趙鵬 楊尚 張慧玲 溫倫軍 胡霞 孫海鵬 崔自學(xué) 侯啟瑞

摘要 以β-環(huán)糊精為壁材，桑多酚提取液為芯材，采用冷凍干燥法制備桑多酚微囊，并對(duì)其特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，桑多酚微囊包埋率隨β-環(huán)糊精的增加而提高，二者比值≤1∶3時(shí)多酚含量和包埋率趨于穩(wěn)定；掃描電鏡觀(guān)察，桑多酚微囊分散效果較好；微囊化可以顯著改善桑多酚在貯藏期間的穩(wěn)定性，減少多酚在胃液中的損耗，增加其在腸液中的釋放量；桑多酚微囊對(duì)·OH、DPPH·和O-2 ·的清除率與桑多酚相當(dāng)，說(shuō)明微囊化未影響其抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 桑多酚；微囊；制備；冷凍干燥；特性；抗氧化

中圖分類(lèi)號(hào) R285? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）06-0166-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.036

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study of Preparation and Characterization of Mulberry Polyphenol Microcapsules

ZHAO Peng1， YANG Shang1， ZHANG Hui-ling2 et al

（1. Sericulture Research Institute of Henan Province， Zhengzhou， Henan 450007;2. Jiangsu University of Science and Technology， Zhenjiang， Jiangsu 212100）

Abstract The microcapsules of mulberry polyphenol were prepared by freeze-drying method with β-cyclodextrin as wall material and mulberry polyphenol extract as core material， and their characteristics were studied. The results showed that the embedding rate of mulberry polyphenol microcapsules increased with the increase of β-cyclodextrin， and the polyphenol content and embedding rate tended to be stable when the ratio ≤ 1∶3. Scanning electron microscopy showed that the dispersion effect of mulberry polyphenol microcapsules was good. Microencapsulation significantly improved the stability of mulberry polyphenol during storage， reduced the loss of that in gastric fluid and increased the release in intestinal fluid. The clearance rate of ·OH，DPPH· and O-2 · in mulberry polyphenol microcapsules was like that of mulberry polyphenol， indicating that the microencapsulation did not affect its antioxidant activity.

Key words Mulberry polyphenols;Microcapsules;Preparation;Freeze drying;Characteristics;Antioxidation

桑（Morus alba L．）是多年生葉用經(jīng)濟(jì)作物，具有耐貧瘠、耐干旱、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，在我國(guó)有較廣的栽培范圍。據(jù)估計(jì)，我國(guó)桑樹(shù)的種植面積超過(guò)106 hm2，鮮桑葉的生物質(zhì)產(chǎn)量每年25～30 t/hm2，是目前木本葉用植物中產(chǎn)量最高的樹(shù)種之一［1］。幾百年來(lái)，桑葉一直被用作蠶的飼料。基于其抗氧化、抗菌和降血脂的特性，桑葉也被用于中草藥。近年來(lái)，人們對(duì)桑葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和治療功效有了新的認(rèn)識(shí)，桑葉及其提取物正被廣泛應(yīng)用于飼料和動(dòng)物養(yǎng)殖，在提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、飼料轉(zhuǎn)化效率和畜產(chǎn)品品質(zhì)等方面效果顯著［2-3］。

多酚是植物中的酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，在植物葉、果、皮、根中廣泛存在。桑多酚占桑葉干重的l％～3％，具有較強(qiáng)的清除羥自由基和氧自由基活性，是亟待開(kāi)發(fā)的蘊(yùn)藏在我國(guó)總量較大的一種植物天然抗氧化劑［4］。植物多酚苯環(huán)上有多個(gè)羥基，可發(fā)生消去、取代、置換和顯色等化學(xué)反應(yīng)，在自然界中具有高度不穩(wěn)定性，儲(chǔ)存過(guò)程還會(huì)受到氧化劑、熱、光和酶反應(yīng)的影響，降低多酚化合物的生物利用度［5］。微囊技術(shù)是以天然或人工合成的高分子材料為壁材，以所保護(hù)的物質(zhì)為芯材，通過(guò)微囊化減少芯材與外界環(huán)境接觸，使其免遭光照、溫度或氧化物的破壞，提高穩(wěn)定性［6］。研究顯示，微囊技術(shù)可以顯著改善多酚的穩(wěn)定性和貯藏性，且微囊有緩釋作用，可防止多酚被消化液破壞而吸收不完全［7］。微囊化常用的壁材有麥芽糊精、普魯蘭、凝乳素、海藻酸鈉、果膠、β-環(huán)糊精等。Hamid 等［8］以麥芽糊精為壁材，通過(guò)冷凍干燥進(jìn)行微囊化，克服了野生石榴黃酮不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，提高了其生物利用度。徐冉等［9］采用微囊技術(shù)將天然除蟲(chóng)菊酯包埋在β-環(huán)糊精的中空疏水區(qū)，結(jié)果表明微囊相對(duì)原材料具有較好的熱穩(wěn)定性和緩釋性能。β-環(huán)糊精分子為立體結(jié)構(gòu)，環(huán)中間有空洞，邊緣具有親水性或極性，能溶于水，不溶于乙醇和其他有機(jī)溶劑［10］。該研究以β-環(huán)糊精為壁材，桑多酚為芯材，通過(guò)冷凍干燥的方法制備桑多酚微囊，并對(duì)其緩釋特性、穩(wěn)定性和抗氧化性能進(jìn)行檢測(cè)，以期獲得較好的桑多酚微囊產(chǎn)品，促進(jìn)桑葉資源在食品、飼料添加劑等方面的開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。

新鮮桑葉采摘于鎮(zhèn)江中農(nóng)蠶桑技術(shù)服務(wù)有限公司桑園，樣品65 ℃烘至恒重，粉碎后過(guò)60目篩。

1.1.2 試劑。β-環(huán)糊精、沒(méi)食子酸（純度99%）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、福林-酚試劑、無(wú)水乙醇、鎢酸鈉、磷鉬酸、磷酸、碳酸鈉，均為分析純，鎮(zhèn)江華東器化玻有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備。

Beta 2-8 LSC basic凍干機(jī)（Christ Sigma儀器設(shè)備北京有限公司）；ST16 ST16R高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司）；UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津香港有限公司）；MH-1500S 型超聲波清洗器（湖南米函儀器科技有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（江蘇省常州市國(guó)華儀器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑多酚提取物的制備。

桑葉粉25 g，按1∶25料液比加入0.34%十二烷基硫酸鈉（SDS）、60%乙醇，61 ℃超聲15 min，超聲功率260 W。然后將提取液置于離心管中3 000 r/min離心15 min，上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中50 ℃濃縮至原體積的1/4。

1.2.2 桑多酚微囊的制備。

β-環(huán)糊精按照表1的比例加至濃縮液中，不斷攪拌2 h使其完全均質(zhì)，然后-80 ℃冷凍24 h。樣品用凍干機(jī)在-30 ℃、0.04 hPa真空壓力下冷凍干燥，研缽磨成粉，放入琥珀色瓶中備用。

1.2.3 沒(méi)食子酸

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.011 0 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得濃度為0.11 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL標(biāo)準(zhǔn)液置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水6.0 mL，然后分別加入福林-酚試劑0.5 mL，混勻，再加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液，充分混合后定容。30 ℃避光放置30 min，以不加標(biāo)準(zhǔn)液的6.0 mL蒸餾水為空白對(duì)照，760 nm下測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸在反應(yīng)體系中的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。

1.2.4 桑多酚微囊包埋率的測(cè)定。

1.2.4.1 桑多酚微囊表面多酚含量的測(cè)定。

桑多酚微囊1.00 g先溶于一定量水中再定容至100 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL定容至25 mL，10 min后以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白對(duì)照，760 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出微囊表面多酚含量。

1.2.4.2 桑多酚微囊總多酚含量的測(cè)定。

1.00 g桑多酚微囊溶于30 mL無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢枰岳诒诓牡娜芙狻Ｓ谜麴s水定容至100 mL，61 ℃超聲15 min，超聲功率260 W，取上清液1 mL定容至25 mL，10 min后測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出微囊總多酚含量。

1.2.4.3 桑多酚微囊包埋率。根據(jù)以下公式計(jì)算桑多酚微囊包埋率：

包埋率=（1-桑多酚微囊表面多酚含量/桑多酚微囊總多酚含量）×100%。

1.2.5 桑多酚微囊顯微形態(tài)觀(guān)察。

少量桑多酚微囊黏附于雙面膠上，鍍金后放入掃描電鏡樣品室，抽真空，觀(guān)察微囊結(jié)構(gòu)并拍照留存。

1.2.6 桑多酚微囊在人工胃、腸液中多酚釋放的測(cè)定。

1.2.6.1 人工胃、腸液的配制。

人工胃液：800 mL水中加入16.4 mL稀鹽酸和10 g胃蛋白酶，混勻，定容至1 000 mL。

人工腸液：稱(chēng)取6.8 g KH2PO4加入500 mL水中，攪拌均勻，然后用4% NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，再加入10 g胰酶混勻，定容至1 000 mL。

1.2.6.2 模擬胃腸環(huán)境的釋放。

0.5 g T4組桑多酚微囊加入100 mL預(yù)熱的（37.5～38.0 ℃）人工胃液或腸液中，300 r/min不斷攪拌，在10、20、30、60、120、180、240、300 min取樣，544 nm 處測(cè)定吸光度并計(jì)算多酚含量。通過(guò)計(jì)算累積釋放度觀(guān)察桑多酚微囊的緩釋效果：

累積釋放度=（最大釋放時(shí)的多酚含量/總多酚含量）×100%。

1.2.7 桑多酚微囊穩(wěn)定性測(cè)定。

將3 g桑多酚微囊和桑多酚室溫下敞口放置20 d，每隔5 d取0.5 g樣品測(cè)定多酚含量，計(jì)算多酚保留率：多酚保留率= 貯藏后樣品中多酚含量/起始樣品中多酚含量×100%。

1.2.8 桑多酚微囊抗氧化性測(cè)定。

1.2.8.1 清除羥基自由基（·OH）。

2 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、1 mL鄰二氮菲（1.5 mmol/L）和1 mL FeSO4（1.5 mmol/L）混勻，分別加入1 mL相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的桑多酚微囊或桑多酚溶液，混勻，然后加入1 mL H2O2（0.02%），補(bǔ)充體積至8 mL，在536 nm處測(cè)吸光度，記為A樣品；對(duì)照組以蒸餾水代替樣液，空白組以蒸餾水代替 H2O2?！H 清除率的計(jì)算公式：清除率=（A對(duì)照-A樣品-A空白）/A對(duì)照×100%。

1.2.8.2 清除二苯基苦基苯肼自由基（DPPH·）。

取2 mL相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的桑多酚微囊或桑多酚溶液，加入2 mL DPPH溶液（稱(chēng)取8.05 mg DPPH溶解于無(wú)水乙醇，以無(wú)水乙醇定于100 mL，即為0.2 mmol/L DPPH溶液），混勻，30 min后在517 nm 處測(cè)吸光度，記為A樣品；對(duì)照組以乙醇代替樣液，空白組以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液。DPPH·清除率的計(jì)算公式：清除率=（A對(duì)照-A樣品-A空白）/A對(duì)照×100%。

1.2.8.3 清除超氧陰離子（

O-2 ·）。

4.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）分別加入1 mL相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的桑多酚微囊或桑多酚溶液，25 ℃保溫20 min，然后加入 0.3 mL鄰苯三酚（1 mmol/L），5 min后在325 nm處測(cè)吸光度，記為A樣品；對(duì)照組以蒸餾水代替樣液，空白組以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液。O-2 ·清除率的計(jì)算公式：清除率=（A對(duì)照-A樣品-A空白）/A對(duì)照×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 10.1軟件包進(jìn)行方差分析（ANOVA）、Duncan檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著。所有檢測(cè)均做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑多酚微囊包埋率及顯微結(jié)構(gòu)

根據(jù)桑多酚提取物的濃度優(yōu)化壁材β-環(huán)糊精的濃度。如表2所示，桑多酚微囊包埋率隨β-環(huán)糊精的增加而提高（最高可達(dá)76.97%），桑多酚提取液：β-環(huán)糊精≤1∶3時(shí)（T3～T6）表面多酚含量、總多酚含量和包埋率趨于穩(wěn)定。壁材濃度的增加會(huì)減少單位質(zhì)量中多酚的含量，因此隨著β-環(huán)糊精的增加多酚含量相對(duì)降低。綜合包埋率和總多酚含量的數(shù)據(jù)，T4組配比較優(yōu)。選取T4組桑多酚微囊進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀(guān)測(cè)，結(jié)果如圖2所示。未微囊化的桑多酚黏連現(xiàn)象嚴(yán)重，微囊化后分散性提高，更加蓬松。

2.2 桑多酚微囊在模擬胃、腸液中多酚釋放

用β-環(huán)糊精將較小尺寸的桑多酚包裹起來(lái)，不僅可以增強(qiáng)其對(duì)不良環(huán)境的抵抗性，還能使微囊中的桑多酚在腸道適宜條件下快速釋放出來(lái)，明顯提高其在腸道中的有效吸收率。T4組桑多酚微囊在人工胃、腸液中的溶出情況如圖3所示。在人工胃液中，120 min左右多酚含量最大（0.45 mg/mL），而在人工腸液中，桑多酚微囊能夠迅速釋放多酚，10 min時(shí)多酚含量就迅速上升至1.18 mg/mL，并在之后的2 h內(nèi)含量維持在1.0 mg/mL 左右（最大值為60 min時(shí)1.19 mg/mL）。桑多酚微囊經(jīng)過(guò)人工胃液處理后，仍保持顆粒狀態(tài)，液體清亮，而進(jìn)入人工腸液后變得松散，并逐漸崩解，液體渾濁，說(shuō)明所得的微囊產(chǎn)品具有較好的緩釋效果。計(jì)算可知桑多酚微囊最大累積釋放度達(dá)到 88.37%。

2.3 桑多酚微囊的穩(wěn)定性檢測(cè)

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，桑多酚微囊和桑多酚樣品中多酚保留率整體呈明顯的下降趨勢(shì)，且桑多酚樣品中的多酚含量下降趨勢(shì)更為急劇。在放置20 d時(shí)，桑多酚微囊所含多酚的保留率為86.22%，而桑多酚樣品中的多酚保留率僅為 42.43%，說(shuō)明微囊化對(duì)內(nèi)部芯材的保護(hù)效果比較理想，能夠有效提升桑多酚在貯藏期間的穩(wěn)定性。

2.4 桑多酚微囊的抗氧化活性檢測(cè)

多酚類(lèi)化合物普遍具

有抗氧化活性，可有效清除體內(nèi)有害的自由基，發(fā)揮抗氧化損傷作用。從圖5可以看出，桑多酚微囊抗氧化活性與桑多酚相當(dāng)，清除·OH和O-2 ·的能力呈現(xiàn)明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系，清除DPPH·的能力在低濃度（≤0.5 mg/mL）時(shí)有明顯上升趨勢(shì)，超過(guò)0.5 mg/mL清除率變化不大。隨著樣品濃度的增加，桑多酚微囊中多酚含量低于桑多酚樣品中多酚含量，因此高濃度時(shí)桑多酚微囊清除自由基的能力略低于桑多酚。

3 結(jié)論

以β-環(huán)糊精為壁材、桑多酚提取液為芯材，通過(guò)冷凍干燥法制備桑多酚微囊，包埋率可達(dá)76.97%。掃描電鏡觀(guān)察，桑多酚微囊分散效果較好。模擬胃腸環(huán)境測(cè)得，微囊化可以減少桑多酚在胃液中的損耗，增加其在腸液中的釋放量，最大累積釋放度為88.37%。與未微囊化的桑多酚相比，微囊化可以明顯改善桑多酚在貯藏期間的穩(wěn)定性，貯藏20 d后多酚保留率比未微囊化保留率高43.79百分點(diǎn)。微囊化后，桑多酚抗氧化活性未受影響，·OH、DPPH·和O-2 ·清除率與桑多酚相當(dāng)。

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