張力超
磐石市動(dòng)物檢疫站,吉林磐石 132300
近年來(lái),隨著人們生活水平的提高,大家對(duì)豬肉的需求和豬肉的品質(zhì)要求也越來(lái)越高,很多人開始加入高標(biāo)準(zhǔn)生豬養(yǎng)殖的隊(duì)伍,生豬養(yǎng)殖的數(shù)量和規(guī)模在不斷地?cái)U(kuò)大。但同時(shí)各種疾病也隨之而來(lái),其中,豬藍(lán)耳病是生豬養(yǎng)殖的主要疫病之一,這種病對(duì)生豬的危害極大,傳染性很強(qiáng),一旦發(fā)病,很容易造成大面積傳播,豬死亡數(shù)量增加,這樣就會(huì)導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益降低。
豬藍(lán)耳病,也被稱為豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),它屬于一種危害很大、流行范圍很廣的傳染病,不同年齡、品種和性別的豬都可以被感染,在臨床上,它的癥狀主要有:懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、木乃伊胎和死胎繁殖障礙,仔豬和育肥豬出現(xiàn)呼吸道綜合癥狀[1~3],它屬于一種免疫抑制病,經(jīng)常會(huì)繼發(fā)其他病原感染。
豬藍(lán)耳病距今已經(jīng)有三十多年的歷史,第一次于1987年被美國(guó)報(bào)道,1990~1991年在歐洲暴發(fā),導(dǎo)致超過(guò)一百萬(wàn)頭豬死亡[4~6]。在1991年,荷蘭的wenswon等人首先從病豬身上提取到了這種病毒。自20世紀(jì)90年代初首次發(fā)現(xiàn)于亞洲地區(qū)后[7~8],至2006年已在中國(guó)10余個(gè)省份檢出,累計(jì)已達(dá)20萬(wàn)余頭,近50頭豬死亡[9]。該病的主要特點(diǎn)為:在我國(guó)該病的發(fā)病率高達(dá)100%,死亡率高達(dá)50%,母豬的流產(chǎn)率高達(dá)30%[10],而且在育肥過(guò)程中還會(huì)出現(xiàn)病死癥。高致病力豬藍(lán)耳病毒(Virus)具有傳染性強(qiáng)、傳播迅速、發(fā)病率高、病死率高等特點(diǎn),在世界范圍內(nèi)廣泛流行,給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了極大地危害。
高致病豬藍(lán)耳病是一種嚴(yán)重危害豬群健康的疾病,但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。另外,由于與其他導(dǎo)致母豬生殖障礙綜合征的疾病具有十分相似的臨床表現(xiàn),并且PRRS生豬的不同種群和不同的發(fā)病時(shí)期表現(xiàn)出較大的差別,再加上近年來(lái)逐漸增多的亞臨床型和慢性感染,使得該病的確診變得更加困難。所以,從病豬的臨床表現(xiàn)和病理改變來(lái)看,都不能明確診斷,還需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)明確診斷。而常用的實(shí)驗(yàn)室診斷有以下幾種方法:①反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR);②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA);③免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞染色試驗(yàn)法(IPMA);④血清中和試驗(yàn)(SN);⑤間接免疫熒光試驗(yàn)法(簡(jiǎn)稱IFA)。然而,現(xiàn)有的檢測(cè)手段或缺乏特異性或靈敏度低,或操作繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)力,無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)PRRSV和HP-PRRSV的快速識(shí)別。用RT-PCR方法檢測(cè)高致病性豬藍(lán)耳病時(shí),操作較為簡(jiǎn)便,對(duì)臨床樣品的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
4.1.1 主要試劑
RNA抽提試,PCR試劑。
4.1.2 主要儀器
紫外可見光光度計(jì),超凈工作臺(tái),PCR儀,高速低溫離心機(jī),電子天平,冰箱。
4.1.3 病料
病料采集自本地部分地區(qū)具有豬藍(lán)耳病臨床癥狀和病理變化的病豬、死豬。
4.2.1 樣品的采集和處理
稱量取豬組織0.05g(肺,腦,扁桃體,脾),置于粉碎機(jī)中,用微量的石英砂進(jìn)行粉碎機(jī)粉碎,然后用1.5mL的生理鹽水繼續(xù)進(jìn)行粉碎,攪拌均勻后,轉(zhuǎn)移到1.5mL無(wú)菌離心管內(nèi),以8000r/s的速度離心8min,將100μL的上清液置于1.5mL的EP試管內(nèi)。
陽(yáng)性對(duì)照組:將100μL的陽(yáng)性對(duì)照組置于1.5mL的EP試管內(nèi)。
陰性對(duì)照組:將100μL的陰性對(duì)照組置于1.5mL的EP試管內(nèi)。
4.2.2 病毒RNA的提取
將200mg的組織取出,放入1.5mL的EP管中,再將1mL的TRIZOL試劑倒入其中,進(jìn)行勻漿處理。震動(dòng)30s,在室溫靜置6min,然后添加0.2mL氯仿,猛烈搖晃30s,混合均勻,在12000r/s和4℃下,在5min的室溫靜置15min,把上清移到一個(gè)新的離心機(jī)中,再加同上清量相同的異丙醇,倒置攪拌均勻。在-20℃下放置30min,在12000r/s下,在4℃下進(jìn)行20min的離心,除去上清液。之后將75%乙醇1mL加到該沉淀物上,以12000r/s的速度在4℃下進(jìn)行10min的離心。去掉上層清液,使其保持沉降,然后晾干10min。將所得到的沉淀物溶于20μLDEPC處理過(guò)的水中,并將其置于-20℃的環(huán)境中。
4.2.3 進(jìn)行RT-PCR
4.2.3.1 cDNA的制備
以上一步驟獲取的RNA作為模板,按照實(shí)驗(yàn)室設(shè)定的反轉(zhuǎn)錄條件,制備10μL反向錄體系,在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,在30℃退火,42℃延長(zhǎng),99℃變性反應(yīng)后,得到cDNA。在這里,反向記錄條件被描述如下。
當(dāng)反應(yīng)條件為30℃時(shí),作用時(shí)間10min,當(dāng)反應(yīng)條件為42℃時(shí),作用時(shí)間60min,當(dāng)反應(yīng)條件99℃時(shí),作用時(shí)間5min,當(dāng)反應(yīng)條件為4℃時(shí),作用時(shí)間60min,然后停止。
4.2.3.2 PCR擴(kuò)增
以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板,通過(guò)上下游引物(P1/P2)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行PCR,然后加入Taq脫氧核酶,將dNTP放入PCR反應(yīng)管內(nèi),最終與ddH20進(jìn)行配平。接著將PCR反應(yīng)試條放入PCR放大器內(nèi),進(jìn)行預(yù)變、變、退火、伸展、全伸展等反應(yīng),并進(jìn)行35次以上的循環(huán),最后將PCR結(jié)果儲(chǔ)存在4℃下。組分為10xbuffer時(shí),反應(yīng)體積2.5μL,組分為TaqDNA酶時(shí),反應(yīng)體積0.5μL,當(dāng)組分為dNTPmixture時(shí),反應(yīng)體積2.0μL,當(dāng)組分為P1時(shí),反應(yīng)體積1.0μL,當(dāng)組分為P2時(shí),反應(yīng)體積1.0μL,當(dāng)組分為cDNA時(shí),反應(yīng)體積2.0μL,當(dāng)組分為ddH20時(shí),反應(yīng)體積16μL。
反應(yīng)條件。Pcr擴(kuò)增條件,當(dāng)反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性,作用時(shí)間為5min,當(dāng)反應(yīng)條件94℃變性,作用時(shí)間30s,當(dāng)反應(yīng)條件65℃退火,作用時(shí)間30s,當(dāng)反應(yīng)條件72℃延伸,作用時(shí)間30s,如此做35次循環(huán),當(dāng)反應(yīng)條件72℃總延伸,作用時(shí)間7min,4℃保存。
4.2.4 電泳
4.2.4.1 制備2.0%瓊脂糖凝膠板
準(zhǔn)備2%的瓊脂糖(20mL的小橡膠):在一個(gè)圓筒中,將0.4g的瓊脂糖置于其中,再加20mL1xTAE,將小燒杯倒轉(zhuǎn)過(guò)來(lái),在微波爐中加熱三次,直到所有的瓊脂糖都溶解掉,然后把電泳槽關(guān)閉,再加一把梳子,把它放到大約65℃的溫度下攪拌,然后把它仔細(xì)地倒進(jìn)一個(gè)內(nèi)槽玻璃板里,讓它慢慢地?cái)U(kuò)散,一直擴(kuò)散到玻璃凹陷里,在室溫和溫下靜置,直到它徹底凝結(jié),垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中,再把1xTAE的凹陷進(jìn)去,一直到它淹沒(méi)在凹陷里1~2mm。
4.2.4.2 加樣
將5μLPCR反應(yīng)的結(jié)果和0.5μL的加樣緩沖劑混合后,放入瓊脂糖膠片上的加樣口,用10μL微型吸液器把試樣放入膠片上的試樣凹陷處,每次放入一個(gè)試樣后,要重新放入試樣,避免污染,放入試樣時(shí)要注意記錄好放入的次序。
4.2.4.3 電泳
將凝膠板放入后,立刻對(duì)試片上的凝膠板進(jìn)行電流電泳,將電泳器上的蓋子和電極插入,在120伏的電壓下,電泳26min,試片從負(fù)極(黑)到正極(紅),直到BPA顯示的條條游走到2/3的位置,才結(jié)束電泳(以DNA分子量為基準(zhǔn)進(jìn)行電泳)。
4.2.4.4 染膠
在完成電泳后將所述凝膠移除,以0.5μg/mL的1xTAEBrylar為1xTAE,對(duì)其進(jìn)行大約18min的染色,然后用水沖洗9min.
4.2.4.5 觀察照相
將所制備的凝集素置于長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外線燈膠體成像機(jī)和紫外線透光機(jī)上,對(duì)其進(jìn)行紫外透射儀觀察和記錄。
4.2.4.6 判斷片段大小
用分子量標(biāo)準(zhǔn)比較判斷PCR片段大小。
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照顯示421bpHP-PRRSV/511bp美國(guó)型擴(kuò)增帶時(shí),陰性對(duì)照沒(méi)有對(duì)應(yīng)的靶帶,該次檢測(cè)成立,并判定結(jié)果。
待檢樣品RT-PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后,在紫外分析儀下出現(xiàn)了目的性擴(kuò)增條帶,說(shuō)明該養(yǎng)豬場(chǎng)有高致病性豬藍(lán)耳病流行,且病毒呈陽(yáng)性。
5.3.1 RT—PCR結(jié)果判定的影響因素
5.3.1.1 混合感染的影響
在各地表現(xiàn)出相似的臨床表現(xiàn),只不過(guò)是因?yàn)椴《镜淖儺惗a(chǎn)生的。由于在中國(guó)暴發(fā)了這場(chǎng)疫情,在各個(gè)地方都會(huì)出現(xiàn)不一樣的病理學(xué)特征,有些是單一的病毒感染,有些是多種的細(xì)菌組合感染,在進(jìn)行了細(xì)菌學(xué)的檢測(cè)之后,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何由其他細(xì)菌導(dǎo)致的并發(fā)癥。
5.3.1.2 操作過(guò)程中的影響
在進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)時(shí)其中最重要的一步,就是抽取RNA。用變性試劑將組織或細(xì)胞粉碎,再用氯仿等有機(jī)溶劑提取,再進(jìn)行沉淀、洗滌、干燥,最終溶解。RNase普遍且穩(wěn)定性好,能抵抗高壓滅菌、煮沸等環(huán)境條件,且通常無(wú)需輔酶。因此,在RNA制劑中,哪怕是有一點(diǎn)點(diǎn)的RNA酶,都會(huì)導(dǎo)致RNA在生產(chǎn)與分析的過(guò)程中發(fā)生分解,而所生產(chǎn)的RNA的完整性和純度,則會(huì)對(duì)RNA分析的結(jié)果產(chǎn)生直接地影響,因此,RNA的生產(chǎn)與分析的操作具有很大的難度。試驗(yàn)中要注意的問(wèn)題有很多,一是要盡量減少內(nèi)源RNase;此外,還需對(duì)外來(lái)核酸酶進(jìn)行嚴(yán)格地控制。在操作者的手汗、唾液等中發(fā)現(xiàn)了一種外來(lái)的核酸酶,它還可以在粉塵中發(fā)現(xiàn),用于其他分子生物試驗(yàn)的核酸酶也可能引起污染。
5.3.2 如何做好高致病性豬藍(lán)耳病防治工作
預(yù)防高致病性豬藍(lán)耳病必須從推廣科學(xué)飼喂、改進(jìn)飼喂條件、強(qiáng)化綜合性防治、實(shí)施有效的疫苗接種等方面進(jìn)行探討。要做好以下工作。
5.3.2.1 強(qiáng)化飼養(yǎng)的管理
采取“全進(jìn)全出”的飼養(yǎng)方式,夏季要做好防熱、防風(fēng)的工作,冬季則要兼顧室內(nèi)的溫度和空氣流通。大型場(chǎng)一定要對(duì)其進(jìn)行封閉式的管理。
5.3.2.2 科學(xué)免疫
一般情況,育肥豬在24日齡左右,接種一次高致病性豬藍(lán)耳病疫苗,種母豬除了24日齡左右進(jìn)行免疫外,配種前應(yīng)加強(qiáng)一次免疫,種公豬除了在24日齡左右免疫外,間隔6個(gè)月也要進(jìn)行一次免疫。
5.3.2.3 規(guī)范補(bǔ)欄
在購(gòu)買仔豬的時(shí)候,要盡量挑選沒(méi)有發(fā)生疾病的地區(qū),并且要檢查是否有檢驗(yàn)合格的檢驗(yàn)報(bào)告,買回來(lái)之后先進(jìn)行半個(gè)月的隔離,待體溫恢復(fù)正常后,才可以進(jìn)行混群。
5.3.2.4 加強(qiáng)消毒工作
做好養(yǎng)豬場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生工作,用復(fù)合醛類等消毒劑給養(yǎng)殖場(chǎng)、豬舍和周邊環(huán)境消毒,養(yǎng)豬場(chǎng)的糞便要及時(shí)清理干凈。
5.3.2.5 藥物預(yù)防
選用合適的抗菌藥,并且要有一個(gè)科學(xué)地使用方法,這樣才能防止豬的細(xì)菌感染,從而改善豬的身體狀況。
本次試驗(yàn)利用RT-PCR法檢測(cè)豬高致病性藍(lán)耳病,結(jié)果表明此方法檢測(cè)高致病性藍(lán)耳病具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、檢測(cè)時(shí)間短、速度快、受環(huán)境因素影響低、準(zhǔn)確性高、實(shí)用等特點(diǎn),非常適用于基層有條件的獸醫(yī)站等部門進(jìn)行疫病的診斷與檢測(cè)。