仇雪梅,趙明蕊,解曉麗,趙淑芹

(棗莊市婦幼保健院生殖遺傳中心,棗莊 277100)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)為一高度復(fù)雜的內(nèi)分泌和生殖功能障礙性疾病,其發(fā)病率為育齡婦女的5%～10%,是導(dǎo)致無排卵性不育的主要原因。目前PCOS的確切發(fā)病機制尚不明確,過多的雄激素可能是引發(fā)此病的核心要素之一[1-3]。研究表明,卵巢顆粒細胞凋亡增加與PCOS患者卵泡發(fā)育異常密切相關(guān)[4-6]。Ding等[7]研究顯示,PCOS患者外周血單個核細胞中凋亡相關(guān)基因程序性細胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)表達顯著增加,PDCD4高表達與顆粒細胞凋亡相關(guān),并可作為PCOS發(fā)生的獨立危險因素。Lu等[8]認為,PDCD4是治療代謝性疾病的新靶點。本課題組前期研究顯示,高濃度睪酮誘導(dǎo)PDCD4表達上調(diào)和卵巢顆粒細胞凋亡[9]。提示PDCD4在顆粒細胞凋亡及PCOS發(fā)病風險中的重要性。本研究在外周血細胞和體外研究基礎(chǔ)上,探討控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)中PCOS患者卵巢顆粒細胞中PDCD4表達及其與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性,分析血清睪酮(Testosterone,T)水平與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性,以期進一步探討PDCD4及睪酮的臨床意義,從而為提高PCOS患者的臨床結(jié)局提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年10月至2021年11月在棗莊市婦幼保健院生殖中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)助孕的超促排卵周期PCOS患者(28例)和非PCOS患者(40例)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。依據(jù)2003年鹿特丹標準,PCOS的診斷標準為滿足以下3個條件中的2個:(1)排卵少或不排卵;(2)有高雄激素血癥的臨床和生化特征;(3)超聲檢查見多囊性卵巢。同時排除其他可能導(dǎo)致高雄激素的疾病,如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄性激素的腫瘤、Cushing綜合征等。非PCOS患者(對照組)納入標準:月經(jīng)規(guī)律,基礎(chǔ)體溫測試結(jié)果表明有正常排卵,超聲檢查證實卵巢形態(tài)正常,輸卵管和(或)男方因素導(dǎo)致的不孕。排除標準:合并卵巢功能早衰、內(nèi)異癥、高泌乳素血癥、甲狀腺功能異常等;曾行卵巢手術(shù)或放化療;近3個月內(nèi)接受過促排卵治療或服用性激素者。

1.2 方法

1.2.1 COH方案 綜合評估患者情況,選擇適合的常規(guī)促排卵方案,包括患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、竇卵泡數(shù)、基礎(chǔ)性激素水平及血清抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)水平。促性腺激素(gonadotropin,Gn)(果納芬,75IU/支,默克雪蘭諾公司)起始劑量150～225IU/d,并同時監(jiān)測血清黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(Estradiol,E2)和孕酮水平,以調(diào)整Gn劑量。B超監(jiān)測到至少1個卵泡直徑≥18mm時,當天肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)(珠海麗珠公司)5000～10000IU,36h后在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。

1.2.2 優(yōu)質(zhì)胚胎判定 取卵后進行常規(guī)授精,根據(jù)Veeck胚胎分級標準對胚胎進行分級,第2天細胞數(shù)為2～4細胞,第3天細胞數(shù)為6～8細胞,Ⅱ級以上(卵裂球大小均等或基本均等,碎片<20%)的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.2.3 顆粒細胞收集與處理 穿刺卵泡抽取的卵泡液立即于顯微鏡下觀察,拾取卵母細胞-卵冠丘復(fù)合物后,將剩余的卵泡液收集于離心管,1500r/min離心10min。棄上清,用PBS清洗1次,用2mL PBS懸起細胞沉淀,用吸管將其加入具有等體積的淋巴細胞分離液中,2500r/min離心20min。小心吸取懸浮子兩層淋巴細胞液間的顆粒細胞層,收集于新的離心管內(nèi),加5mL PBS溶液清洗,1500r/min離心5min。PBS清洗3次,-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?用于相關(guān)指標檢測。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄與實時定量PCR 顆粒細胞總RNA使用Trizol(Invitrogen Corporation,美國)進行提取。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT-PCR Kit,TakaRa,中國)說明書進行cDNA合成。實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)法應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TakaRa,中國)對PDCD4 mRNA表達進行定量分析。3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,各組mRNA相對表達量應(yīng)用2-△△Ct方法計算?；驍U增引物序列:PDCD4正向引物5'-TGGATGAAAGGGCATTTGAGA-3',反向引物5'-AGCCTTCCCCTCCAATGCTA-3',目標擴增片段大小為164bp;GAPDH正向引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3,反向引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3',目標擴增片段大小為138bp。所有引物均由南京金思特公司合成。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般情況及實驗室結(jié)局 PCOS組和對照組的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)、泌乳素(Prolactin,PRL)和睪酮比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PCOS患者的AMH和基礎(chǔ)LH水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。兩組的Gn用量、Gn時間和HCG注射日子宮內(nèi)膜厚度比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PCOS組的HCG注射日E2值高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚率和卵母細胞利用率比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 PCOS組和對照組基本臨床資料比較

表2 PCOS組和對照組IVF-ET治療結(jié)局比較

2.2 PCOS患者卵巢顆粒細胞PDCD4表達 實時定量PCR法檢測結(jié)果顯示,PCOS組的PDCD4表達略高于對照組,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.804)。見圖1。對照組與PCOS組的平均獲卵數(shù)分別為(15.3±3.3)和(19.6±2.1)。對照組以組內(nèi)獲卵數(shù)均值(15.3)為分界,分為獲卵數(shù)≤15組和獲卵數(shù)>15組。PCOS組獲卵數(shù)組內(nèi)差異較小,未進行亞組分析。結(jié)果顯示,獲卵數(shù)較多的對照組(獲卵數(shù)>15組)及PCOS組的PDCD4相對表達量高于獲卵數(shù)少的對照組(獲卵數(shù)≤15組),但差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖1 qPCR檢測PCOS組和對照組PDCD4 mRNA表達水平

圖2 qPCR檢測不同獲卵數(shù)各組PDCD4 mRNA表達

2.3 PDCD4表達與胚胎質(zhì)量相關(guān)性分析 根據(jù)患者可用胚率分為低可用胚組(可用胚率低于30%)和正?？捎门呓M。結(jié)果顯示,低可用胚組的PDCD4表達高于正?？捎门呓M,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.044)。見圖3。

圖3 qPCR檢測PDCD4 mRNA表達

2.4 睪酮水平與胚胎質(zhì)量相關(guān)性分析 PCOS患者根據(jù)血清睪酮水平分為T<0.7ng/mL組(22例)和T≥0.7ng/mL組(6例)。結(jié)果顯示,高睪酮水平組的正常受精率和卵母細胞利用率低于低睪酮水平組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討 論

PCOS是一種病因復(fù)雜的疾病,一般認為其病因與下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。下丘腦以脈沖的方式分泌促性腺激素釋放激素,脈沖的幅度增大導(dǎo)致患者血液中黃體生成素異常增高,從而促進雄激素的合成和分泌[10]。而FSH分泌被抑制,導(dǎo)致雄激素無法充分轉(zhuǎn)化為雌激素,雄激素的進一步升高阻礙卵泡發(fā)育、封閉卵泡,堆積的發(fā)育不全的小卵泡導(dǎo)致卵巢形成多囊樣改變,無法正常排卵。AMH是一種由卵泡顆粒細胞分泌的激素,其在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育過程中起著重要作用,與卵巢儲備功能密切相關(guān)。PCOS患者中AMH表達明顯升高,可用于PCOS的診斷及療效評估[11-12]。本研究中PCOS組與對照組的年齡、不孕年限、BMI、基礎(chǔ)FSH、E2、PRL和睪酮比較,差異均無統(tǒng)計學意義,PCOS患者的AMH和基礎(chǔ)LH均高于對照組,這與以往關(guān)于PCOS的研究相符。

Eini等[13]研究表明,高雄激素血癥可能通過影響芳烴受體途徑損害卵母細胞的發(fā)育能力。PCOS患者通過輔助生殖技術(shù)可產(chǎn)生形態(tài)正常的MⅡ卵母細胞,但卵母細胞發(fā)育能力和胚胎發(fā)育潛力受到損害[14]。輔助生殖技術(shù)中PCOS患者能否獲得與健康人相當?shù)娜焉锝Y(jié)局,目前研究結(jié)果并不一致,有不少研究報道了COH中PCOS與非PCOS患者臨床結(jié)局的差異。吳曉燕等[15]研究表明,PCOS組的胚胎種植率、臨床妊娠率低于對照組;趙考考等[16]研究顯示,PCOS患者的獲卵數(shù)、正常受精數(shù)高于對照組,組間優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、著床率、臨床妊振率差異無統(tǒng)計學意義;黃劍磊等[17]研究表明,PCOS組的卵母細胞成熟率、正常受精率、可用胚胎數(shù)、可用胚胎率、囊胚形成率均低于對照組。本研究結(jié)果顯示,PCOS組與對照組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、可用胚率和卵母細胞利用率均未見明顯差異;根據(jù)睪酮水平進行亞組分析發(fā)現(xiàn),高睪酮水平組的正常受精率和卵母細胞利用率低于低睪酮水平組,表明睪酮水平對卵子及胚胎質(zhì)量影響的重要性。以往研究結(jié)果不一致可能與睪酮水平不同有關(guān)。

顆粒細胞環(huán)繞于卵母細胞周圍,向卵母細胞供應(yīng)必要的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子,對于卵母細胞的生長發(fā)育至關(guān)重要,與PCOS卵泡發(fā)育異常及該疾病的多種表征有著緊密聯(lián)系。雖然結(jié)論尚未得到證實,但多項研究顯示,PCOS患者卵泡發(fā)育障礙可能與卵巢顆粒細胞凋亡增加有關(guān)。PDCD4基因是在細胞凋亡中因一種表達特異的蛋白質(zhì)而鑒別出來的凋亡促進基因。PDCD4在其確切的細胞作用方面存在一些差異,但其通常被表征為一種抑制細胞周期進展和增殖并促進細胞凋亡的蛋白質(zhì)。最近研究表明,PDCD4是PCOS發(fā)病機制的新參與者[18],其作為miR-16[19]、miR-155[20]及miR-323-3p[21]的靶基因可抑制卵巢顆粒細胞增殖并促進細胞凋亡。推測PDCD4可能通過影響卵巢顆粒細胞的增殖及凋亡在PCOS的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。但是,卵巢顆粒細胞中PDCD4的表達情況尚不清楚。通過對PCOS患者和健康人的外周血單核細胞進行研究,Ding等[7]發(fā)現(xiàn)PCOS患者中凋亡相關(guān)基因PDCD4表達顯著上升。廉紅梅等[22]研究顯示,PCOS患者血清PDCD4表達高于對照組。本課題組前期研究結(jié)果表明,高濃度睪酮導(dǎo)致PDCD4表達增加[23]。本研究結(jié)果顯示,PCOS組與對照組的PDCD4表達無明顯差異,可能與兩組睪酮水平相當及樣本量太小有關(guān)。PCOS患者顆粒細胞中PDCD4表達情況尚需進一步增加樣本量進行研究證實。本研究結(jié)果顯示,低可用胚組的PDCD4表達高于正?？捎门呓M,差異有統(tǒng)計學意義,表明顆粒細胞PDCD4表達對胚胎質(zhì)量有一定的影響。

綜上所述,COH中卵巢顆粒細胞PDCD4高表達與低可用胚率相關(guān),睪酮水平與受精率和卵母細胞利用率密切相關(guān),睪酮水平升高,受精率和卵母細胞利用率降低。這一結(jié)論對于如何改善PCOS患者助孕結(jié)局提供了線索。