孫惠霖,劉建兵,許孟軍,張慶娥,應菲菲,安 寧,李 敏**

[揚州大學醫(yī)學院附屬鹽城婦幼保健院(鹽城市婦幼保健院)a.醫(yī)學遺傳中心;b.產前診斷中心,鹽城 224007]

常染色體三體的胚胎和胎兒流產風險較高,其中15三體占所有三體自然流產的7.6%,是自然流產中最常見的細胞遺傳學異常之一[1]。完全型15三體無生存能力,出生后會因嚴重畸形而過早死亡,關于15三體表型的報道多見于15三體嵌合體。減數(shù)分裂不分離導致的三體自救和胚胎有絲分裂不分離是15三體嵌合體形成的可能原因[2]。由于遺傳背景和臨床表現(xiàn)的廣泛異質性,15三體嵌合體的臨床表型尚未有明確的描述。對已報道的15三體及嵌合體活產兒進行總結,其大多存在嚴重的宮內生長遲緩、多器官畸形、先天性心臟缺陷、顱面畸形和非免疫性水腫等情況[3-4]。胎兒染色體嵌合體的診斷及處理一直是產前遺傳咨詢的難點,及時進行產前診斷可減少此類嚴重出生缺陷的發(fā)生,減輕家庭和社會的經濟壓力及精神負擔。無創(chuàng)胎兒DNA篩查(non-invasive prenatal testing,NIPT)通過檢測孕婦血液中胎兒游離的DNA評估胎兒非整倍體的風險,但仍存在檢測結果與真實核型不一致的情況。本研究應用染色體核型分析、染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)對1例NIPT升級版提示15號染色體異常的孕婦進行產前診斷,并采用熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)對流產物進行鑒定,為15三體嵌合體的產前診斷和遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基本資料 孕婦,34歲,G4P1,平素月經規(guī)律,否認近親結婚,否認家族遺傳病史,否認不良接觸史,本次妊娠無不適。孕16+4周于本中心行產前篩查,經知情同意,自愿選擇NIPT升級版進行產前篩查。后因NIPT升級版報告提示15號染色體異常進行產前診斷及遺傳咨詢,告知羊膜腔穿刺術風險及染色體核型分析與CMA的局限性,簽署知情同意書后,孕20周在超聲引導下行羊膜腔穿刺術。胎兒羊水染色體核型及CMA檢測結果均為15三體嵌合體,建議二次羊膜腔穿刺產前診斷行FISH檢測進一步明確嵌合比例。經遺傳咨詢,充分告知且知情同意下,孕婦及其家屬拒絕二次產前診斷,決定孕23周結束妊娠,拒絕引產胎兒病理檢查,接受取少許羊水及胎盤FISH檢測驗證。本研究經本院倫理會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 經充分知情同意,孕婦行超聲下經腹羊膜腔穿刺術,抽取羊水。為避免母體細胞污染棄最初的1～2mL,留30～40mL羊水。其中20mL細胞培養(yǎng)行染色體核型分析,10mL行染色體微陣列分析。取流產羊水10mL及胎盤組織行FISH檢測驗證。

1.2.2 染色體核型分析 將20mL羊水注入2支無菌離心管,每支10mL,離心后在無菌操作條件下接種于2個培養(yǎng)瓶,在2個培養(yǎng)箱中靜置進行雙線培養(yǎng)。設置培養(yǎng)條件溫度為37℃,CO2濃度為5%～6%。經培養(yǎng)、換液、收獲、制片及G顯帶進行核型分析,計數(shù)20個分裂相,分析5個核型,因嵌合型加大計數(shù)至60個。

1.2.3 染色體微陣列分析 對未培養(yǎng)的10mL羊水進行基因組DNA提取。使用核酸提取磁珠試劑盒(廈門致善),使用高密度SNP芯片Affymetrix CytoScan 750K,對胎兒進行全基因組染色體拷貝數(shù)檢測,應用ChAS(Thermo Fisher,Affymetrix,美國)軟件針對芯片掃描結果。實驗包括質控、酶切、PCR、純化、標記、雜交及掃描等步驟,操作過程嚴格按試劑和儀器操作說明書進行。通過DGV(人群多態(tài)性數(shù)據(jù)庫)、ClinGen(人類基因組變異數(shù)據(jù)庫)、ClinVar(人類基因組變異數(shù)據(jù)庫)、Decipher(疾病數(shù)據(jù)庫)及本地數(shù)據(jù)庫對拷貝數(shù)變異進行評估。

1.2.4 FISH檢測 采用CEP15探針對經處理、變性、雜交、洗滌等操作的羊水及胎盤組織進行熒光原位雜交,在熒光顯微鏡下觀察熒光信號,計數(shù)100個,分析100個。

2 結 果

羊水染色體核型分析結果47,XN,+15[4]/46,XN[56]即胎兒為15三體嵌合體,嵌合比例約為6.67%,見圖1。羊水CMA檢測結果提示未見有臨床意義的雜合性缺失,arr(15)×2～3,15號染色體嵌合型重復(拷貝數(shù)=2～3),即胎兒為15三體嵌合體,嵌合比例約為70%,見圖2。孕23周羊水FISH檢測驗證結果為nuc ish(D15Z1)x3[48]/(D15Z1)x2[52],即為15三體嵌合體,嵌合比例約為48%,見圖3;流產胎盤檢測結果為nuc ish(D15Z1)x3[39]/(D15Z1)x2[61],即為15三體嵌合體,嵌合比例約為39%,見圖4。

圖1 羊水細胞染色體核型A:47,XN,+15;B:46,XN

圖2 羊水CMA檢測分析

圖3 流產羊水FISH檢測A:nuc ish(D15Z1)x3;B:nuc ish(D15Z1)x2

圖4 流產胎盤FISH檢測A:nuc ish(D15Z1)x3;B:nuc ish(D15Z1)x2

3 討 論

目前NIPT已成為我院孕婦產前篩查的常規(guī)項目,全基因組測序技術除可檢測目的染色體的非整倍體(21三體、18三體以及13三體)之外還能發(fā)現(xiàn)其他染色體數(shù)目異?；虿糠秩旧w缺失重復,但陽性預測值較低。孕婦血漿中游離的胎兒DNA主要來源于滋養(yǎng)層或胎盤細胞的凋亡,局限性胎盤嵌合(confined placental mosaicism,CPM)、母體染色體嵌合體、母體腫瘤、母體拷貝數(shù)變異和消失的雙胎等因素均會造成NIPT結果的假陽性[5]。胎盤存在兩種或多種細胞系嵌合而胎兒染色體核型正常即為CPM,這會導致胎兒染色體雖為正常的二倍體而NIPT結果呈陽性,是NIPT假陽性的主要生物學原因[6-7]。羊水細胞包含了來自胚胎三個胚層從未分化的祖細胞到成熟分化的細胞,包括泌尿生殖道、呼吸道和上皮系統(tǒng),含有腎、心、肺、肝和造血細胞系的細胞,能更真實地反應胎兒血漿狀況[8-9]。為排除假陽性,且考慮胎兒15三體嵌合體的可能,我院對該NIPT陽性結果孕婦進一步產前診斷,行侵入性羊水穿刺術進行染色體核型分析和CMA檢測。

染色體核型分析一直被視為產前診斷中判斷胎兒染色體異常與否的“金標準”,但該方法仍存在培養(yǎng)周期長、分辨率較低等不足[10]。此外,細胞培養(yǎng)傾向于促進嵌合體中整倍體細胞的生長,這導致染色體核型分析對低比率的嵌合漏檢,核型分析對嵌合比例的檢測下限約為5%[11]。對未經培養(yǎng)的胎兒絨毛膜或羊水細胞進行CMA檢測周轉時間更短、分辨率更高且能避免細胞培養(yǎng)帶來的影響,但仍存在無法檢測平衡易位,倒位及低比例嵌合等缺點。本研究中使用的750K SNP微陣列對嵌合體的檢測下限達10%[12]。產前染色體嵌合體診斷的原則要求至少兩種檢測技術均檢出嵌合才能確立真性嵌合體[13],細胞遺傳學和分子遺傳學技術聯(lián)合使用可有效避免假性嵌合導致的不必要的產前干預。

經檢測,該胎兒為真性嵌合體,但檢出的三體嵌合比例存在較大差異。嵌合比例會影響患者表型,一般認為非整倍體染色體的嵌合程度與疾病嚴重程度呈正相關,嵌合比例低表型相對溫和,嵌合比例高表型更為嚴重[11,14]。對16例15三體嵌合體胎兒表型的回顧性分析證實上述觀點[15]。準確檢測妊娠期染色體的嵌合比例可有效評估疾病的嚴重程度,便于產前診斷遺傳咨詢中患者及家屬對生育做出更好的知情決定?；仡檶嶒灹鞒毯透黜椨涗浥懦藶椴铄e,對此差異展開分析。優(yōu)勢生長和細胞株變異會導致不同核型的細胞在培養(yǎng)和未培養(yǎng)樣本之間結果不一致[16]。Chen等[17]發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)的羊水經細胞遺傳學和分子遺傳學檢測均顯示為15三體嵌合體,而培養(yǎng)后的羊水經兩種方法均未檢測到15三體,認為羊水細胞中15三體細胞系可能在細胞培養(yǎng)后消失。Wan等[12]對NIPT檢出的8號染色體三體胎兒進行羊水穿刺產前診斷,CMA檢測結果顯示8號染色體三體嵌合比例為40%,而羊水培養(yǎng)分析50個細胞均為正常核型。綜合分析,本研究中46,XN細胞系在羊水細胞培養(yǎng)過程中可能存在優(yōu)勢生長,而凋亡的15號染色體三體細胞仍可被分子生物學技術檢測出,從而出現(xiàn)細胞培養(yǎng)的染色體核型分析檢出15三體嵌合比例僅為約6.67%,而未培養(yǎng)的CMA檢測出嵌合比例約70%。

FISH技術是染色體嵌合體驗證的常用方法。染色體核型分析或CMA結果可協(xié)助FISH技術選擇相應分子生物檢測探針。該技術無須細胞培養(yǎng),將探針與細胞核內的DNA靶序列進行雜交,能更真實地反映細胞嵌合的狀況[18]。流產羊水及胎盤FISH的檢測結果均為15三體嵌合體,羊水中15三體嵌合比例約為48%,胎盤中15三體嵌合比例約為39%,嵌合比例均位于此前染色體核型分析和CMA的比例中間,與我們的推測相符。同為未培養(yǎng)的羊水樣本,孕20周CMA檢測與孕23周FISH檢測出的嵌合比例不同,除考慮檢測技術不同帶來的結果差異,還需考慮孕周增加羊水中脫落細胞的胚層組成變化及三體拯救引起三體嵌合比例逐漸降低。

綜上所述,對產檢過程中NIPT篩查出的15號染色體異常孕婦進行產前診斷時需考慮15三體嵌合體的可能。羊水穿刺聯(lián)合細胞遺傳學染色體核型分析及分子遺傳學CMA進行遺傳檢測可為15三體嵌合體的產前診斷遺傳咨詢提供有效參考。對于終止妊娠的病例,對妊娠產物(如胎盤等)進行FISH檢驗復核可驗證產前診斷的準確性。