李敏 孫江漫 孟祥兆 邵燕 于洪遠

維生素D 是一種類固醇激素，25（OH）D 是機體維生素D 的主要儲存形式，由于25（OH）D 半衰期長，不受血鈣和甲狀旁腺素水平的影響，被公認為是客觀評價維生素D 營養(yǎng)狀況的最佳指標［1］。最新研究顯示，除了對骨骼的影響，維生素D 缺乏或缺失與許多疾病的風險增加有關，包括癌癥、心血管疾病、糖尿病、傳染性疾病和自身免疫性疾病［2］。隨著人們對維生素D 重要性的認識加深，維生素D 的檢測量也與日俱增。目前25（OH）D 的檢測方法主要分為兩種：免疫法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，不同的方法學間由于檢測原理和系統(tǒng)的差異，實際檢測過程中可靠性存在明顯差異［3］，國內(nèi)已有較多關于兩種方法檢測結果一致性的報道［4-5］。對于同一檢測系統(tǒng)，由于樣本的前處理方式不同，也會導致檢測結果的差異，但這些差異經(jīng)常被忽視。本文研究前因素對免疫法和質(zhì)譜法檢測25（OH）D 的影響，旨在最大限度地保證標本質(zhì)量，提高檢測結果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 儀器

電化學發(fā)光全自動免疫分析儀Cobas e601（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）、TQD 串聯(lián)ACQUITY UPLC 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（沃特世科技有限公司）、L-128 型氮吹儀（博納艾杰爾科技有限公司）、移液器（艾本德中國有限公司）、高速冷凍離心機（艾本德中國有限公司）、A10 超純水機（密理博中國有限公司）。

1.2 試劑

25（OH）D 試劑盒（貨 號：05894913190）、校準品（貨號：05894921190）及質(zhì)控品（貨號：05618860190）均來自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司；25（OH）D2（貨號：DLM-9114-C）、25（OH）D3（貨號：DLM-9116-C）的同位素內(nèi)標購自CIL 公司，標準品（貨號：H-073、H-083）購自Sigma 公司；甲醇（貨號：A456-4）、甲酸（貨號：A117-50）、正己烷（貨號：H302-4）購自美國ThermoFisher 公司。

1.3 標本

收集北京航天總醫(yī)院2022 年1 月份住院患者血清和血漿標本作為研究對象，納入標準：①無慢性肝、腎、心等嚴重疾??；②近期無感染性疾病史；③近期無發(fā)熱史。所有標本均無溶血、乳糜和黃疸。本研究經(jīng)院倫理委員會審批后進行，所有研究對象對檢測均知情同意。

1.4 方法

1.4.1 標本分組

所有標本按照不同離心溫度、不同采血管類型、采集后不同離心時間間隔、離心后不同儲存溫度分為4 組，每組的標本量為40 例。常規(guī)標本的處理步驟為研究對象空腹采集EDTA-K2抗凝血2管，每管采血量2 mL。標本送達實驗室后立即離心，離心溫度為4℃，離心半徑21 cm，3 000 r/min離心10 min，選擇上層血漿進行檢測。離心后標本儲存溫度為2～8℃。標本處理完成后分別采用免疫法和質(zhì)譜法檢測25（OH）D 總量。

1.4.1.1 不同離心溫度 兩支標本的離心溫度分別為室溫（18～27℃）和4℃，其它均按常規(guī)標本的步驟處理。

1.4.1.2 不同采血管類型 納入該組的研究對象分別空腹采集EDTA-K2抗凝血和促凝血各1 管，采集后均按常規(guī)標本的步驟處理。

1.4.1.3 采集后不同離心時間間隔 兩支標本采集后的離心間隔分別為立即離心和常溫放置8 h后離心，其它均按常規(guī)標本的步驟處理。

1.4.1.4 離心后不同儲存溫度 兩支標本離心后儲存溫度分別為常溫和2～8℃，其它均按常規(guī)標本的步驟處理。

1.4.2 免疫電化學發(fā)光法

按照實驗室標準操作規(guī)程，對儀器進行校準并測量試劑盒配套質(zhì)控品，質(zhì)控合格后對標本進行檢測。

1.4.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

取200 μL 待測標本轉移至對應的1.5 mL 離心管，加20 μL 混合內(nèi)標溶液，渦旋混勻；往上述離心管中加入200 μL 甲醇，振蕩混勻；蛋白質(zhì)沉淀后加入800 μL 正己烷，渦旋混勻10 min；4℃、離心半徑8 cm、13 000 r/min 的條件下離心10 min；吸取600 μL 上清液于新的離心管中，氮氣吹干；加入100 μL 75%甲醇復溶，4℃、離心半徑8 cm、13 000 r/min 的條件下離心5 min，取80 μL 上清液上機檢測，總25（OH）D 的含量為25（OH）D2和25（OH）D3的總和。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用（）表示，兩組間比較采用配對t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四種因素對免疫法檢測結果的影響

室溫離心組的25（OH）D 總量高于4℃離心組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。使用促凝管采血組的25（OH）D 總量高于抗凝管組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。采集后常溫放置8 h 組的25（OH）D 總量高于即刻離心組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。離心后常溫儲存組的25（OH）D 總量高于2～8℃儲存組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四種因素對免疫法檢測結果的影響（）Table 1 The influence of four factors on the results of immunoassay detection（）

表1 四種因素對免疫法檢測結果的影響（）Table 1 The influence of four factors on the results of immunoassay detection（）

2.2 四種因素對質(zhì)譜法檢測結果的影響

室溫離心組的25（OH）D 總量高于4℃離心組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。使用促凝管采血組的25（OH）D 總量高于抗凝管組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。采集后常溫放置8 h 組的25（OH）D 總量高于即刻離心組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。離心后常溫儲存組的25（OH）D 總量高于2～8℃儲存組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 四種因素對質(zhì)譜法檢測結果的影響（）Table 2 The influence of four factors on the detection results of mass spectrometry（）

表2 四種因素對質(zhì)譜法檢測結果的影響（）Table 2 The influence of four factors on the detection results of mass spectrometry（）

2.3 兩種方法的比對

免疫法與質(zhì)譜法檢測25（OH）D 結果的平均偏差為-3.0 nmol/L（-7.48%）。以免疫法的測定結果為X 軸，質(zhì)譜法的測定結果為Y 軸，對兩種方法采用Passing-Bablok 回歸分析，見圖1。線性回歸方程為Y=0.082+1.133X，斜率的95%CI 為1.025～1.250，截距的95%CI 為-2.337～2.829，相關系數(shù)r=0.880。

圖1 檢測25（OH）D 的Passing-Bablok 回歸圖Figure 1 Passing-Bablok regression plot of 25（OH）D detected

3 討論

影響實驗室檢測結果準確性的因素主要有人員、儀器、試劑、方法、標本質(zhì)量等方面［6］。分析前的各種環(huán)節(jié)涉及較多，有報道稱可以通過強化分析前的規(guī)范化來控制對檢測結果的影響［7］，但目前看來實施難度較大。研究表明，臨床反饋不滿意的檢測結果約70%～80%的報告可溯源至樣本分析前的階段［8］。

本研究結果顯示，使用免疫法檢測25（OH）D，室溫離心組、使用促凝管采血組、采集后常溫放置8 h 組的25（OH）D 總量高于4℃離心組、抗凝管組、即刻離心組，差異有統(tǒng)計學意義。分析原因認為，處理標本時使用常溫離心機，隨著轉速的增加，離心溫度逐漸升高，可能會導致細胞發(fā)生破壞；全血樣本常溫放置8 h 后，細胞也易發(fā)生破壞，產(chǎn)生肉眼不可見的溶血，釋放內(nèi)源性干擾物質(zhì)，影響檢測結果。既往研究顯示［9］，使用西門子檢測系統(tǒng)對25（OH）D 進行免疫測定時，使用VACUETTE 品牌的促凝管采血組結果顯著高于無添加管組。本研究中采用羅氏檢測系統(tǒng)和BD 公司的采血管，使用促凝管采血組的25（OH）D 總量顯著高于EDTA 抗凝管采血組，分析原因可能是由于促凝管中的凝膠和凝塊激活劑增加了磁性顆粒標記的抗體和發(fā)光劑之間的非特異性交叉反應，導致化學發(fā)光值增加。

使用質(zhì)譜法檢測25（OH）D，室溫離心組、使用促凝管采血組、采集后常溫放置8 h 組、離心后常溫儲存組的結果高于4℃離心組、抗凝管組、即刻離心組、2～8℃儲存組，差異均無統(tǒng)計學意義。樣本前處理是質(zhì)譜法檢測的重要環(huán)節(jié)之一，常見的方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法［10］。本研究中樣本前處理包括兩步，首先是加入甲醇進行蛋白沉降，其次是使用正己烷液液萃取。經(jīng)過兩步處理后，充分去除血液標本中蛋白等雜質(zhì)的干擾，減少基質(zhì)效應。趙蓓蓓等［11］研究結果顯示，檢測25（OH）D 時，質(zhì)譜法與免疫法相比，受基質(zhì)和內(nèi)源性待測物的影響較小，可靠性更好。李思燃等［12］研究也表明25（OH）D 只有在維生素D 受體釋放時才能準確測定，質(zhì)譜法可通過沉淀蛋白等前處理方法處理此問題，從而達到準確測量的目的。

本研究結果與禹松林等［13-14］的報道結果相一致，提示免疫法與質(zhì)譜法的比較中存在比例系統(tǒng)誤差［15］。

目前，免疫法和質(zhì)譜法是國內(nèi)外檢測25（OH）D 的主要方法。免疫法的檢測原理是抗原抗體反應，抗體特異性低、其他代謝物干擾、不能區(qū)分25（OH）D2和25（OH）D3是免疫法面臨的最大挑戰(zhàn)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結合了色譜對物質(zhì)的高分離能力和質(zhì)譜對物質(zhì)結構和質(zhì)量的分析能力，有較高的靈敏度和特異性，能同時測定25（OH）D2和25（OH）D3，更全面地反映體內(nèi)25（OH）D 的狀況。本研究結果表明，質(zhì)譜法抗干擾能力強，不同的分析前因素對質(zhì)譜法檢測結果的影響無統(tǒng)計學意義。但質(zhì)譜法存在儀器價格昂貴、人員專業(yè)要求高等缺點，在臨床推廣難度大。目前檢驗科常規(guī)檢測中免疫法仍占較大比例，使用免疫法檢測時應加強對分析前因素的重視，積極與臨床科室溝通，提高分析前樣本的的質(zhì)量，以更好地為患者提供精準的檢測結果。