黃景鴻 張蕾 張偉 梁偉華 蔣金芳 鄭志紅 潘澤民 李冬妹

摘要：目的 探索長鏈非編碼RNA 人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）協(xié)同真核翻譯起始因子4A1（human eukaryotic translation initiation factor4A1，EIF4A1）促進(jìn)人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖與遷移能力的作用。方法 使用Western Blot檢測EIF4A1、real time-PCR檢測PVT1在胃癌細(xì)胞（SGC-7901、NCI-N87、MGC-803、BGC-823）和正常胃黏膜細(xì)胞（GES-1）中的表達(dá)量。單獨或共同過表達(dá)胃癌細(xì)胞SGC-7901中的PVT1和EIF4A1，EIF4A1的蛋白表達(dá)量使用免疫印跡法檢測，PVT1的表達(dá)水平使用real time-PCR檢測，采用劃痕實驗和Transwell實驗檢驗細(xì)胞的遷移能力，采用MTT實驗和平板克隆形成法檢驗細(xì)胞的增殖情況，采用免疫印跡法檢測E-cadherin，N-cadherin，smad3和TGF-β蛋白表達(dá)量。結(jié)果 以正常胃黏膜細(xì)胞作為對照，篩選有統(tǒng)計學(xué)差異的PVT1和EIF4A1的本底表達(dá)量低的胃癌細(xì)胞（P＜0.05）。單獨或共同過表達(dá)胃癌細(xì)胞中PVT1和EIF4A1后，共同過表達(dá)組平板克隆形成數(shù)為492±8.72，單獨過表達(dá)PVT1組平板克隆形成數(shù)為251±1.53，單獨過表達(dá)EIF4A1組平板克隆形成數(shù)為228±1.52，對照組平板克隆形成數(shù)為205±2.08。在MTT實驗中，共同過表達(dá)組OD值高于單獨過表達(dá)組和對照組。Transwell結(jié)果顯示共同過表達(dá)組遷移細(xì)胞數(shù)為308±29.10，單獨過表達(dá)PVT1組遷移細(xì)胞數(shù)為222±14.42，單獨過表達(dá)EIF4A1組遷移細(xì)胞數(shù)為206±10.58，對照組遷移細(xì)胞數(shù)為169±18.04。劃痕實驗結(jié)果提示共同過表達(dá)組傷痕愈合速率高于單獨過表達(dá)組和對照組。免疫印跡結(jié)果說明共同過表達(dá)組E-cadherin低于單獨過表達(dá)組和對照組，共同過表達(dá)組N-cadherin、smad3和TGF-β高于單獨過表達(dá)組和對照組。以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論 過表達(dá)PVT1和EIF4A1可以協(xié)同促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖能力，并通過改變EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移能力。

關(guān)鍵詞：胃癌；PVT1；EIF4A1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

中圖分類號：R34中圖分類號文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Study on the effect of ectopic expression of LncRNA PVT1/EIF4A1 on the

proliferation and migration of gastric cancer cells

HUANG? Jinghong1，ZHANG? Lei2，ZHANG? Wei3，LIANG? Weihua1，JIANG? Jinfang1，

ZHENG? Zhihong1，PAN? Zemin1，LI? Dongmei1*

（1 School of Medicine/Key Laboratory of Xinjiang Ministry of Education， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832002， China;

2 The First

Affiliated Hospital， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832002， China;

3 Emergency General Surgery Department， Shihezi People′s Hospital， Shihezi，Xinjiang 832002， China）

Abstract： Objective Explore the effect of long non-coding RNA human plasmacytoma variant translocation 1 （PVT1） and human eukaryotic translation initiation factor4A1 （EIF4A1） on the proliferation and migration of gastric cancer （GC） cell SGC-7901. Methods Used Western Blot to detect EIF4A1 and real time-PCR to detect PVT1 in GC cells （SGC-7901， NCI-N87， MGC-803， BGC-823） and normal gastric mucosal cells （GES-1）. Ectopic expressed PVT1 and EIF4A1 in GC cell SGC-7901 individually or together. Used Western Blot to detect the protein expression of EIF4A1. And used real time-PCR to detect the expression level of PVT1. Detected the migration ability of cells by the scratch test and the transwell assay. The proliferative ability of the cells was detected by the MTT and the clone formation assay. And the protein level of E-cadherin， N-cadherin， smad3 and TGF-β was detected by Western Blot. Results GC cells with low background expression of PVT1 and EIF4A1 were screened， and there was a statistical difference （P<0.05）. After ectopic expression of PVT1 and EIF4A1 individually or jointly， the number of plate clone formation in the co-ectopic expression group was 492±8.72. The number of plate colonies formed in the PVT1 ectopic expression group alone was 251±1.53. And that in the EIF4A1 ectopic expression group and control group was 228±1.52 and 205±2.08 respectively. In MTT assay， the OD value of co-ectopic expression group was higher than that of individual ectopic expression group and control group. In the transwell assay， the number of migrated cells of the co-ectopic expression group was 308±29.10， and in the PVT1 ectopic expression group， EIF4A1 ectopic expression group and control group was 222±14.42， 206±10.58， and169±18.04 respectively. Cell scratch tests showed the wound healing rate in the co-ectopic expression group was higher than that in the individual ectopic expression group and the control group. The results of Western Blot showed that E-cadherin in the ectopic expression group was lower than that in the ectopic expression group and control group. N-cadherin， smad3 and TGF-β in the ectopic expression group were higher than those in the individual ectopic expression group and control group. All of these results were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Ectopic expression of PVT1 and EIF4A1 can promote the proliferation ability and migration ability of SGC-7901 cells by altering the expression of EMT related proteins.

Key words： gastric cancer;PVT1;EIF4A1;cell proliferation;cell migration

胃癌死亡率在世界腫瘤死亡率中排名第三［1］，我國胃癌死亡率占世界40%［2］，很多患者就診時已經(jīng)發(fā)展到中晚期，造成患者死亡的重要原因是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［3］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種調(diào)節(jié)性RNA，在組織中PVT1表達(dá)具有特異性。lncRNA 影響細(xì)胞分化、運動等生命過程，其機制涉及與蛋白質(zhì)的相互作用［4］，可以是指引核糖核蛋白體定位；結(jié)合并激活目標(biāo)蛋白質(zhì)；也可以和蛋白質(zhì)互為分子支架協(xié)同發(fā)揮作用［5］，由于lncRNA影響多基因表達(dá)，腫瘤發(fā)生發(fā)展又是多基因變異的復(fù)雜過程，因此對lncRNA和其關(guān)鍵分子的干預(yù)將起到網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)作用，在腫瘤靶向治療中可能具有更加明顯的效果，是比較理想的候選靶點，近年來已被廣泛關(guān)注。

LncRNA 人漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因 1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）在人類染色體8q24上［6］，位于癌基因MYC上游的癌相關(guān)區(qū)域。PVT1在多種腫瘤中異常過表達(dá)，是近年來LncRNA相關(guān)研究的熱點。PVT1可以直接調(diào)節(jié)RNA、DNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)［7］。PVT1在一些腫瘤中高表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡過程［8］。同時，PVT1可被EIF4A3穩(wěn)定，從而促進(jìn)肺癌的增殖與遷移侵襲能力［9］。此外，PVT1還起到了調(diào)控下游基因和途徑的作用。例如在肺癌中，PVT1可將EZH2募集到LAST2啟動子區(qū)域并抑制非小細(xì)胞肺癌患者LAST2的表達(dá)［10］，PVT1也可通過與miR-128內(nèi)源性競爭來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子C的表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移行為［11］。與之類似的是：在胃癌細(xì)胞中，PVT1通過招募EZH2和STAT3來調(diào)節(jié)P15/P16和VEGFA的表達(dá)［12］。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，PVT1與胃癌的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)。真核翻譯起始因子4A1（human eukaryotic translation initiation factor4A1，EIF4A1）可能被PVT1 招募結(jié)合并可能造成其下游的蛋白質(zhì)的翻譯失控［13-14］。

EIF4A1是RNA 解旋酶［15］，可通過調(diào)控mRNA 5′端非翻譯區(qū)參與翻譯的起始階段［16］。研究證明，翻譯失調(diào)是腫瘤發(fā)生和發(fā)展中直接控制癌癥基因選擇性翻譯和蛋白質(zhì)合成的重要步驟［17］，EIF4F翻譯起始復(fù)合體在PI3K/Akt/mTOR信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和依賴半胱天冬酶的細(xì)胞凋亡通路的調(diào)控下，作為翻譯起始的關(guān)鍵節(jié)點，控制著許多癌基因的mRNA的翻譯起始階段［18］。EIF4A1作為EIF4F的重要組成部分，在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程和胃癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用，已證實在增殖活躍的細(xì)胞中，EIF4A1 的表達(dá)水平高［19］，并且也觀察到EIF4A1 與腫瘤的遷移侵襲有關(guān)［20］，最近的研究表明EIF4A1在胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、乳腺癌和黑色素瘤等癌癥中的表達(dá)呈現(xiàn)異常情況［21］。依賴于ATP的RNA解旋酶EIF4A1活性較低，其解旋酶功能很大程度上依賴于其結(jié)合伴侶的刺激，而單鏈RNA 的結(jié)合能夠在很大程度上刺激EIF4A1的活性［22］。在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，EIF4A1和PVT1 在胃癌中表達(dá)水平上調(diào)且能相互作用，并與胃癌的進(jìn)展相關(guān)［23］。但PVT1與EIF4A1通過何種機制參與胃癌發(fā)生發(fā)展，是今后研究的重要方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PVT1引物（F：5-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3;R：5- AGAGCACCAAGAC TGGCTCT-3），N-cadherin抗體（Proteintech），E-cadherin抗體（Affinity），Smad3抗體（Affinity），TGF-β抗體（Affinity），EIF4A1抗體（Bioss），Lipofectamine 3000（Invitrogen）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞系SGC-7901、NCI-N87、MGC-803、BGC-823和GES-1在37℃下，5%二氧化碳濃度的培養(yǎng)箱中，在添加90% DMEM培養(yǎng)液和10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 實時熒光定量PCR反應(yīng)（real-time PCR）

提取細(xì)胞中的總RNA，低溫、無酶的提取環(huán)境。RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄檢測試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，再按反應(yīng)體系進(jìn)行加樣，反應(yīng)體系來源于real-time PCR試劑盒。RT-PCR反應(yīng)程序設(shè)定為：程序循環(huán)40次，預(yù)熱90 ℃反應(yīng)時間 5 min，95 ℃反應(yīng)時間為15 s、55℃反應(yīng)時間為25 s、72 ℃反應(yīng)時間為10 s。計算RNA的相對表達(dá)量的方法為2-△△Ct（Fold-change）。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）

提取細(xì)胞中的總蛋白，按照蛋白液體量的1/3加入4×loading buffer?；靹蚝笤?00℃下金屬浴10min。制備SDS-PAGE凝膠，電壓80V電泳30min后設(shè)定電泳電壓為110V，繼續(xù)電泳1h。電轉(zhuǎn)電壓設(shè)定為110V，電轉(zhuǎn)時間為60min。配制濃度為5%的脫脂奶粉常溫封閉2h。一抗（1∶500）孵育12h，溫度設(shè)定為4℃。3次TBST清洗（10min·次-1）。室溫下二抗孵育2h，3次TBST清洗（10min·次-1），化學(xué)發(fā)光儀下，用ECL超敏發(fā)光液曝光。

1.2.4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

采用pcDNA3.1載體于上海吉瑪公司構(gòu)建合成人PVT1和EIF4A1過表達(dá)質(zhì)粒，即pcDNA3- PVT1過表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3- EIF4A1過表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后使用。轉(zhuǎn)染過程為將6孔板提前一天接種胃癌細(xì)胞SGC-7901，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%且均勻貼壁。

準(zhǔn)備無菌EP管兩支，減血清的DMEM培養(yǎng)基100μL加入兩EP管中，一支加入6μlLipo3000；另一只加入2μg質(zhì)粒與4 μLP3000 。兩者靜置10min后混合，輕輕混勻，靜置15 min。將此混合液加入提前添加0.8mL減血清 DMEM培養(yǎng)基的六孔板中，轉(zhuǎn)染48h后，更換普通培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染。

1.2.5 MTT 實驗

在96孔板中每組設(shè)置5個復(fù)孔，每孔接種2 000個已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)5 d。0h為第一次加入MTT試劑的時間，每24h將20μL MTT 試劑加入孔內(nèi)，孵育 4 h在37℃下，停止培養(yǎng)，使得MTT與細(xì)胞生長所產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶充分反應(yīng)。孔中的液體吸棄，二甲基亞砜（DMSO）150 μL加入每孔，OD值在490nm下測定。

1.2.6 平板克隆形成實驗

在6孔板中每孔接種1 000個已轉(zhuǎn)染細(xì)胞后正常培養(yǎng)，每48h棄去舊培養(yǎng)基，添加新的培養(yǎng)基。培養(yǎng)細(xì)胞克隆生長14 d后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基終止培養(yǎng)。清洗細(xì)胞1次，固定液固定 30 min，染色液染色30 min，蒸餾水清洗、待干后鏡下觀察，計數(shù)細(xì)胞數(shù)超過50個的集落。

1.2.7 Transwell遷移實驗

用PBS清洗已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，遷移小室中加入2×104個已轉(zhuǎn)染細(xì)胞，添加純DMEM培養(yǎng)基將小室內(nèi)細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104個/200μL。600μL完全培養(yǎng)基添加至24孔板下室。24h后，清洗遷移小室，固定液30min固定，染色液30 min染色，雙蒸水漂洗去除染液，晾干，鏡下觀察，計數(shù)。

1.2.8 劃痕實驗

于6孔板轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，用1 000μL槍頭劃三道均勻分布的豎線，PBS清洗去除孔內(nèi)脫落的細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，以劃痕時間為0h，每24h在相同位置顯微鏡下拍照，軟件計算愈合面積。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

使用 SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，四組（單獨過表達(dá)PVT1、單獨過表達(dá)EIF4A1、共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1、NC）實驗結(jié)果、real-time PCR的RNA相對表達(dá)量、Western Blot的蛋白掃描灰度值、平板克隆實驗的細(xì)胞克隆計數(shù)結(jié)果、MTT實驗的OD值、傷痕愈合實驗的愈合面積、Transwell遷移實驗的穿膜細(xì)胞數(shù)，均采用t檢驗比較，P值<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞及正常胃黏膜細(xì)胞中PVT1及EIF4A1的表達(dá)情況

Real-time PCR和Western blot分別檢測SGC-7901、NCI-N87、MGC-803、BGC-823 4種胃癌細(xì)胞及正常胃黏膜細(xì)胞中PVT1和EIF4A1的表達(dá)量。結(jié)果顯示：SGC-7901中PVT1的表達(dá)量顯著低于GES-1細(xì)胞，而SGC-7901的EIF4A1表達(dá)量也顯著低于其他3種胃癌細(xì)胞（P＜0.05）（圖1）。因此，選擇SGC-7901開展后續(xù)實驗研究。

2.2 檢測單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1后的過表達(dá)效率

在SGC-7901胃癌細(xì)胞中單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1，轉(zhuǎn)染成功后采用real-time PCR和Western blot分別檢測PVT1和EIF4A1的表達(dá)量。結(jié)果顯示：單獨過表達(dá)PVT1組的PVT1在RNA水平上顯著高于NC組（P<0.05）（圖2A），單獨過表達(dá)EIF4A1組的EIF4A1在蛋白水平上顯著高于NC組（P<0.05）（圖2B，圖2C）。

共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1組的PVT1在RNA水平上顯著高于單獨過表達(dá)PVT1組（P<0.05）（圖2A），共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1組的EIF4A1在蛋白水平上顯著高于單獨過表達(dá)EIF4A1組（P<0.05）（圖2B，圖2C）。

2.3 單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1對細(xì)胞增殖能力的影響

采用MTT法測定NC組、單獨過表達(dá)PVT1組、單獨過表達(dá)EIF4A1組和共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1組的細(xì)胞活力，檢測細(xì)胞增殖能力通過平板克隆實驗。MTT實驗結(jié)果：共同過表達(dá)組OD值高于單獨過表達(dá)組和對照組（圖3A），平板克隆實驗結(jié)果：共同過表達(dá)組平板克隆形成數(shù)為492±8.72，單獨過表達(dá)PVT1組平板克隆形成數(shù)為251±1.53，單獨過表達(dá)EIF4A1組平板克隆形成數(shù)為228±1.52，對照組平板克隆形成數(shù)為205±2.08（圖3B，圖3C），以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1對細(xì)胞遷移能力的影響

用劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1后SGC-7901細(xì)胞的

遷移能力，Transwell遷移實驗結(jié)果：共同過表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)為308±29.10，單獨過表達(dá)PVT1組遷移? 細(xì)胞數(shù)為222±14.42，單獨過表達(dá)EIF4A1組的遷移細(xì)胞數(shù)為206±10.58，對照組遷移細(xì)胞數(shù)為169±18.04（圖4A，圖4B）。傷痕愈合實驗結(jié)果顯示：共同過表達(dá)組傷痕愈合速率高于單獨過表達(dá)組和對照組（圖4C，圖4D）。以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

A：Transwell遷移實驗結(jié)果; B：Transwell遷移實驗量化結(jié)果; C：劃痕實驗結(jié)果; D：劃痕實驗量化結(jié)果注：本圖中共同過表達(dá)組與單獨過表達(dá)組進(jìn)行對比，單獨過表達(dá)組與對照組進(jìn)行對比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 1。圖4 細(xì)胞遷移能力檢測

2.5 單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1后E-cadherin，N-cadherin，smad3和TGF-β蛋白表達(dá)水平

用Western Blot檢測單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1后E-cadherin，N-cadherin，smad3和TGF-β蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：共同過表達(dá)組E-cadherin的表達(dá)量低于單獨過表達(dá)組和對照組，共同過表達(dá)組N-cadherin、smad3和TGF-β的表達(dá)量高于單獨過表達(dá)組和對照組。以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。

3 討論

根據(jù)最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，癌癥死亡率近年來持續(xù)下降，但它仍然是全球第二大死亡原因［24］，基因水平的變化包括基因突變、擴增、缺失、DNA甲基化和插入突變。腫瘤發(fā)生的重要因素是抑癌基因失活和癌基因異常激活［25］?？偦蚪M中，非編碼基因占的比例約為98%，這些基因負(fù)責(zé)絕大多數(shù)腫瘤的發(fā)生［7］。LncRNA可以同時與同一空間中的多個因子結(jié)合，整合抑制效應(yīng)元件和活性效應(yīng)元件的信息而發(fā)揮作用。LncRNA可以充當(dāng)誘餌，直接與蛋白質(zhì)、信使RNAs和miRNAs結(jié)合，大量證據(jù)表明，LncRNA的誘餌功能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著不可替代的作用［26］。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA PVT1 很有可能是胃癌中刺激激活EIF4A1的RNA伴侶，激活的EIF4A1促進(jìn)下游轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而從多基因表達(dá)變異的角度促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移侵襲。我們通過在低表達(dá)PVT1和EIF4A1的胃癌細(xì)胞中單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)單獨過表達(dá)PVT1或EIF4A1的胃癌細(xì)胞相較于未過表達(dá)的胃癌細(xì)胞，明顯提升了細(xì)胞的遷移和增殖能力，Western blot結(jié)果顯示：N-cadherin、TGF-β和 smad3蛋白表達(dá)升高，E-cadherin蛋白降低。說明單獨過表達(dá)PVT1或EIF4A1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與遷移。而共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1后，結(jié)果顯示共同過表達(dá)組相較于單獨過表達(dá)組能夠進(jìn)一步提升胃癌細(xì)胞的增殖與遷移的功能，Western blot結(jié)果也顯示：相較于單獨過表達(dá)PVT1或EIF4A1，N-cadherin、TGF-β和smad3蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，E-cadherin蛋白進(jìn)一步降低，說明PVT1和EIF4A1能夠協(xié)同更進(jìn)一步促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與遷移作用。這可能是因為兩個因子能夠調(diào)控共同的下游基因或蛋白，前文中已經(jīng)提到PVT1常通過與c-Myc相互作用促進(jìn)癌癥的發(fā)展。Ren等［13］發(fā)現(xiàn)，PVT1的表達(dá)與c-Myc有關(guān)，并且它們具有相同的表達(dá)趨勢。在敲低PVT1的胃癌細(xì)胞中，c-Myc的表達(dá)也下調(diào)。而c-Myc在胃癌的發(fā)生發(fā)展中是一個重要的分子。Zhao等［27］發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌中，c-Myc基因表達(dá)的調(diào)控高度依賴于EIF4A1。EIF4A1缺失可顯著降低c-Myc和EMT標(biāo)記物的表達(dá)水平。過表達(dá)的EIF4A1通過c-Myc/miR-9軸促進(jìn)EMT相關(guān)蛋白N-cadherin蛋白表達(dá)上升，E-cadherin蛋白表達(dá)下降。此外，EIF4A1或c-Myc的缺失顯著降低了EMT的水平和體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移，反之亦然。c-Myc可能是為癌細(xì)胞提供成功轉(zhuǎn)移所需的必要特征的因素之一，廣泛參與EMT過程。Cowling和他的同事進(jìn)行的實驗表明，c-Myc可以直接下調(diào)乳腺癌細(xì)胞株中的E-cadherin，E-cadherin的下調(diào)是EMT的主要指標(biāo)［28］ 。

骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種受MYC正向調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子和整合素結(jié)合配體，有研究表明，在乳腺癌中，OPN通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而促進(jìn)癌細(xì)胞脫離和血管內(nèi)侵入，這些轉(zhuǎn)錄因子包括Twist、Snail、Slug和MMPs［29］。MMP2被報道能夠裂解潛伏期相關(guān)的TGF-β，釋放活性的TGF-β。MMP2在小窩蛋白缺失的小鼠中過度表達(dá)，這導(dǎo)致與TGF-β激活相關(guān)的侵襲性乳腺腫瘤表型增加［30］。本研究結(jié)果顯示，TGF-β在單獨過表達(dá)PVT1或EIF4A1的表達(dá)量高于NC組，共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1的TGF-β表達(dá)量顯著高于單獨過表達(dá)組。說明PVT1和EIF4A1能夠單獨或協(xié)同促進(jìn)TGF-β的表達(dá)。據(jù)此我們推測PVT1和EIF4A1能夠共同促進(jìn)c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MMP2的表達(dá)，最終影響TGF-β使其表達(dá)增加。

Smads是一組將細(xì)胞外信號直接傳遞到細(xì)胞核的蛋白質(zhì)。smad3主要介導(dǎo)TGF-β亞家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，共同調(diào)節(jié)因子Smad4是TGF-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路的中樞調(diào)節(jié)因子。smad3已經(jīng)被證明在許多類型的癌癥過度增加，并可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中中起致癌作用。例如，Yamazaki等［31］證明smad3可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。TGF-α/smad3信號的激活可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞系的遷移和侵襲，提示smad3在宮頸癌轉(zhuǎn)移中起重要作用。PVT1能夠降低miR-140-5p的表達(dá)，而smad3可能是miR-140-5p的下游靶點，因此我們認(rèn)為PVT1能夠通過降低miR-140-5p的表達(dá)而促進(jìn)smad3的表達(dá)情況。而EIF4A1調(diào)控smad3的機制目前尚未明確，今后仍需繼續(xù)探索。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)單獨或共同過表達(dá)PVT1和EIF4A1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖與遷移能力，說明了PVT1和EIF4A1有很大的潛力共同作為胃癌的治療靶點。這與前人的觀點不謀而合［34］。而根據(jù)本實驗結(jié)果，我們推測：在胃癌細(xì)胞中，PVT1和EIF4A1互作后通過共同影響下游因子c-Myc，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子MMP2的表達(dá)，進(jìn)而增強TGF-β/smads信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。同時，PVT1也可通過miR-140-5p直接影響TGF-β/smads信號通路中smad3的表達(dá)。以上機制進(jìn)而導(dǎo)致EMT的發(fā)生以及EMT相關(guān)蛋白如N-cadherin的表達(dá)，同時降低上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，增強胃癌細(xì)胞增殖與遷移的能力。然而PVT1和EIF4A1是否會通過以上機制持續(xù)影響EMT進(jìn)程，亦或受到其他哪些分子或因子影響表達(dá)，仍是今后需要探索的方向。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）