許常旭，楊海剛，莫小鵬，胡勇，錢圣典，邵建平，王未，張俊，張強(qiáng)，毛龍

1.杭州艾森醫(yī)藥研究有限公司，浙江 杭州 310030

2.艾森醫(yī)藥股份有限公司，美國 圣地亞哥 CA92121

化合物(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯是奈瑪特韋和其他已上市及研發(fā)中的Mpro抑制劑如先諾特韋、來瑞特韋、阿泰特韋和奧格特韋鈉的關(guān)鍵起始原料，結(jié)構(gòu)式見圖1。目前國內(nèi)外對于(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的研究主要集中在合成、生產(chǎn)工藝方面[1-4]。(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)手性中心會引入到下游Mpro抑制劑中，因此確證其絕對構(gòu)型將有助于相關(guān)藥物的立體構(gòu)型研究。單晶X射線衍射是手性化合物立體構(gòu)型確證的“金指標(biāo)”，能夠精準(zhǔn)分析原子的空間排布和相互間作用力，從而確證化合物的手性構(gòu)型[5-6]。本研究對(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯單晶培養(yǎng)和熱重法（TGA）、差示掃描量熱法（DSC）、粉末X射線衍射（PXRD）和單晶X射線衍射（SXRD）檢測，確證了其立體構(gòu)型，同時(shí)確定了其晶型特征和分子間氫鍵關(guān)系，對相關(guān)藥物的質(zhì)量研究和控制具有重要意義。

圖1 (S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of (S)-2-(tert-butoxycarbonyl)amino-3-[(S)-2-oxopyrrolidin-3-yl] propanoate

1 儀器與試劑

XTL-240體視偏光顯微鏡，Mettler TGA2熱重分析儀，Bruker D8 Advance X射線衍射儀，Bruker D8 Venture X射線單晶衍射儀；(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯（宣城美諾華藥業(yè)有限公司，批號XC023-3-221101，面積歸一化法測得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%）；醋酸乙酯、甲基叔丁醚（試劑級，Sigma Aldrich）。

2 方法與結(jié)果

2.1 單晶的制備

根據(jù)(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的理化性質(zhì)，參考小試實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知其易溶于醋酸乙酯、二氯甲烷，微溶于甲基叔丁基醚、正庚烷，因此采用交叉混合體系：醋酸乙酯-甲基叔丁基醚、醋酸乙酯-正庚烷、二氯甲烷-甲基叔丁基醚和二氯甲烷-正庚烷進(jìn)行單晶條件篩選，其中醋酸乙酯-甲基叔丁醚體系培養(yǎng)2 d析出透明塊狀晶體，其他溶劑體系未能培養(yǎng)出合適晶體。因此本研究選取醋酸乙酯-甲基叔丁醚體系通過溶劑自然揮發(fā)進(jìn)行單晶培養(yǎng)。將5 mg樣品溶于醋酸乙酯-甲基叔丁基醚（1∶1）體系，加熱溶清后關(guān)閉加熱，自然冷卻，靜置析晶2 d，即得到無色塊狀晶體。

2.2 熱分析

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯樣品采用TGA和DSC進(jìn)行熱分析，檢測過程用氧化鋁坩堝，氣體為氮?dú)?，升溫范圍?5～500 ℃，升溫速率10 ℃/min，結(jié)果見圖2。樣品隨溫度升高，DSC顯示在113.65 ℃處有1個(gè)尖銳的吸熱峰，表明樣品有明確熔點(diǎn)；大約160 ℃開始TGA顯示樣品逐漸失重，DSC出現(xiàn)較寬的吸熱峰，表明樣品開始逐漸分解。熱分析表明樣品熔點(diǎn)約為114 ℃，晶體為非水合物和溶劑化物。

圖2 TGA和DSC圖譜Fig.2 TGA and DSC

2.3 PXRD分析

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯樣品晶體粉末采用PXRD進(jìn)行分析。檢測過程用CuKα（λ＝1.540 60 nm）為輻射光源，電壓40 kV，電流100 mA，2θ掃描范圍3°～40°，掃描步長0.02°，掃描速率6°/min，結(jié)果見圖3。樣品特征峰分別位于6.433°、9.265°、13.318°、17.385°、17.675°、18.083°、18.675°、19.299°、20.235°、20.764°、21.146°、23.091°、23.849°、25.158°，與單晶結(jié)構(gòu)理論P(yáng)XRD結(jié)果一致。

圖3 PXRD實(shí)驗(yàn)圖譜（a）和理論圖譜（b）Fig.3 PXRD experimental pattern (a) and theoretical pattern (b)

2.4 SXRD分析

衍射分析所用晶體為無色塊狀晶體，大小為0.42 mm×0.35 mm×0.23 mm，單晶衍射儀采用CCD面探測儀收集衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，用CuKα（λ＝1.541 78 nm）輻射為光源，250 K溫度下進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)收集。

采用直接法（ShelXT軟件）解析晶體的結(jié)構(gòu)。結(jié)果總衍射點(diǎn)為62 331，獨(dú)立衍射點(diǎn)為6 044，可觀察點(diǎn)[I＞2σ(I)] 5 775點(diǎn)，數(shù)據(jù)完整度99.8%。最終R1＝0.040 2，wR2＝0.108 5，F(xiàn)lack因子為0.01（4），結(jié)構(gòu)可靠因子S＝1.035，接近1.0，表明權(quán)重方案適合、結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確。最終確定晶體屬于正交晶系，空間群為P212121，晶胞參數(shù)a＝8.958 5(2) ?（1 ?＝0.1 nm），b＝18.905 2(4) ?，c＝19.500 6(4) ?，α＝90°，β＝90°，γ＝90°，晶胞體積V＝3 302.67(12) ?3；晶胞內(nèi)分子數(shù)Z＝8。化合物分子式為C13H22N2O5，計(jì)算晶體密度為1.152 mg/mm3。用醋酸乙酯-甲基叔丁基醚體系培養(yǎng)，所得晶體為非溶劑化物，此外，單晶結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明C4、C6手性中心為S,S構(gòu)型，同時(shí)分子間存在氫鍵。

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯晶體于偏光顯微鏡下放大10倍，獲得的PLM圖見圖4，分子立體結(jié)構(gòu)見圖5，一維鏈狀結(jié)構(gòu)見圖6，三維結(jié)構(gòu)見圖7，主要鍵長數(shù)據(jù)見表1，非氫原子坐標(biāo)參數(shù)和等價(jià)各向同性位移參數(shù)見表2，主要鍵角數(shù)據(jù)見表3，氫鍵數(shù)據(jù)見表4。

表1 主要成鍵原子的鍵長Table 1 Bond lengths of main bonded atoms

表2 非氫原子坐標(biāo)參數(shù)和等價(jià)各向同性位移參數(shù)Table 2 Atomic (C,O,N) coordinates and equivalent isotropic displacement parameters

表3 主要鍵角數(shù)據(jù)Table 3 Date of angle

表4 氫鍵數(shù)據(jù)Table 4 Data of hydrogen bond

圖4 晶體PLM圖Fig.4 Crystal PLM diagram

圖5 立體構(gòu)型圖Fig.5 Stereogram

圖6 一維鏈狀圖Fig.6 1D chain structural diagram

圖7 三維結(jié)構(gòu)圖Fig.7 3D structural diagram

3 討論

(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯是很多Mpro抑制劑的關(guān)鍵起始原料，包括筆者正在開發(fā)的口服藥物奧格特韋鈉[7]，其晶型表征和結(jié)構(gòu)確證將有助于相關(guān)藥物質(zhì)量研究。本研究采用溶劑揮發(fā)法優(yōu)選到醋酸乙酯-甲基叔丁基醚體系，培養(yǎng)出高質(zhì)量的單晶，所得晶體使用TGA、DSC和PXRD進(jìn)行晶型表征，采用SXRD進(jìn)行了立體結(jié)構(gòu)確證。結(jié)果表明：TGA和DSC顯示晶體熔點(diǎn)約為114 ℃，是非水合物和溶劑化物；PXRD顯示了該晶型的特征峰，并與Material Studio軟件對單晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)模擬的PXRD理論圖譜保持一致，表明該晶型可能是(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的穩(wěn)定晶型；SXRD顯示分子結(jié)構(gòu)為氨基端被Boc保護(hù)，羧基端形成甲酯，中間接有吡咯烷酮；分子中心和吡咯環(huán)上各有1個(gè)手性碳原子，絕對構(gòu)型為S,S構(gòu)型，且分子間存在氫鍵，表現(xiàn)為兩個(gè)分子的氧代吡咯烷基團(tuán)的羰基和氨基互相作為氫鍵的受體和供體，將分子頭頭相連，同時(shí)Boc-氨基提供氫鍵給鄰近分子的氧代吡咯烷羰基，將分子連接成一維超分子鏈，鏈與鏈之間通過分子間作用力平行堆疊，形成三維堆積結(jié)構(gòu)。本研究對(S)-2-(Boc-氨基)-3-[(S)-2-氧代-3-吡咯烷基]丙酸甲酯的晶型表征和單晶結(jié)構(gòu)解析為下游Mpro抑制劑的質(zhì)量研究和立體結(jié)構(gòu)確證提供了重要參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突