對(duì)照組中FZD2和Ub的表達(dá),IB檢測(cè)均為陰性;在IP:Ub組中,與WNT3A處理(-)的細(xì)胞相比,WNT3A處理(+)的細(xì)胞中FZD2的表達(dá)水平升高(P<0.05)。

圖3 對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞給予WNT3A處理(-/+)后,免疫共沉淀檢測(cè)FZD2和Ub的直接相互作用。

2.4敲低-FZD2抑制WNT3A處理引起的MC3T3-E1細(xì)胞向骨合成代謝方向分化:如(圖4A)所示,與WNT3A Treatment組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組FZD2、Active-β-Catenin、β-Catenin、ALP和Runx2的表達(dá)水平均降低(P<0.05)。與WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-NT組上述蛋白因子表達(dá)水平均升高(P<0.05)。

圖4 敲低FZD2后WNT3A處理的MC3T3-E1細(xì)胞中成骨分化相關(guān)蛋白因子表達(dá)水平測(cè)定。

2.5敲低-FZD2抑制WNT3A處理引起的MC3T3-E1細(xì)胞的增殖:如(圖5A)所示,與WNT3A Treatment組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組p-STAT3和p-JAK2的磷酸化水平均降低(P<0.05);而2組細(xì)胞中STAT3和JAK2的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-NT組上述蛋白因子的磷酸化水平均升高(P<0.05);而2組細(xì)胞中STAT3和JAK2的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。如(圖5B)所示,與WNT3A Treatment組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05);與WNT3A Treatment+Adv-shRNA-FZD2組相比,WNT3A Treatment+Adv-shRNA-NT組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P<0.05)。

圖5 敲低FZD2后WNT3A處理的MC3T3-E1細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)和增殖能力測(cè)定。

3 討 論

對(duì)于OP的治療,目的是維持正常的骨量,其途徑包括抑制骨吸收或促進(jìn)骨合成代謝。目前,抑制骨吸收的藥物種類較多,而促進(jìn)骨合成代謝的藥物較少,后者還有很多藥物開發(fā)的策略有待深入探索。Wnt信號(hào)在決定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞命運(yùn)、增殖和分化中是必不可少的。Wnt信號(hào)包括經(jīng)典的β-catenin依賴性信號(hào)(Wnt/β-catenin)和β-catenin非依賴性信號(hào)。其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路是通過配體與一個(gè)7次跨膜卷曲蛋白(Frizzleds,FZDs)受體以及輔助受體LRP5/6結(jié)合,以阻止β-catenin的磷酸化和降解,從而激活β-catenin信號(hào)。未磷酸化并被激活的β-catenin將轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中,決定MSCs的分化命運(yùn)。許多證據(jù)表明,Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有促成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化和抗脂肪細(xì)胞分化的作用。Wnt/β-catenin信號(hào)在維持骨量中起著關(guān)鍵作用。如Wnt/β-catenin信號(hào)通過激活成骨分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2(runt-related transcription factor 2)/osterix(Sp7)促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化。與此同時(shí),Wnt/β-catenin/Runx2也是抑制MSCs向脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號(hào)。MSCs中Runx2表達(dá)缺失會(huì)引起PPARγ的表達(dá)上調(diào)并介導(dǎo)MSCs轉(zhuǎn)為向脂肪細(xì)胞分化。出生后Runx2表達(dá)缺失將導(dǎo)致小鼠骨量降低和骨組織中脂肪細(xì)胞積累[9]。

WNT3A屬于Wnt/β-catenin信號(hào)通路配體,促進(jìn)骨形成。局部給予WNT3A治療可恢復(fù)骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)后大段骨缺損的骨再生。在絕經(jīng)后OP小鼠模型中WNT3A參與改善骨重塑增強(qiáng)小鼠骨骼的機(jī)械負(fù)荷和血管生成[10]。說明WNT3A作為促進(jìn)骨形成的配體,在改善骨密度方面具有顯著效果。在本次研究結(jié)果中也顯示,與Sham組相比,OVX小鼠模型(OVX組)WNT3A表達(dá)下調(diào);而與OVX組相比,陽性治療組(OVX+E2 Treatment組)中WNT3A表達(dá)被明顯上調(diào)。FZDs是7次跨膜細(xì)胞表面受體,歸屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族,并且與其他類別G蛋白偶聯(lián)。FZDs被Wnt家族配體激活后,介導(dǎo)調(diào)控胚胎發(fā)育、干細(xì)胞分化、器官發(fā)生和模式形成等重要生理學(xué)過程[11]。并在維持成人機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)、再生、可塑性和修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[8]。哺乳動(dòng)物具有10種FZDs,FZD2是其中一員。FZD2對(duì)于胚胎的肢體發(fā)育至關(guān)重要,FZD2基因雜合型點(diǎn)突變就可以顯性方式致胚胎肢體和顱面骨骼發(fā)育缺陷[8]。之前未有報(bào)道在OP中FZD2的表達(dá)情況。而在本次研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,OVX小鼠模型(OVX組)FZD2的表達(dá)水平被抑制;而與OVX組相比,陽性治療組(OVX+E2 Treatment組)中FZD2的表達(dá)水平被明顯增強(qiáng)。雖然這一結(jié)果尚未在OP患者低骨密度的骨骼中進(jìn)行驗(yàn)證,但在OVX小鼠模型水平上發(fā)現(xiàn)了WNT3A和FZD2的這一特殊的表達(dá)模式。

ALP(Alkaline phosphatase,堿性磷酸酶)在礦化組織細(xì)胞中高度表達(dá),在硬組織的形成中起著至關(guān)重要的作用。ALP增加無機(jī)磷酸鹽在局部的沉積,促進(jìn)礦化,并降低細(xì)胞外焦磷酸鹽(骨骼礦化抑制劑)。骨骼礦化是羥基磷灰石晶體從增生性成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的外膜萌發(fā),在基質(zhì)囊泡內(nèi)產(chǎn)生,并在膠原原纖維之間積聚,參與形成骨骼細(xì)胞外基質(zhì)。

在本研究結(jié)果中顯示,與OVX組相比,OVX+E2 Treatment組小鼠脛骨組織中WNT3A、FZD2、Active-β-Catenin、Runx2和ALP表達(dá)水平均上調(diào)。說明WNT3A和FZD2參與了E2促進(jìn)OP骨合成代謝的分子機(jī)制。更為重要的是,在本研究中發(fā)現(xiàn)配體WNT3A與FZD2結(jié)合并上調(diào)FZD2的水平可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和向骨合成代謝方向分化,上調(diào)Runx2和ALP。隨后對(duì)這一過程的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),WNT3A處理可穩(wěn)定細(xì)胞中FZD2免于進(jìn)入泛素化降解途徑?？梢钥闯鯳NT3A具有促進(jìn)骨合成代謝的重要活性。但是在這些過程中,與此配體作用的關(guān)鍵受體仍未確定。在本研究中發(fā)現(xiàn)敲低FZD2抑制WNT3A處理引起的MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和促骨合成代謝活性。這是一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn),由此可知介導(dǎo)配體WNT3A的促成骨分化活性和促骨合成代謝活性的重要細(xì)胞表面受體為FZD2。STAT3/JAK2信號(hào)是細(xì)胞重要的促存活、促增殖信號(hào)。敲低-FZD2抑制了WNT3A處理引起的MC3T3-E1細(xì)胞的增殖能力,以及p-STAT3和p-JAK2的磷酸化水平。這也進(jìn)一步佐證了配體WNT3A是與FZD2結(jié)合后介導(dǎo)發(fā)揮其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和骨形成活性的。

總之,在本研究中雖然尚未深入探討單純過表達(dá)FZD2是否能夠起到促進(jìn)骨合成代謝的功效。但基于本研究目前的結(jié)果可知,WNT3A的促骨合成代謝活性是通過結(jié)合并穩(wěn)定FZD2激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。