李艷萌 徐德龍 夏向峰 吳西彩★ 李園園 律潔

結(jié)腸癌是臨床常見的消化道腫瘤，在近些年來的流行病學(xué)統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率與死亡率居高不下，給患者自身身心健康及家庭和社會帶來極大負(fù)擔(dān)。在結(jié)腸癌的發(fā)生與進(jìn)展過程中，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后［1］。上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）指的是在機(jī)體中由于生理與病理狀態(tài)改變，使得上皮細(xì)胞通過多種復(fù)雜的特殊事件向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在這個過程中喪失極性并使得上皮細(xì)胞粘附，同時獲得轉(zhuǎn)移能力，引起癌細(xì)胞的遷移與侵襲［2］。近年來，國內(nèi)外大量研究表明EMT 在多種惡性腫瘤慢性炎癥引起的侵襲、遷移過程中發(fā)生，包括乳腺癌、胃癌、肝癌及非小細(xì)胞肺癌等［3］。腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）是腫瘤微環(huán)境中的主要炎癥介質(zhì)，通過誘導(dǎo)多種趨化因子建立復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)來誘導(dǎo)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移［4］。最近的報道顯示CXC 趨化因子配體10/CXC 趨化因子受體3（CXC chemokine ligand-10，CXCL10/CXCchemokine receptor3，CXCR3）信號通路與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)［5］。但目前關(guān)于TNF-α 否能通過調(diào)控趨化因子表達(dá)而影響EMT 介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用尚不清楚。因此本研究將探討TNF-α 是否能夠通過調(diào)控SW480 細(xì)胞中CXCL10/CXCR3信號通路的表達(dá)從而影響EMT 的發(fā)生，最終引起細(xì)胞的遷移發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

SW480 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；PCR 引物由上海生工公司合成；TRIzol Reagent 總RNA提取試劑盒、CXCL10、CXCR3、Vimentin、Fibronectin及E-cad抗體及二抗購自美國Abcam 公司；β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；重組人TNF-α 購自北京義翹神州公司；siRNA-CXCR3 購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國賽默飛有限公司（Thermoforma 3111）；全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)購自美國伯樂公司（ChemiDoc）；Real-time PCR 儀購自美國伯樂公司（CFX Connect）；熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社（U-HGLGPS）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將SW480 原代細(xì)胞株細(xì)胞置于加入了雙抗及10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時使用重組人TNF-α 刺激細(xì)胞及使用siRNA-CXCR3 轉(zhuǎn)染沉默處理細(xì)胞。其中正常培養(yǎng)的細(xì)胞為NC 組，使用TNF-α 刺激的細(xì)胞為TNF-α 組，使用TNF-α 刺激及siRNA-CXCR3 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為TNF-α+si-CXCR3 組。

1.3.2 實時熒光定量試驗（Real-time PCR）檢測各項指標(biāo)的mRNA 水平

收集細(xì)胞，通過Trizol 試劑盒制備總RNA 的并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后加入SYBR Green 染料及CXCL10、CXCR3、Vimentin、Fibronectin、E-cad與β-actin上下游引物混合離心，引物序列見表1，隨后于PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值（Ct 值）運用2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對定量分析。

表1 各組基因上下游引物序列Table 1 Primers sequence of upstream and downstream genes

1.3.3 免疫印跡試驗（Western Blot）檢測各項指標(biāo)的蛋白水平

收集細(xì)胞懸液提取總蛋白。以Western Blot法分別通過電泳、轉(zhuǎn)膜等操作后進(jìn)行相關(guān)抗體孵育，包括CXCL10、CXCR3、Vimentin、Fibronectin、E-cad與β-actin等抗體的孵育，孵育完成洗膜后進(jìn)行二抗孵育，通過顯影儀拍照，將結(jié)果用ImageJ 軟件分析。

1.3.4 免疫組化檢測SW480 中E-cad 與Vimentin的變化情況

收集細(xì)胞懸液，離心后沖洗，固定細(xì)胞，封閉1 h。同時分別加入E-cad與Vimentin抗體（1∶200，CST）在4℃下培養(yǎng)SW480 細(xì)胞過夜，取出后沖洗2次，熒光二抗（1∶1 200，CST）繼續(xù)培養(yǎng)2 h，染色結(jié)束后在熒光倒置顯微鏡下檢測熒光強度表達(dá)。

1.3.5 劃痕實驗

將正常SW480 細(xì)胞及分別使用TNF-α 刺激與si-CXCR3 轉(zhuǎn)染處理的SW480 細(xì)胞接種在6 孔板中培養(yǎng)，待過夜后在每組中間劃3 道豎線，清洗2～3 次，去除劃下的細(xì)胞，更換新鮮無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移率。

1.3.6 侵襲實驗

將Transwell 小室的上室中加入無血清的DMEM 培養(yǎng)基并培養(yǎng)1 h 使膜層親水，隨后棄去培養(yǎng)基，上室加入細(xì)胞下室加入培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中放置過夜。次日分別對下室細(xì)胞進(jìn)行固定與染色，室溫放置5 min 后顯微鏡下觀察各組細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計量資料以（）表示，兩組間采用t檢驗，多組之間比較采用方差分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測相關(guān)mRNA 水平

TNF-ɑ 組 細(xì)胞中通 路基因CXCL10、CXCR3的mRNA 水平高于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t1=3.174，t2=11.253，P＜0.05）；TNF-α+si-CXCR3 組細(xì)胞中CXCR3水平低于TNF-α 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.528，P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中CXCL10 與CXCR3 的mRNA 水平Figure 1 The mRNA levels of CXCL10 and CXCR3 in each group

2.2 Western Blot 檢測相關(guān)蛋白水平

Western Blot 結(jié)果所示，TNF-ɑ 組細(xì)胞 中CXCL10（t=4.157）、CXCR3（t=5.380）、Vimentin（t=4.414）與Fibronectin（t=9.625）的蛋白表達(dá)量高于NC 組，E-cad 的蛋白表達(dá)量低于NC 組（t=3.677），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TNF-α+si-CXCR3組細(xì)胞CXCR3（t=12.571）、Vimentin（t=8.018）與Fibronectin（t=7.906）的蛋白表達(dá)量低于TNF-ɑ 組，E-cad（t=3.152）的蛋白水平高于TNF-ɑ 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞中CXCL10、CXCR3、Vimentin、Fibronectin及E-cad 的蛋白水平Figure 2 The protein levels of CXCL10，CXCR3，Vimentin，F(xiàn)ibronectin and E-cad in each group

2.3 免疫熒光檢測SW480中E-cad與Vimentin水平

免疫熒光結(jié)果顯示，TNF-ɑ 組中Vimentin的表達(dá)量高于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.152，P＜0.05），E-cad的表達(dá)量低于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.619，P＜0.05）；TNF-α+si-CXCR3 組中Vimentin的表達(dá)量低于TNF-ɑ 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.105，P＜0.05），E-cad的表達(dá)量高于TNF-ɑ 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.447，P＜0.05）。見圖3。

圖3 免疫熒光檢測各組細(xì)胞中E-cad 與Vimentin 水平（DAPI，200×）Figure 3 The levels of E-cad and Vimentin in each group were detected by immunofluorescence（DAPI，200×）

2.4 劃痕實驗與TransWell 實驗檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力

TNF-ɑ 組細(xì)胞的遷移數(shù)量高于NC 組，其遷移能力顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.690，P＜0.05），TNF-α+si-CXCR3 組細(xì)胞遷移數(shù)量低于TNF-ɑ 組，其遷移能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.560，P＜0.05），見表2 與圖4。TNF-ɑ 組細(xì)胞的侵襲能力高于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.143，P＜0.05），TNF-α+si-CXCR3 組細(xì)胞侵襲能力低于TNF-ɑ 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.717，P＜0.05）。見表2、圖5。

圖4 劃痕實驗檢測各組細(xì)胞遷移水平（10×）Figure 4 The cell migration level of each group was detected by Wound healing assay（10×）

圖5 TransWell 實驗檢測各組細(xì)胞侵襲水平（結(jié)晶紫，200×）Figure 5 The cell invasion level of each group was detected by Transwell assay（crystal violet，200×）

表2 干預(yù)后SW480 侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較Table 2 Comparison of SW480 invasion and migration cells after intervention

3 討論

在我國，結(jié)腸癌是發(fā)病人群數(shù)量僅次于肺癌和乳腺癌的惡性腫瘤，在全世界其死亡率處于前三，是需要特殊關(guān)注的嚴(yán)重公共衛(wèi)生疾病。多項研究表明，結(jié)腸癌患者的預(yù)后不良的主要因素是癌細(xì)胞遷移與局部復(fù)發(fā)，特別是進(jìn)展期腫瘤的轉(zhuǎn)移，使得結(jié)腸癌的治療難以取得突破［6］。在之前的研究中，腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生因素主要包括生長因子、血管生成因子、細(xì)胞粘附機(jī)制異常、細(xì)胞運動機(jī)制異常、細(xì)胞降解機(jī)制異常以及細(xì)胞凋亡異常等［7］，隨著研究的不斷深入，EMT 也逐漸被視為腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要因素［8］。研究報道稱，當(dāng)接收外來刺激或機(jī)體自身病理狀態(tài)改變的條件下，上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后會喪失極性，細(xì)胞之間粘附性減弱，失去上皮指標(biāo)如鈣粘蛋白E-cad，向著間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，間質(zhì)標(biāo)志指標(biāo)如纖維連接蛋白Fibronectin與波形蛋白Vimentin表達(dá)上調(diào)［9］，其遷移力和侵襲力得到增強，具有了細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的潛能。但是關(guān)于EMT 與腫瘤轉(zhuǎn)移特別是與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移間的分子機(jī)制尚不明確。

在腫瘤微環(huán)境中，趨化因子與相應(yīng)受體組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)可通過對免疫監(jiān)視的破壞和逃逸促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但值得注意的是，這種對腫瘤轉(zhuǎn)移能力的促進(jìn)作用的獲得和維持需要來自腫瘤微環(huán)境的持續(xù)刺激信號，其中生長因子和炎癥因子是的主要原因，炎癥介質(zhì)如TGF-β 和IL-6 已被報道有助于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［10］。TNF-α 是腫瘤相關(guān)炎癥的關(guān)鍵介導(dǎo)因子，可引起多種趨化因子的產(chǎn)生，研究表明長期慢性低劑量的TNF-α 刺激能夠?qū)е履[瘤患者預(yù)后不良及發(fā)生激素耐受，且已被證明可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生EMT［11］。在本研究結(jié)果提示TNF-α 刺激能夠誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞發(fā)生EMT 與提高其遷移與侵襲能力。

CXCL10與CXCL3屬于CXC 類趨化因子。趨化因子是細(xì)胞因子家族中的分泌型小分子蛋白質(zhì)，具有化學(xué)趨化作用。在與其受體結(jié)合后，使靶細(xì)胞趨化性遷移和細(xì)胞骨架的重排的同時，還能增強靶細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力［12］，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到控制腫瘤細(xì)胞運動、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的血管生成、刺激腫瘤細(xì)胞增殖、控制白細(xì)胞浸潤至腫瘤、激活宿主對腫瘤的特異性免疫應(yīng)答等作用。CXCL10是由免疫細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，能夠通過旁分泌和自分泌信號與其唯一配體CXCR3相互作用，介導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化、分化和激活［13］。另一方面，CXCL10已被證明通過自分泌通路刺激腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。CXCR3是一個包含7 個跨膜結(jié)構(gòu)域的GTP-蛋白偶連的跨膜受體，通過與配體特異性結(jié)合，可產(chǎn)生次級信號并激活多個下游通路，隨后介導(dǎo)腫瘤的形成，以及腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移［14］。臨床資料顯示，CXCR3在卵巢癌、肝癌及結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)增加［15］。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 刺激能夠誘導(dǎo)SW480 細(xì)胞發(fā)生EMT 與提高其遷移與侵襲能力，其機(jī)制可能與上調(diào)CXCR10/CXCL3信號通路有關(guān)，本研究為結(jié)腸癌的治療提供了一個新的思路。