李瑩瑩 姚曉利 鄭瑞利 何坤

病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是由流感病毒、柯薩奇病毒及腺病毒等病毒感染引起心肌組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞代謝功能異常，進(jìn)而引起心律失常、心源性休克及心力衰竭等嚴(yán)重后果［1］。目前臨床上對于VMC 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為心肌活檢，但心肌活檢存在技術(shù)難度高、創(chuàng)傷大等問題，不能在臨床上廣泛應(yīng)用，而心肌生物標(biāo)記物檢測則因為操作方便而備受臨床關(guān)注［2］。微小RNA-31（microRNA-31，miR-31）是一種非編碼鏈RNA 分子，通過與靶基因mRNA 結(jié)合，能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化與凋亡，且在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等進(jìn)程中具有重要作用［3］。白細(xì)胞介素-22（Interleukin-22，IL-22）是由免疫細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、維持穩(wěn)態(tài)、免疫反應(yīng)及組織修復(fù)等，在心肌炎、動脈粥樣硬化及心肌梗死等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用［4］。本研究通過分析血清miR-31、IL-22 聯(lián)合檢測在兒童VMC 診斷及預(yù)后評估中的價值，為臨床診治提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至2022 年1 月河南省兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的106 例VMC 患兒，將其命名為VMC 組，平均年齡（6.34±1.46）歲；男性59 例，女性47 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合病毒性心肌炎的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②年齡≤14 歲；③臨床資料基本完整。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并存在先天性心臟病或其它類型心肌炎者；②合并存在遺傳代謝性疾病者；③合并存在嚴(yán)重感染性疾病者；④近期存在心臟疾病手術(shù)史者；⑤近期存在使用免疫抑制劑、干擾素及血液制品治療者。另選70 名同期在本院體檢的健康兒童作為對照組，平均年齡（6.68±1.54）歲；男性40 例，女性30 例。本研究已獲取醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有參加研究兒童的監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 心電圖與超聲心動圖檢測

采用多導(dǎo)聯(lián)心電分析系統(tǒng)對兩組進(jìn)行心電圖檢測，記錄心室除極時間，即QRS 間期；記錄P 波終點至QRS 波群起點的時間間隔，即PR 間期。

采用彩色多普勒超聲診斷儀對兩組進(jìn)行超聲心動圖檢測，參數(shù)設(shè)置：頻率4 MHz，幀頻60/s。記錄左室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction，LVEF）與左心室短軸縮短率（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.3 血清指標(biāo)檢測

于清晨下采集兩組的靜脈血5 mL，在5 000 r/min（4℃，半徑10 cm）下進(jìn)行離心15 min 后，將上層血清置入-80℃冰箱保存待檢。①miR-31 檢測：以熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測血清miR-31 的表達(dá)水平。以Trizo 試劑盒（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）提取血清的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海滬震生物科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，相關(guān)反應(yīng)條件如下：90℃變性30 s；60℃退火40 s；70℃延伸60 s，共30 個循環(huán)。引物序列如下：F：5′-CAGGCACGCTGCGGACAGCCA-3′；R：5′-TGGTGCAGTGCAGCCGAGGT-3′。根據(jù)2-ΔΔCt法計算miR-31 的相對表達(dá)量。②IL-22 與肌酸激酶同工酶檢測：以酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-22與肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme，CK-MB）水平，按照試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）說明書進(jìn)行檢測操作；③心肌肌鈣蛋白Ⅰ檢測：以免疫化學(xué)發(fā)光法檢測血清心肌肌鈣蛋白T（Cardiac troponin T，cTnT）水平，按照試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）說明書進(jìn)行檢測操作。

1.4 調(diào)查方法

在治療結(jié)束后以門診定期復(fù)查或電話聯(lián)系等方法對VMC 患兒進(jìn)行隨訪，每3 個月隨訪1 次，時長為1 年。以隨訪期間發(fā)生恢復(fù)遷延、擴(kuò)張性心肌病、遺留心律失常及患兒死亡等事件為預(yù)后不良，隨訪截止時間為2023 年1 月或患兒出現(xiàn)死亡，結(jié)果顯示，預(yù)后良好的患兒為78 例，預(yù)后不良的患兒為28 例。收集可能對VMC 患兒預(yù)后存在影響的因素，包括年齡、性別、血清miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT 水平及QRS 間期、PR 間期、LVEF 與LVFS 等相關(guān)信息。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

以SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用多因素Logistic 回歸分析影響因素；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒診斷及預(yù)后不良評估的價值，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清指標(biāo)與心電圖、超聲心動圖參數(shù)比較

VMC 組的血清miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT水平及QRS 間期、PR 間期均高于對照組，LVEF、LVFS 均低于對照組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清指標(biāo)與心電圖、超聲心動圖參數(shù)比較（）Table 1 Comparison of serum indexes，electrocardiogram and echocardiogram parameters between the two groups（）

表1 兩組血清指標(biāo)與心電圖、超聲心動圖參數(shù)比較（）Table 1 Comparison of serum indexes，electrocardiogram and echocardiogram parameters between the two groups（）

2.2 血清miR-31、IL-22 對VMC 診斷的預(yù)測價值

ROC 曲線顯示，血清miR-31、IL-22 水平二者聯(lián)合檢測對VMC 診斷高于單一檢測（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 血清miR-31、IL-22水平對VMC診斷的ROC曲線分析Figure 1 ROC curve analysis of serum miR-31 and IL-22 levels for VMC diagnosis

表2 血清miR-31、IL-22 對VMC 診斷的預(yù)測價值Table 2 Predictive value of serum miR-31 and IL-22 in diagnosis of VMC

2.3 VMC 患兒預(yù)后單因素分析

對影響VMC 患兒預(yù)后不良的因素進(jìn)行分析，miR-31、IL-22、CK-MB、cTnT、QRS 間期、PR 間期、LVEF 及LVFS 均是VMC 患兒預(yù)后不良的影響因素，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 VMC 患兒預(yù)后單因素分析［n（%），（）］Table 3 Univariate analysis of prognosis in children with VMC［n（%），（）］

表3 VMC 患兒預(yù)后單因素分析［n（%），（）］Table 3 Univariate analysis of prognosis in children with VMC［n（%），（）］

2.4 VMC患兒預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析

以VMC 患兒是否出現(xiàn)預(yù)后不良為因變量，將收集的基本資料為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析。結(jié)果顯示，miR-31 水平高表達(dá)、IL-22 水平升高、CK-MB 水平升高、cTnT 水平升高、QRS 間期延長、PR 間 期延長、LVEF降低及LVFS 降低均 是VMC 患兒預(yù)后不良的獨立危險因素。見表4。

表4 VMC 患兒預(yù)后不良的多因素Logistic 回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of poor prognosis in children with VMC

2.5 血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒預(yù)后不良的預(yù)測價值

ROC 曲線顯示，血清miR-31、IL-22 水平聯(lián)合的預(yù)測價值高于單一檢測（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒預(yù)后不良的ROC 曲線分析Figure 2 ROC curve analysis of serum miR-31 and IL-22 levels on poor prognosis in children with VMC

表5 血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒預(yù)后不良的預(yù)測價值Table 5 Predictive value of serum miR-31 and IL-22 levels for poor prognosis in children with VMC

3 討論

VMC 具有多種表現(xiàn)形式，在急性期病毒被清除后，患者僅表現(xiàn)為疲勞和呼吸短促等非特異性癥狀，但病毒感染持續(xù)存在可能會引起自身免疫介導(dǎo)的持續(xù)性炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重的情況下會發(fā)生暴發(fā)性心肌炎，導(dǎo)致病情迅速進(jìn)展，具有較高的死亡率［6］。宋微等［7］研究認(rèn)為，VMC 與病毒直接損傷心肌組織、機(jī)體自身的免疫反應(yīng)、遺傳因素和氧化應(yīng)激反應(yīng)作用等因素相關(guān)，機(jī)體在受到病毒感染后，能夠激活炎癥信號通路清除病毒，但同時會促進(jìn)大量炎癥因子分泌，放大炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成心肌組織損害。Xia K 等［8］研究指出，VMC 在兒童的發(fā)病率呈上升趨勢，心肌細(xì)胞的慢性炎癥可引起心肌細(xì)胞生長抑制、肥大、凋亡和心肌纖維化，從而引起擴(kuò)張性心肌病和心力衰竭，如果診斷和治療不及時，會嚴(yán)重影響VMC 患兒的預(yù)后。因此，尋找有效的VMC 診斷標(biāo)志物

對患兒的臨床治療和預(yù)后具有積極意義。microRNA 是一種長約20～25 個核苷酸的單鏈RNA 分子，能夠調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)參與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡與炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)宿主免疫機(jī)制以及影響病毒感染的過程等多種方式影響VMC 的進(jìn)展，在VMC 生理病理的發(fā)展過程中具有重要作用［9］。miR-31 是microRNA 家族成員，Climent M 等［10］研究表明，miR-31 參與調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使心肌細(xì)胞凋亡。陳策等［11］研究指出，miR-31 能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與VMC 的發(fā)病機(jī)制，其表達(dá)水平與VMC 的病情密切相關(guān)，而且miR-31 通過參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，影響調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分泌，進(jìn)而影響VMC 的病理過程。本研究結(jié)果提示miR-31可以作為診斷VMC 的指標(biāo)。IL-22 是一種重要的促炎介質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、抗微生物感染以及促進(jìn)組織修復(fù)等多種作用，與心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)相關(guān)［12］。吉思等［13］研究表明，IL-22 與心臟炎癥和心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，進(jìn)而參與VMC 的發(fā)生發(fā)展過程。王芳娟等［14］研究指出，VMC 的發(fā)生與病毒引起的免疫反應(yīng)異常都和心肌細(xì)胞損傷相關(guān)，而IL-22 參與病毒對機(jī)體VMC 的直接損傷，導(dǎo)致病情的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果提示IL-22 可以作為診斷VMC 的指標(biāo)。

本研究采用多因素Logistic 回歸分析了對VMC 患兒預(yù)后不良的相關(guān)影響因素，結(jié)果顯示，miR-31 水平高表達(dá)、IL-22 水平升高、CK-MB 水平升高、cTnT 水平升高、QRS 間期延長、PR 間期延長、LVEF 降低及LVFS 降低均是VMC 患兒預(yù)后不良的獨立危險因素，了解相關(guān)危險因素對減少VMC 患兒預(yù)后不良情況發(fā)生具有積極意義。毛柳青等［15］研究認(rèn)為，CK-MB 水平升高與心肌細(xì)胞受損密切相關(guān)。丁佩芳等［16］研究指出，cTnT 是心肌細(xì)胞的標(biāo)志物之一，當(dāng)心肌細(xì)胞受損后，游離的cTnT 進(jìn)入血液循環(huán)，從而表現(xiàn)為血清cTnT 水平上升。盧志強(qiáng)等［17］研究表明，VMC 導(dǎo)致了傳導(dǎo)系統(tǒng)與心室肌除極的延緩以及室內(nèi)傳導(dǎo)阻滯，導(dǎo)致QRS 間期與PR 間期延長，而且心肌損傷會影響心肌縱向運(yùn)動下降，導(dǎo)致LVEF 與LVFS 降低。本研究進(jìn)一步驗證血清miR-31、IL-22 水平對VMC 患兒診斷及預(yù)后不良評估的預(yù)測價值，ROC 曲線分析表明，各單一指標(biāo)均可對VMC 患兒診斷及預(yù)后不良進(jìn)行預(yù)測，提示血清miR-31、IL-22 水平可作為VMC 患兒診斷及預(yù)后不良的診斷指標(biāo)，且聯(lián)合檢測的敏感度和特異度更高。

綜上所述，miR-31、IL-22 在病毒性心肌炎患兒血清中呈高表達(dá)，可能成為兒童病毒性心肌炎診斷及預(yù)后評估的輔助預(yù)測指標(biāo)。