趙丹 李尼克 李雯 彭春紅 趙德剛 張湘燕△

(1.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 貴陽(yáng) 550002;2.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)肺臟免疫性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550000;3.貴州醫(yī)科大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550000;4.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550000)

細(xì)菌的外膜蛋白(Outer membrane protein,Omp)廣泛存在于革蘭氏陰性桿菌科中,主要含有外膜蛋白A(Outer membrane protein A,OmpA)、孔蛋白C和F等,是其毒力的主要部分,具有致病性及免疫原性[1]。OmpA是鮑曼不動(dòng)桿菌含量最多的外膜蛋白之一,過(guò)去對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的研究主要集中在耐藥性及免疫原性,但其結(jié)構(gòu)與耐藥性及免疫原性之間的關(guān)系探索相對(duì)較少。為進(jìn)一步確定鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA的生物學(xué)特征,本研究對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA基因進(jìn)行檢測(cè)、測(cè)序分析,預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)等,為進(jìn)一步研究鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA的致病性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株12株(由貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室惠贈(zèng)),鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC17978)購(gòu)于美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.2 主要器材移液槍、高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),DNA Engine PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad公司),凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司),電泳儀(北京六一公司),臺(tái)式恒溫?fù)u床(美國(guó)Thermo公司),細(xì)菌培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司),超純水儀(臺(tái)灣艾柯公司),超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司),VITEK-32全自動(dòng)微生物分析鑒定儀(法國(guó)梅里埃公司)。

1.3 主要試劑LB培養(yǎng)基(英國(guó)Oxoid公司),瓊脂糖(英國(guó)OXOID公司),細(xì)菌DNA提取試劑盒(康維世紀(jì)),2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(Thermo Scientific,#K0221),2×ES Taq MasterMix(康維世紀(jì),CW0690S),DEPC H2O(均來(lái)自天根生化科技有限公司),合成引物購(gòu)及基因測(cè)序(上海生工公司)。

1.4 主要試劑配置50×TAE緩沖液1 L(pH值8.5):Tris 242 g、Na2EDTA·2H2O 37.2 g,加入800 mL的雙蒸水充分混勻,乙酸57.1 mL,加入雙蒸水定容至1 L,室溫保存。10×TBE緩沖液(pH值8.3):Tris 108 g、Na2EDTA·2H2O 7.44 g、硼酸55 g、雙蒸水800 mL,上述溶液充分混勻后,加入雙蒸水定容至1 L,室溫保存。溴乙錠(工作濃度0.5 g/mL):10 mg/mL溴乙錠1 g,雙蒸水100 mL,充分混勻,轉(zhuǎn)移至棕色瓶中,室溫避光保存。氨芐青霉素(Amp)(5 mL):Amp 0.5 g,ddH2O 5 mL,充分混勻、過(guò)濾,分裝于1.5 mL EP管中(每支200 μL),于-20 ℃保存。卡拉霉素(Kan)(5 mL):Kan 0.5 g,ddH2O 5 mL,充分混勻、過(guò)濾,分裝于1.5 mL EP管中(每支200 μL),于-20 ℃保存。

1.5 方法

1.5.1 菌株培養(yǎng)本研究所用鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株12株,為貴州省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室臨床分離惠贈(zèng),采用VITEK-compact2全自動(dòng)微生物鑒定藥敏系統(tǒng),紙片擴(kuò)散法及E-test條藥敏試驗(yàn),藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果解釋參照美國(guó)CLSI標(biāo)準(zhǔn)(Clinical and Laboratory Standards Institute,2010),并用標(biāo)準(zhǔn)菌株做藥敏質(zhì)量控制,剔除同一患者重復(fù)分離的相同細(xì)菌。無(wú)菌操作臺(tái)滅菌30 min后,75%酒精棉球消毒包括手在內(nèi)的所有物品;用滅菌接種環(huán)蘸取1環(huán)菌液LB培養(yǎng)平板24 h;挑單克隆菌,放入3 mL LB培養(yǎng)基中,于37 ℃振搖培養(yǎng)12～16 h(150 r/min);經(jīng)洗滌、懸浮后繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,再用新鮮LB懸浮至OD600為0.05。

1.5.2 OmpA基因及鮑曼不動(dòng)桿菌管家基因DNA擴(kuò)增將復(fù)蘇好的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株菌液各取200 μL,12 000 r/min,離心2 min收集沉淀的菌體,用含有400 mg/L溶菌酶的100 μL TE緩沖液懸浮菌體。采用 Genbank中的OmpA基因序列設(shè)計(jì)并合成DNA引物,擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌7個(gè)管家基因gltA,gyrB,gdhB,recA,cpn60,gpiF,rpoD(Bartual SG,2005),見(jiàn)表1。將DNA模板、Primer Mix、dNTP mix、DTT、RT Buffer、HiFi Script和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。配置反應(yīng)體系,總體積為20 μL,dNTPmix,2.5 mM Each 4 μL,Primer Mix 2 μL,RNA Template X μL,5XRT Buffer 4 μL,DTT,0.1 M 2 μL,Taq DNA Polymerase,BPI 200 μL 1μL,加入RNase-Free Water至20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃,5 min;95 ℃,40 s,56 ℃,40 s,72 ℃,1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃,10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于-80℃保存。

表1 PCR擴(kuò)增管家基因及OmpA基因引物

1.5.3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳按照瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最佳分辨范圍,采取1%濃度制膠,即1.8 g瓊脂糖加入180 mL雙蒸水于錐形瓶中微波爐加熱溶解,使溶液冷卻至50～60 ℃左右,加入溴乙錠溶液(終濃度0.5 μg/mL),并充分混勻。將瓊脂糖溶液倒入插上齒梳的制膠模中,小膠倒入25～30 mL左右瓊脂糖溶液,大膠倒入60～70 mL左右瓊脂糖溶液。室溫下放置30 min至1 h,待膠凝固。上樣,取于PCR反應(yīng)產(chǎn)物4 μL與20 μL 6×上樣緩沖液混勻,用微量移液槍取20 μL小心加入樣品槽中。電泳:加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源,控制電壓保持在110 V,電流在40 mA以上。當(dāng)條帶移動(dòng)到距離前沿約2 cm時(shí)(約40 min),停止電泳。紫外線下拍照并觀察。

1.5.4 PCR產(chǎn)物回收將目的基因DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下,放入干凈的離心管、稱質(zhì)量。加入等倍體積溶液PN,50 ℃水浴至膠塊完全溶解。將所得溶液加入500 μL平衡液BL處理的吸附柱CA2中,室溫5 min,12 000 r/min,離心30～60 s,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管。加入600 μL漂洗液PW,12 000 r/min,離心30～60 s,倒掉廢液,將吸附柱放回收集管,重復(fù)清洗1次。12 000 r/min,離心2 min,棄去廢液,室溫晾置數(shù)分鐘,轉(zhuǎn)入新的離心管,吸附膜中間懸空滴加30 μL ddH2O,室溫5 min,12 000 r/min,離心2 min,得到DNA溶液。反應(yīng)產(chǎn)物于-80℃保存。

1.5.5 鮑曼不動(dòng)桿菌MLST基因分析分別擴(kuò)增12株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌的7個(gè)管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD,多位點(diǎn)序列分型(MLST)引物參照鮑曼不動(dòng)桿菌的MIST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/abaumanni/),擴(kuò)增產(chǎn)物雙向測(cè)序由上海生工生物工程公司進(jìn)行第二代高通量測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與鮑曼不動(dòng)桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析(http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst＿abaumannii＿seqdef),獲得每個(gè)等位基因的數(shù)值,然后將每株細(xì)菌按照的順序排列成等位基因譜,對(duì)每株細(xì)菌進(jìn)行序列分型及SNP分析。

1.5.6 OmpA的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及跨膜結(jié)構(gòu)分析擴(kuò)增12株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白OmpA基因,DNA產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。OmpA的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(https://swissmodel.expasy.org/interactive)、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

2 結(jié) 果

2.1 臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌管家基因鑒定及MLST分型12株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌管家基因擴(kuò)增,見(jiàn)圖1。7個(gè)管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpiF和rpoD的PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)測(cè)序比對(duì)后顯示,12株鮑曼不動(dòng)桿菌主要可分為6個(gè)ST型(ST 208,1-3-3-12-2-96-3;ST 229,1-3-3-12-2-94-3;ST 191,1-3-3-12-2-94-3;ST 195,1-3-3-12-1-96-3;ST 540,1-3-3-12-1-96-3;ST 1145,1-3-3-12-2-94-3),如表2所示。12株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌管家基因的MLST分析有24個(gè)SNP位點(diǎn),主要集中cpn60及gpiF基因,見(jiàn)表2及圖2。

注:A.gltA 基因DNA電泳條帶;B.gyrB基因DNA電泳條帶;C.gdhB基因DNA電泳條帶;D.recA基因DNA電泳條帶;E.cpn60基因DNA電泳條帶;F.gpiF基因DNA電泳條帶;G.rpoD基因DNA電泳條帶。

圖2 12株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌SNP位點(diǎn)分析

表2 12株鮑曼不動(dòng)桿菌的MLST基因及構(gòu)成比(%)

2.2 臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA DNA表達(dá)水平12株鮑曼不動(dòng)桿菌均檢測(cè)到OmpA基因,分子量為1 070 bp ,見(jiàn)圖3。

注:從上到下分子量依次為2 500、2 000、1 500、1 000、800、200 bp,其中1 000 bp加亮。

2.3 鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析OmpA基因測(cè)序序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提有6種三級(jí)結(jié)構(gòu),均由β-桶狀結(jié)構(gòu)組成的保守結(jié)構(gòu)域,見(jiàn)圖4。

圖4 鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA基因三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析OmpA基因測(cè)序序列進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為跨膜蛋白,見(jiàn)圖5。

圖5 鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于自然界,具有生存及侵襲能力強(qiáng)等特點(diǎn),能在各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛流行,是一種重要的條件致病菌,在免疫力較低及長(zhǎng)期大量使用抗生素的患者中感染率尤其高,可引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎及皮膚、泌尿系、傷口及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等感染。由于地域不同、醫(yī)院治療方案不同及環(huán)境消毒的差別,鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床特征及耐藥情況不同[2]。MLST分型可獲得等位基因圖譜,有群體遺傳學(xué)分析的功能,且能夠準(zhǔn)確提供菌種評(píng)估的信息,是目前臨床中監(jiān)控鮑曼不動(dòng)桿菌傳播的常用方法[3]。多位點(diǎn)序列分型(sequencetype,ST)是測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌7個(gè)管家基因的部分DNA序列,根據(jù)每一序列的特異性賦予一個(gè)特定的等位基因編號(hào),每一菌株7個(gè)管家基因的7個(gè)特異性編號(hào)即構(gòu)成該菌株的序列型,根據(jù)ST分型發(fā)現(xiàn)菌株的變異[4]。本研究擴(kuò)增了12株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpiF及rpoD,通過(guò)MLST分型結(jié)果12株菌株中的6個(gè)ST分型均已公布,未發(fā)現(xiàn)變異菌株,其中4株為ST 208,3株為ST 229,2株為ST 191,在ST 195、ST 540和ST 1 145中,分別各1株。本研究結(jié)果以ST 208為主,SNP等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示其SNP突變不多,主要在cpn60及gpir基因中,與既往研究結(jié)果一致[5]。

Omp是革蘭氏陰性菌的主要成分,大約占外膜結(jié)構(gòu)的50%左右,其位于細(xì)菌膜表面或鑲嵌其中,主要以磷脂組成內(nèi)層結(jié)構(gòu),以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)組成的外層結(jié)構(gòu)所組成。Omp主要起到維持細(xì)菌外膜完整性、阻隔細(xì)菌等外界物質(zhì)入侵,同時(shí)因其是一個(gè)重要的膜孔蛋白[6],通過(guò)外膜小泡分泌和傳遞致病因子給宿主細(xì)胞,在細(xì)菌對(duì)宿主的感染及致病過(guò)程中具有重要的病理生理作用[7-9],目前該蛋白已逐漸成為鮑曼不動(dòng)桿菌的研究熱點(diǎn)。鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA是一個(gè)分子量大小為38 kD,氨基酸保守性>99%的蛋白質(zhì),因此菌種間蛋白差異較小,是目前功能研究最確定的毒力因子[10],本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA基因片段的核苷酸序列長(zhǎng)度為1 070 bp,與GeneBank中序列相一致,與張欣等[11]和E.H.Kawther等[12]研究外膜蛋白OmpA核苷酸序列結(jié)果相一致。在分離的12株臨床菌株中都有OmpA基因的表達(dá),說(shuō)明外膜蛋白的氨基酸序列高度保守。

OmpA由N-端及C-端兩個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域組成,N-端為β-桶狀跨膜蛋白區(qū)域,為170殘基、八鏈、反向平行的β-桶狀結(jié)構(gòu),模擬的晶體結(jié)構(gòu)可見(jiàn)β-鏈相對(duì)于桶軸平均呈450傾斜,圓桶橫截面直徑為26A,長(zhǎng)為57A,這些短鏈被連接在細(xì)胞質(zhì)邊上,更多以環(huán)狀連接在細(xì)胞膜外。鮑曼不動(dòng)桿菌的OmpA包含三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:N端信號(hào)肽、β-桶狀結(jié)構(gòu)和C端OmpA樣結(jié)構(gòu)域,模擬的晶體結(jié)構(gòu)可見(jiàn)β-鏈相對(duì)于桶軸平均呈450傾斜。N-端β-桶狀跨膜蛋白區(qū)域具有線粒體定位信號(hào)序列,C-端的細(xì)胞周質(zhì)區(qū)為OmpA樣區(qū)域,由150殘基組成,以球狀附著在細(xì)胞質(zhì)的間隙[13]。OmpA樣區(qū)域是一個(gè)保守序列,富含OmpA相關(guān)的外膜蛋白和MotB蛋白,在結(jié)合肽聚糖層和肽聚糖相關(guān)磷脂(diaminopimelate,DAP)時(shí)具有重要功能,保持外膜蛋白整體的完整性并調(diào)控外膜蛋白的產(chǎn)生[13],C-端細(xì)胞周質(zhì)區(qū)域具有細(xì)胞核定位信號(hào)序列。本研究將鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA比對(duì)Pubmed上三級(jí)空間結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種β-桶狀結(jié)構(gòu),具有維持細(xì)胞的形狀和穩(wěn)定性作用,同時(shí)也參與生物膜的形成、細(xì)菌黏附、侵襲宿主細(xì)胞、鐵蛋白的獲取和免疫逃逸等過(guò)程。OmpA蛋白跨膜分析屬于跨膜蛋白,與既往的研究結(jié)果一致[14]。但其跨膜的同時(shí),中心形成膜孔,可以將復(fù)合物從細(xì)胞周質(zhì)泵出細(xì)胞外,與內(nèi)膜蛋白流出泵系統(tǒng)配對(duì),參與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的產(chǎn)生[15]。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展,當(dāng)前對(duì)OmpA的研究更加深入。既往的研究發(fā)現(xiàn)Omps在許多細(xì)菌中為有效抗原,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),具有作為亞單位疫苗的潛力,因此有報(bào)道[16-18]將OmpA原核表達(dá)、純化作為疫苗運(yùn)用。鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA的結(jié)構(gòu)相對(duì)保守,維持細(xì)胞的形狀和穩(wěn)定性的同時(shí),參與細(xì)菌耐藥機(jī)制,同時(shí)有望成為免疫疫苗運(yùn)用于臨床中。

利益沖突說(shuō)明/Conflict of Intetests

所有作者聲明不存在利益沖突。

倫理批準(zhǔn)及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通過(guò)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫預(yù)審字[2019]090號(hào)),為微生物實(shí)驗(yàn)研究,故知情同意免除。