喬夢茹 李奉瑾 姚欣雨 張玉萍

據(jù)報道,約2%～4%的孕婦產(chǎn)前超聲提示胎兒異常[1],造成胎兒異常的因素中遺傳因素最重要。遺傳因素所致的胎兒異常出生后常表現(xiàn)為智力障礙、生長發(fā)育遲緩、嚴(yán)重者可致殘疾甚至死亡,給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前,對超聲異常胎兒,可通過產(chǎn)前診斷技術(shù)最大限度的排除遺傳性疾病,降低此類出生缺陷的發(fā)生。染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,能檢測染色體的非整倍體異常及5 Mb以上的染色體結(jié)構(gòu)異常,為32%的超聲異常胎兒明確病因[2]?？截悢?shù)變異測序技術(shù)能檢測出核型分析無法檢測的微缺失和微重復(fù),在染色體核型正常的超聲異常胎兒中額外檢出6%的致病性拷貝數(shù)變異[3],但仍有許多超聲異常胎兒無法明確病因。隨著二代測序技術(shù)的迅速發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn),全外顯子組測序(whole exome sequencing,WES )能在染色體核型分析和拷貝數(shù)變異檢測均未見異常時,將超聲異常胎兒的診斷率提高8%～10%[4]。本文將從WES在產(chǎn)前胎兒超聲異常中的應(yīng)用、局限性及注意事項分別進(jìn)行闡述。

一、WES在產(chǎn)前胎兒超聲異常中的應(yīng)用

1.多系統(tǒng)異常 胎兒多系統(tǒng)異常在表型上往往表現(xiàn)為較大的臨床異質(zhì)性,部分通過常規(guī)遺傳學(xué)檢測方法無法明確病因。近年來,多項研究利用WES在尋找胎兒多系統(tǒng)異常致病基因方面充分展現(xiàn)了其應(yīng)用價值。Lord等[1]對143例多系統(tǒng)畸形胎兒行WES,診斷陽性率達(dá)15.4%(22/143),共涉及20個致病或可能致病性基因變異。Petrovski等[5]的研究發(fā)現(xiàn),WES在胎兒多發(fā)畸形的診斷性遺傳變異約為單發(fā)畸形的3倍(19%vs6%),同時還發(fā)現(xiàn)胎兒畸形數(shù)目越多,基因異常的檢出率越高。同樣,符芳等[6]的研究也表明,多系統(tǒng)異常胎兒WES的陽性檢出率明顯高于單系統(tǒng)異常(19.9%vs12.2%),證實了胎兒多系統(tǒng)異常與基因異常的高度相關(guān)性。因此,對染色體核型分析和拷貝數(shù)變異檢測陰性的多系統(tǒng)異常胎兒,WES可能會為其明確致病基因,預(yù)防遺傳病患兒的出生。

2.骨骼發(fā)育異常 胎兒骨骼發(fā)育異常(skeletal dysplasia,SD)是一類具有臨床異質(zhì)性和表型異質(zhì)性的骨-軟骨發(fā)育異常疾病,SD大多與調(diào)控骨骼發(fā)育的基因突變相關(guān)。張鑫悅等[7]對13例嚴(yán)重肢體短小的胎兒引產(chǎn)后行家系WES,診斷陽性率為76.9%(10/13),涉及的基因包括FGFR3、COL2A1、COL1A1等,其中FGFR3突變與SD關(guān)系最密切,FGFR3與配體成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合,引起受體酪氨酸激酶活化及自身磷酸化,促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化,FGFR3突變可引起受體信號停止轉(zhuǎn)導(dǎo),胞內(nèi)效應(yīng)基因表達(dá)異常,導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖和分化障礙,最終出現(xiàn)各種骨骼發(fā)育畸形[8]。楊科等[9]應(yīng)用WES對15例核型分析及拷貝數(shù)變異檢測陰性的SD胎兒分析,診斷率為10/15,累及的基因除常見的FGFR3、COL2A1基因外,還首次發(fā)現(xiàn)DYNC2H1、WDR35基因與短肋胸廓發(fā)育不良高度相關(guān),豐富了基因致病突變譜和表型譜。因此,WES可以進(jìn)一步識別SD的致病基因,對明確其產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷有重要意義。

3.中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形 胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)畸形是一類由多種因素(遺傳、化學(xué)物、感染等)導(dǎo)致的顱腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。研究表明[10],超過80%的CNS畸形兒經(jīng)染色體核型分析、拷貝數(shù)變異檢測技術(shù)仍未能明確病因,可能與單基因病有關(guān)。Yaron等[10]對86例拷貝數(shù)變異檢測陰性的CNS畸形胎兒行WES,38例存在致病基因變異,診斷率提高了44%。Baptiste等[11]對268例CNS畸形胎兒行WES,發(fā)現(xiàn)37例存在致病或可能致病的基因變異,且在多發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常(19%)和多系統(tǒng)異常(16.7%)的診斷率明顯高于孤立的CNS畸形(7.2%)。因此,對于CNS畸形胎兒,特別是多發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形或合并其他系統(tǒng)異常時,在傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)無法明確病因時更應(yīng)重視WES的檢測。

4.先天性心臟發(fā)育畸形 胎兒先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是最常見的結(jié)構(gòu)畸形,多數(shù)CHD患兒系遺傳因素所致。CHD胎兒中約16%～26%合并染色體異常,約3%～12%與基因變異有關(guān)[12-14]。研究表明NKX2.5、GATA4、TBX5是調(diào)控心臟發(fā)育的關(guān)鍵基因,對心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)、各腔室的形成及維持正常心功能起重要作用[15]。Prendiville等[16]的研究在CHD胎兒中發(fā)現(xiàn)了NKX2.5基因的38個突變位點,在宮內(nèi)主要表現(xiàn)為房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯(lián)癥。許耘紅等[17]的研究顯示,214例CHD患兒中有8例存在GATA4雜合同義突變。此外,當(dāng)CHD合并肢體畸形、腎臟畸形等心外畸形時往往提示存在某些遺傳綜合征,如心手綜合征、歌舞伎綜合征、Alagille 綜合征等,分別涉及TBX5、KMT2D、JAG1、NOTCH2等致病基因[18-19]。因此,WES不僅能提高CHD胎兒的診斷率,當(dāng)懷疑存在某些遺傳綜合征時,還可將WES與傳統(tǒng)的遺傳學(xué)檢測技術(shù)同時進(jìn)行,盡早明確遺傳學(xué)病因。

5.先天性泌尿系統(tǒng)發(fā)育異常 先天性泌尿系統(tǒng)發(fā)育異常(congenital anomalies of the kidney and urinary tract,CAKUT)約占先天性結(jié)構(gòu)畸形的20%～30%[20]?？截悢?shù)變異測序技術(shù)被認(rèn)為是診斷CAKUT的一線檢測技術(shù)。隨著WES在產(chǎn)前診斷中的不斷應(yīng)用,多項研究應(yīng)用WES在4.8%～14%的兒童CAKUT病例中發(fā)現(xiàn)了致病基因變異[21-23],證實了CAKUT與單基因病的相關(guān)性。Lei等[24]通過家系WES對163例CAKUT樣本進(jìn)行分析,診斷陽性率為12.3%(20/163),涉及26個致病或可能致病的基因變異。董敏等[25]在20例超聲提示腎臟囊性病變的胎兒中發(fā)現(xiàn)6例多囊腎,致病基因包括PKD1、PKD2、PKHD1。PKD1、PKD2基因突變引起其編碼的多囊蛋白功能缺陷,多種細(xì)胞信號通路異常導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖,最終表現(xiàn)為多囊腎[26]。Shuster 等[27]對52例孤立性雙側(cè)腎臟回聲增強胎兒行基因檢測發(fā)現(xiàn),15例為常染色體隱性多囊腎,7例為常染色體顯性多囊腎,涉及的基因包括PKD1、PKHD1。因此,WES能提高CAKUT胎兒的致病性變異檢出率,是拷貝數(shù)變異檢測技術(shù)的有效補充。對于拷貝數(shù)變異檢測未見明顯異常的孤立性腎臟回聲增強,也應(yīng)動態(tài)觀察胎兒腎臟發(fā)育情況,必要時需進(jìn)一步行WES排除基因異常。

二、 WES在產(chǎn)前胎兒超聲異常中應(yīng)用的挑戰(zhàn)和局限性

1.產(chǎn)前WES適用人群的選擇 首先,WES在產(chǎn)前診斷中的適用人群目前仍局限于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)的胎兒結(jié)構(gòu)異常,而影像學(xué)醫(yī)師、臨床醫(yī)師對胎兒結(jié)構(gòu)畸形及相關(guān)遺傳學(xué)知識的掌握程度都可能影響WES的納入標(biāo)準(zhǔn)。其次,WES在不同系統(tǒng)胎兒結(jié)構(gòu)畸形的應(yīng)用價值不同,如胎兒多系統(tǒng)畸形、骨骼系統(tǒng)畸形與單基因病的發(fā)生最密切,中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形、心血管畸形次之,而胸部畸形如肺囊腺瘤、隔離肺等與基因的關(guān)系極低,因此應(yīng)個體化對待每一個病例。最后,對于有結(jié)構(gòu)畸形或發(fā)育障礙的不良孕產(chǎn)史的孕婦,產(chǎn)前WES是遺傳學(xué)診斷的一種手段,對此類孕婦,需留存先證者標(biāo)本,行先證者、夫妻二人的家系WES,如無法提供先證者標(biāo)本,但可提供其臨床表型及病歷資料,可通過WES對夫妻二人行隱性基因攜帶者篩查,從而推斷先證者是否是由致病或可能致病基因?qū)е碌慕Y(jié)構(gòu)改變,為下次妊娠的選擇提供理論依據(jù)。

2.產(chǎn)前表型的局限性 WES是基于表型的數(shù)據(jù)分析,產(chǎn)前胎兒影像學(xué)檢查僅能提示有限的結(jié)構(gòu)異常,且有些產(chǎn)前表型不具有特異性,對應(yīng)的疾病譜較寬泛,目前尚缺乏統(tǒng)一的基因型和表型相關(guān)的產(chǎn)前數(shù)據(jù)庫,因此確認(rèn)產(chǎn)前基因型和表型的相關(guān)性極具挑戰(zhàn)。隨著遺傳學(xué)疾病的不斷發(fā)展,對初次WES檢測未明確診斷的先天性結(jié)構(gòu)畸形兒可行新增表型后的二次重分析,從而提高診斷陽性率。臨床醫(yī)師應(yīng)對胎兒期臨床表型進(jìn)行詳細(xì)記錄,并追蹤隨訪至出生后,將出生后的臨床表型、產(chǎn)前表型及基因型進(jìn)行再次對比分析,從而擴(kuò)充基因型-表型產(chǎn)前數(shù)據(jù)庫。

3.WES技術(shù)的局限性 產(chǎn)前WES僅針對具有臨床意義的基因進(jìn)行分析,對于WES發(fā)現(xiàn)的致病或可能致病的變異,仍需一代測序進(jìn)行驗證。WES本身受其測序深度和覆蓋率的影響,不能覆蓋非編碼區(qū)的變異及全部的蛋白質(zhì)編碼序列,無法檢測到所有類型的遺傳變異,如染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常、拷貝數(shù)變異、低水平嵌合體、三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增等。對于“假基因、重復(fù)區(qū)域、高度同源”的基因測序,WES檢測能力有限,表觀遺傳相關(guān)變異也無法檢出。因此,WES陰性結(jié)果尚不能除外所有的遺傳性疾病。

4.產(chǎn)前WES的倫理學(xué)問題 產(chǎn)前WES雖能為部分超聲異常胎兒明確基因診斷,但其引發(fā)的社會倫理學(xué)問題同樣備受關(guān)注。除外嚴(yán)重遺傳性疾病、致死性疾病,對于“非嚴(yán)重性遺傳病”胚胎的去留問題一直存有爭議。一方面,由于存在外顯率及表現(xiàn)度的差異,即使是明確的致病性變異,其癥狀嚴(yán)重程度也有可能不同。另一方面,對于成年期發(fā)病的疾病,患者在發(fā)病前可無任何臨床癥狀,此類胎兒是否需要終止妊娠也存有爭議。因此,在進(jìn)行WES檢測前及檢測后,臨床醫(yī)師應(yīng)充分與孕婦及家屬溝通可能存在的倫理問題,對WES檢測結(jié)果的解讀還應(yīng)積極與多學(xué)科團(tuán)隊共同合作,客觀公正地為孕婦及家屬提供最全面的信息,在充分知情同意下由其權(quán)衡選擇,必要時需啟動倫理委員會共同商討決定。

三、WES在產(chǎn)前胎兒超聲異常中應(yīng)用的注意事項

1.檢測前咨詢:臨床醫(yī)師應(yīng)根據(jù)孕婦及家屬的文化水平提供個體化咨詢,包括告知WES檢測的指征、優(yōu)勢和局限性及替代方案,詳細(xì)告知WES檢測的所有可能結(jié)果、診斷陽性率及檢測后仍無法明確診斷的可能性,同時還應(yīng)告知孕婦及家屬可知情選擇是否報告與檢測目的不相關(guān)的發(fā)現(xiàn)等。最后由孕婦及家屬自主選擇并簽署知情同意書。

2.檢測后咨詢:(1)陽性結(jié)果:臨床醫(yī)師需詳細(xì)向孕婦及家屬解釋基因與疾病的相關(guān)性、疾病的遺傳方式、預(yù)后情況、復(fù)發(fā)風(fēng)險等,對選擇繼續(xù)妊娠的孕婦,可提供宮內(nèi)治療、新生兒科管理等咨詢;對選擇終止妊娠的孕婦,可根據(jù)具體情況提供下次妊娠咨詢,如自然妊娠+產(chǎn)前診斷或胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)+產(chǎn)前診斷。(2)臨床意義未明的變異(VUS):臨床醫(yī)師應(yīng)向患者及家屬解釋與表型相關(guān)的VUS,告知VUS還需結(jié)合父母樣本、家系驗證協(xié)助鑒定檢測結(jié)果[28],VUS還可能根據(jù)數(shù)據(jù)庫的更新及新增表型的出現(xiàn)需進(jìn)行再次評估。(3)陰性結(jié)果:臨床醫(yī)師必須告知陰性結(jié)果仍無法完全排除胎兒患有某種遺傳病的可能性,這與WES的檢測范圍有限、胎兒期表型未完全顯現(xiàn)、臨床數(shù)據(jù)積累不完善等有關(guān),應(yīng)告知其定期數(shù)據(jù)再分析的重要性,必要時可進(jìn)一步行全基因組測序技術(shù)(whole genome sequencing,WGS)。

綜上所述,WES能發(fā)現(xiàn)部分染色體核型分析及拷貝數(shù)變異檢測均無法檢測出的基因異常,在一定程度上彌補了傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的不足。WES由于本身技術(shù)的局限性,仍有部分超聲異常胎兒不能得到明確診斷。WGS能對包括非編碼區(qū)在內(nèi)的整個基因組的DNA序列進(jìn)行檢測,較WES覆蓋的范圍更廣,能進(jìn)一步提高遺傳性疾病的檢出率,但其存在測序成本高、分析周期長、數(shù)據(jù)量龐大、數(shù)據(jù)解讀更困難等問題,并未在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。但我們相信隨著基因檢測技術(shù)及生信分析流程的不斷發(fā)展,產(chǎn)前基因型-表型數(shù)據(jù)庫將會逐步完善,WES及WGS勢必成為產(chǎn)前診斷胎兒遺傳病的重要手段,為產(chǎn)前遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供理論依據(jù)。