文 遷 邵揮戈 孫逸虎 劉 婷

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,湖南省長沙市 410208; 2 南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院內(nèi)分泌科

糖尿病足潰瘍(Diabetic foot ulcer,DFU)的發(fā)生是由于糖尿病合并血管病變致使局部血液供應(yīng)不足,周圍神經(jīng)病變及機(jī)械性損傷合并感染所致,繼而潰瘍形成和(或)深層組織的破壞。其發(fā)生率高達(dá)34%,復(fù)發(fā)率1年內(nèi)為40%,5年內(nèi)為65%,是糖尿病患者住院或截肢的最主要原因。DFU目前主要采用內(nèi)外科聯(lián)合治療的方式,中下肢血管嚴(yán)重狹窄者,可行外科血管再造手術(shù)及介入放射學(xué)治療。然而在臨床上有一部分患者因下肢微循環(huán)差、小動(dòng)脈完全閉塞、缺乏遠(yuǎn)端動(dòng)脈流出通道等原因無法行外科血管重建手術(shù)而被迫接受截肢。此外,由于糖尿病足潰瘍患者多因年老體弱,或心肺功能差、基礎(chǔ)病多而不能進(jìn)行手術(shù)治療,致殘率及致死率不斷增加[1]。因此,開辟新的治療方式是必然趨勢。

近年來,外泌體(Exosomes,Exos)成為創(chuàng)面修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn),其具有緩解炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管形成、誘導(dǎo)再上皮化等潛在的治療作用,在DFU創(chuàng)面愈合方面有良好的治療前景。Exos有多種來源,例如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和臍血間充質(zhì)干細(xì)胞等,而人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞與其他干細(xì)胞相比,具有成本低、侵襲性小、分離方便、細(xì)胞含量大、基因轉(zhuǎn)染效率高和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),成為細(xì)胞療法和再生醫(yī)學(xué)的首選[2]。本文對人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells derived-exosomes, HUMSCs-Exos)的生物學(xué)特性和功能、在DFU中的作用機(jī)制及給藥方式進(jìn)行綜述,旨在為DFU的治療提供新思路。

1 人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體

外泌體是40～100nm大小的內(nèi)體來源的小脂質(zhì)雙層囊泡,密度為1.13～1.19g/ml,含有蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和DNA。它是關(guān)鍵的旁分泌介質(zhì),可以從包括血漿在內(nèi)的生物體液中獲得,并能夠通過轉(zhuǎn)移諸如miRNA等活性物質(zhì)來誘導(dǎo)再生效應(yīng),具有修復(fù)和再生組織的治療潛力,包括促進(jìn)傷口愈合,且與細(xì)胞直接處理可避免干細(xì)胞移植療法的許多負(fù)面影響。在所有干細(xì)胞外泌體中,HUMSCs-Exos具有突出的優(yōu)勢,其應(yīng)用在各種疾病治療中被提及,如糖尿病、器官移植、移植物抗宿主病、心血管、炎癥、肝、肺、腎、神經(jīng)、自身免疫,以及骨和軟骨疾病,這些研究大多數(shù)都已經(jīng)在動(dòng)物模型中展開。HUMSCs-Exos具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移、血管生成和創(chuàng)面閉合的能力[3]。Qu等[4]將提取的HUMSCs-Exos局部注射到小鼠皮膚創(chuàng)面中發(fā)現(xiàn),它可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移,增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性,加速上皮再生并減少瘢痕形成。另外的研究顯示在糖尿病或燒傷動(dòng)物模型中,局部注射HUMSCs-Exos也有相同的作用[5]。在臨床上,將HUMSCs-Exos應(yīng)用于人工耳蝸植入過程中,可以減少由電極插入引發(fā)的炎癥[6];靜脈注射和動(dòng)脈內(nèi)靶向注射HUMSCs-Exos至受損腎臟,可以改善炎癥免疫反應(yīng)并暫時(shí)(3～6個(gè)月)改善Ⅲ～Ⅳ級CKD患者的整體腎功能[7]。這些研究表明DFU創(chuàng)面愈合基于HUMSCs-Exos的治療是一種很有前景的療法,且在人體上應(yīng)用有一定的安全性。

2 糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合

創(chuàng)面愈合是生物分子活動(dòng)引發(fā)的一種復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的細(xì)胞信號響應(yīng),一般根據(jù)時(shí)間、修復(fù)過程、病因情況不同可將傷口分為急性傷口和慢性傷口。傷口在通過有序、及時(shí)的修復(fù)愈合過程后,可恢復(fù)解剖和功能的完整性,在這個(gè)過程中需要成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板等多種修復(fù)細(xì)胞和血液成分的參與[8]。DFU患者因?yàn)橄轮芗吧窠?jīng)病變和長期的高糖毒性影響使得潰瘍創(chuàng)面中白細(xì)胞的吞噬能力減弱,病原菌在組織內(nèi)的生長條件更加有利,創(chuàng)面更易發(fā)生感染且很難控制;像一些炎癥修復(fù)細(xì)胞如堿性成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等,因糖尿病慢性病變綜合因素作用,其原有的分泌功能發(fā)生障礙致細(xì)胞因子分泌減少或細(xì)胞增殖減少或凋亡增多,導(dǎo)致用于組織修復(fù)的細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)、血小板源性生長因子(PDGF)等因子的數(shù)量減少;炎癥相關(guān)蛋白分解平衡受損,基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMP)水平提升而其酶類抑制劑含量降低,加上受細(xì)胞遷移激活的組織支架修復(fù)程序破壞及膠原蛋白的過分分解,潰瘍創(chuàng)面愈合過程已從分子層面被阻斷[9];末梢血管病變所導(dǎo)致的潰瘍局部供血不足造成組織物質(zhì)交換不足,代謝廢物無法及時(shí)運(yùn)輸且一些營養(yǎng)物質(zhì)也無法得到正常供應(yīng),使得潰瘍創(chuàng)面愈合的能力受到自身因素的限制。對于DFU傷口,如果不及早治療或受到干擾,運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)將陷入局部血流減少導(dǎo)致的肌肉痙攣、炎癥浸潤、缺血或壞死的惡性循環(huán)。許多促進(jìn)愈合的傳統(tǒng)治療方法,如激光、治療敷料、負(fù)壓傷口治療、電刺激、高壓氧等,在臨床上都有應(yīng)用,但這些方法都不完全令人滿意,目前,主要研究集中在自體細(xì)胞療法或無細(xì)胞療法,尤其是對HUMSCs-Exos的研究。

3 HUMSCs-Exos促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制

HUMSCs-Exos的治療應(yīng)用是一種相對較新的生物技術(shù),代表了許多領(lǐng)域的突破,特別是在DFU創(chuàng)面愈合方面。其作為一種自體無細(xì)胞療法,主要是通過激活傷口愈合機(jī)制來促進(jìn)傷口愈合,而不是一些傳統(tǒng)療法的輔助維持模式。DFU創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程,主要有三個(gè)基本階段:急性炎癥期、細(xì)胞增殖期和表皮及其他組織再生期。而HUMSCs-Exos在創(chuàng)面愈合過程的每個(gè)階段都起到了重要作用。

3.1 HUMSCs-Exos在急性炎癥期的功能 急性炎癥期是創(chuàng)面愈合過程中的第一階段:創(chuàng)面出現(xiàn)不同程度的組織壞死和血管破裂,炎癥反應(yīng)在數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生。富含多種蛋白質(zhì)和RNA的外泌體與炎癥過程的調(diào)控緊密相關(guān)。急性炎癥期主要由中性粒細(xì)胞組成的白細(xì)胞積聚,3d后轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞為主的富集。巨噬細(xì)胞是重要的炎癥細(xì)胞,具有促炎M1和抗炎M2兩個(gè)表型。HUMSCs-Exos中特異表達(dá)的miRNA let-7b通過TLR4/NF-κB/STAT3/AKT信號通路穩(wěn)定調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化,推動(dòng)巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型分化,減輕炎癥反應(yīng)并促進(jìn)糖尿病皮膚傷口的愈合[10]。另外研究發(fā)現(xiàn)HUMSCs-Exos中三種特定的miRNA(miR-21、miR-146a 和 miR-181)上調(diào)表達(dá)較顯著,它們在調(diào)節(jié)炎癥過程中也起著關(guān)鍵作用。MiR-21在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,其通過沉默PTEN和GSK3β、抑制NF-κB活化和促進(jìn)c-Jun/AP1活性來抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)傷口愈合[11];當(dāng)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中miR-146a的轉(zhuǎn)錄時(shí),能夠抑制體內(nèi)促炎巨噬細(xì)胞反應(yīng),從而抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12];MiR-181c則通過降低TLR4表達(dá)和減少NF-κB/p65活化來調(diào)節(jié)炎癥[5]。這些結(jié)論為HUMSCs-Exos在潰瘍創(chuàng)面愈合中的應(yīng)用提供了理論支持。

3.2 HUMSCs-Exos在細(xì)胞增殖期的功能 在細(xì)胞增殖期,內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖促進(jìn)血管生成和新的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)合成,這是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵。HUMSCs-Exos可通過miRNA和蛋白質(zhì)作為載體,調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通訊,能顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖和遷移功能。研究顯示,將HUMSCs-Exos移植到大鼠皮膚缺損區(qū),缺損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)的量增加。更關(guān)鍵的是,與血管新生相關(guān)的重要正向調(diào)節(jié)劑血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)表達(dá)得更多,該區(qū)域的血管新生、膠原合成和再上皮化顯著提升,瘢痕組織形成明顯減少[13]。HUMSCs-Exos誘導(dǎo)更高的傷口閉合率,增加體內(nèi)CD31的表達(dá),并含有血管生成素-2(Ang-2)。其中Ang-2的高表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成,在大鼠皮膚傷口中發(fā)揮治療和促血管生成作用[14]。Wnt4是激活β-catenin信號通路的關(guān)鍵因素,預(yù)激活Wnt/β-catenin信號通路的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在治療DFU方面具有一定潛力。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn),Wnt4由HUMSCs-Exos傳遞,其遞送Wnt4從而激活A(yù)KT通路來促進(jìn)創(chuàng)面愈合并抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞凋亡。HUMSCs-Exos中Wnt4的降低減少了內(nèi)皮細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白核易位,體內(nèi)促血管生成作用也被Wnt4表達(dá)的干擾所抑制,這表明HUMSCs-Exos介導(dǎo)的Wnt4誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白活化可發(fā)揮促血管生成作用。2016年又發(fā)現(xiàn)Hippo通路的兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子:YES相關(guān)蛋白(YAP)和腫瘤抑制因子(p-LATS)參與創(chuàng)面修復(fù),HUMSCs-Exos的14-3-3蛋白通過形成復(fù)合物招募p-LATS誘導(dǎo)YAP的Ser127磷酸化,從而通過有效協(xié)調(diào)Wnt4活性的自我控制來調(diào)節(jié)皮膚細(xì)胞增殖[16]。

3.3 HUMSCs-Exos在表皮和其他組織再生階段的功能 在組織再生過程中,人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)和膠原蛋白Ⅰ是關(guān)鍵?；|(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)又稱間質(zhì)性膠原酶,可分解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ間質(zhì)膠原,影響膠原和彈性蛋白的產(chǎn)生。HUMSCs-Exos可以通過直接膜融合、內(nèi)吞作用或細(xì)胞型特異性吞噬作用被HDF吸收并增強(qiáng)體外生長和遷移,在整個(gè)皮膚以及角質(zhì)層和表皮中的滲透顯著增加。經(jīng)局部治療滲入人皮膚的HUMSCs-Exos會(huì)降低離體人皮膚中MMP-1的產(chǎn)生,從而增加膠原和彈性蛋白的產(chǎn)生[17],這對人類皮膚的恢復(fù)至關(guān)重要。另外HUMSCs-Exos包含大量生長因子,如外泌體蛋白14-3-3控制了YAP的活性和磷酸化,它在高細(xì)胞密度下將p-LATS與YAP結(jié)合,由此而形成的復(fù)合物可以限制皮膚重塑過程中過度的成纖維細(xì)胞擴(kuò)張和膠原沉積。簡而言之,HUMSCs-Exos通過調(diào)節(jié)YAP來協(xié)調(diào)受控的皮膚再生,從而起到信號“剎車”的作用[17]。轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β) 被認(rèn)為是創(chuàng)面愈合中不可或缺的生長因子之一,TGF-β結(jié)合并激活膜受體絲氨酸/蘇氨酸激酶復(fù)合物,磷酸化各種SMAD家族蛋白,對創(chuàng)面愈合至關(guān)重要。但病理狀態(tài)下傷口部位高水平 TGF-β活性與過度瘢痕形成和纖維化有關(guān)。所以,干擾TGF-β/SMAD2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性可能會(huì)抑制成纖維細(xì)胞的分化和過度聚集,從而減少過度纖維化或瘢痕形成。而研究發(fā)現(xiàn)HUMSCs-Exos衍生的特定microRNA,如miR-21、miR-23a、miR-125b和miR-145抑制TGF-β2、TGF-βR2 和SMAD2,從而抑制靶基因α-SMA和減少膠原蛋白的沉積,在促進(jìn)傷口愈合的基礎(chǔ)上還可以防止瘢痕形成[18]。

4 Exos在創(chuàng)面治療中的給藥方式

目前,Exos治療創(chuàng)面愈合的常用給藥方式為注射,但注射不能使Exos與創(chuàng)面直接接觸,還會(huì)因?yàn)榍宄士?影響其功能,另一方面,DFU創(chuàng)面的修復(fù)和再生需要相對較長的愈合時(shí)間,因此,近年來研究者不斷實(shí)踐開發(fā)有效的生物相容性支架,作為Exos的緩釋載體,以維持其在創(chuàng)面區(qū)域的生物活性并促進(jìn)傷口愈合。其中,應(yīng)用較多的載體為水凝膠。生物醫(yī)學(xué)水凝膠的結(jié)構(gòu)類似于天然的ECM,不僅具有良好的生物相容性,還能改變細(xì)胞生長的微環(huán)境。Wang等[19]制成FHE@exo水凝膠除以上特性外,還能促進(jìn)外泌體持續(xù)釋放。其處理過的傷口的新血管形成和細(xì)胞增殖能力得以提高,獲得更佳的促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果。Shi等[20]將殼聚糖/蠶絲水凝膠作為外泌體生物支架,與外泌體組合后可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的再上皮化、促進(jìn)新血管生成和神經(jīng)元長入,有效促進(jìn)了糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合。另外,還有研究指出,外泌體與許多其他形式的水凝膠相結(jié)合,如PF-127水凝膠、納米纖維水凝膠、天然甲基纖維素—?dú)ぞ厶撬z等,同樣具有良好的機(jī)械性能、保水性、抗感染能力和細(xì)胞生物相容性,可以更穩(wěn)定高效地發(fā)揮外泌體對創(chuàng)面的愈合作用。

5 總結(jié)與展望

DFU給患者帶來了嚴(yán)重的心理、身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),是全球面臨的挑戰(zhàn)。毫無疑問,從組織再生和干細(xì)胞工程的角度確定一種新的促進(jìn)DFU傷口愈合的方法是臨床研究的重點(diǎn)。HUMSCs-Exos作為細(xì)胞間相互作用的一個(gè)組成部分,在細(xì)胞微環(huán)境中越來越受到重視。HUMSCs-Exos的研究揭示了無細(xì)胞療法在創(chuàng)面修復(fù)的潛在應(yīng)用,其分泌并運(yùn)輸多種生物活性成分,參與一系列生理和病理過程中,在分子基因水平上的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用,通過減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成和細(xì)胞增殖來增強(qiáng)組織再生和修復(fù)。并且Exos與生物載體的結(jié)合,能使其更高效穩(wěn)定地發(fā)揮療效。這些研究結(jié)果為在DFU創(chuàng)面愈合中使用HUMSCs-Exos療法提供強(qiáng)大依據(jù)。

雖然現(xiàn)有研究展示了Exos的廣闊應(yīng)用前景,但在HUMSCs-Exos的廣泛臨床應(yīng)用中,該領(lǐng)域仍然存在一些亟待解決的問題:(1)Exos的提取和純化過程仍然比較煩瑣,無法快速分離所需數(shù)量的Exos來滿足臨床的需求;(2)Exos的內(nèi)容物、功能及其涉及的信號通路錯(cuò)綜復(fù)雜,尚未完全透徹闡明,需要更多的研究來進(jìn)一步闡明HUMSCs-Exos促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制,并進(jìn)一步革新其制備與純化技術(shù),探究其在臨床治療中的有效劑量。由于對HUMSCs-Exos領(lǐng)域的研究尚處于起步階段,因此迄今為止尚不清楚Exos有助于DFU傷口愈合的生物安全性,有效性,可重復(fù)性,生產(chǎn)潛力,形成機(jī)制和生物學(xué)功能,需要進(jìn)一步深入研究將該方法發(fā)展為臨床現(xiàn)實(shí),以替代基于細(xì)胞的療法。