劉梓琛，吳 飛，郎 卿，林 曉，*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203； 3.上海市浦東新區(qū)北蔡社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，上海 201204）

相較于其他傳統(tǒng)中藥劑型，散劑制備工藝簡(jiǎn)便，但也需遵循一定原則，主要分為干燥、粉碎、過篩、混合、分劑量等環(huán)節(jié)。從關(guān)鍵質(zhì)量屬性角度來說，散劑重點(diǎn)要求含量均勻，色澤一致，故混合是關(guān)鍵操作，其傳統(tǒng)方式有過篩混合、研磨混合（等量遞增法和打底套色法等）、混合筒混合等。

碧雪散由石膏、人中白、冰片、青黛、硼砂、腰黃、朱砂組成，方中朱砂具有清心鎮(zhèn)驚、安神解毒功效，雄黃具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧作用，兩者常用于用于瘡瘍腫毒、咽喉腫痛、口舌生瘡的治療［1-3］，不僅在處方中屬于顏色特殊的成分，也有著一定毒性［4-5］，故在制備工藝中混合步驟尤為關(guān)鍵，其均一性不僅會(huì)影響品質(zhì)，更會(huì)影響安全性。因此，本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化碧雪散制備工藝，以期為其他中藥散劑研究提供參考。

1 材料

FA2104N 型電子分析天平（0.1 mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司）； XP205 型電子分析天平［0.01 mg，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； SQP 型電子分析天平［0.01 g，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］； DFY-1000 型多功能高速中藥粉碎機(jī)（搖擺式，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）； EML200 Digital PlusT 型干式振動(dòng)篩（德國(guó)Haver＆Boecker 公司）； SK7210HP 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）； TGL-18C 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）； RRM Mini-Ⅱ型三維混合器（德國(guó)JEngelsmann 公司）； ADCI-60-C 型實(shí)用型色差儀（北京市辰泰克儀器有限公司）； 沃特世Alliance e2695 型高效液相色譜儀，配置PDA 檢測(cè)器和Empower 3 化學(xué)工作站［沃特世科技（上海） 有限公司］； 安捷倫7890A 型氣相色譜儀，配置自動(dòng)進(jìn)樣器ALS、FID 檢測(cè)器和Chemstation 化學(xué)工作站（美國(guó)安捷倫公司）； Quanta 250 FEG 型掃描電鏡（荷蘭Philips 公司）； Malvern 2000 型激光粒度儀（英國(guó)馬爾文公司）； 標(biāo)準(zhǔn)藥典篩（杭州三思儀器有限公司）； BT-1000型粉體綜合特性測(cè)試儀（丹東市百特儀器有限公司）。

冰片（批號(hào)200111）、炒硼砂（批號(hào)210608）、石膏（批號(hào)210701）、人中白 （批號(hào)190722）、青黛 （批號(hào)210421）（上?？禈蛩帢I(yè)有限公司）； 朱砂（批號(hào)20210410，上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司）； 雄黃（批號(hào)2012090346，上海雷允上中藥飲片廠），均經(jīng)專家鑒定為正品。碧雪散（自制，批號(hào)221001）。靛藍(lán)（批號(hào)110716-200610）、靛玉紅（批號(hào)110717-200204）、龍腦（批號(hào)110881-201709） 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、甲醇均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 水為純水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 散劑制備

2.1.1 粉碎 將人中白、青黛和硼砂分別粉碎成細(xì)粉，雄黃和朱砂水飛成極細(xì)粉，石膏和冰片混合粉碎成細(xì)粉。其中，人中白粉碎至細(xì)粉后在100 ℃下溫浸8 h，80 ℃下干燥4 h，過篩，備用。

2.1.2 混合 目前，常用的混合方式有2 種，即直接混合法和等量遞增法，前者是直接混合工藝一次性全部投料，流程簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，但若處方中存在多種顏色組分，則會(huì)出現(xiàn)顏色不均勻的現(xiàn)象，而后者對(duì)存在多種顏色組分的混合均一性更好。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，直接混合法無法將散劑混合均勻，故選擇等量遞增法［6-7］。

2.2 取樣方法 采用傳統(tǒng)的五點(diǎn)法［8］，即在距離混合樣品四角1 cm 處的4 個(gè)點(diǎn)，以及混合樣品的中心點(diǎn)取樣。

2.3 混合均一性評(píng)價(jià) 散劑重點(diǎn)要求含量均勻，色澤一致，故本實(shí)驗(yàn)以冰片中龍腦和青黛中靛藍(lán)、靛玉紅為含量均勻的評(píng)價(jià)指標(biāo)； 采用色差計(jì)測(cè)定色差值，作為色澤一致的評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣，測(cè)定色度值L、a、b 及靛藍(lán)＋靛玉紅、龍腦含量，以其RSD 為混合均一性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中前三者權(quán)重賦值分別為25、25、50，后兩者權(quán)重賦值分別為50、50，計(jì)算綜合評(píng)分Y，公式為Y＝色度值RSD×0.2＋（靛藍(lán)＋靛玉紅） 含量RSD×0.4＋龍腦含量RSD×0.4。

2.3.1 色差值測(cè)定 采用色差計(jì)［9］對(duì)顏色關(guān)鍵感官屬性進(jìn)行客觀的數(shù)字化評(píng)價(jià)，其中L 代表亮度，是指色彩中的深淺、明暗程度，數(shù)值為0 ～100，0 表示黑色，100 表示白色； a 代表紅綠值，數(shù)值為-120 ～120，正值為紅，負(fù)值為綠，0 為中性色； b 代表黃藍(lán)值，數(shù)值為-120 ～120，正值為黃，負(fù)值為藍(lán)，0 為中性色。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每次測(cè)定時(shí)色度值b 的差異最大，而成型后的顏色也主要為藍(lán)色，故以其為主要指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.3.2 HPLC 法測(cè)定靛藍(lán)、靛玉紅含量

2.3.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品適量，置于量瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺適量，溶解，制成兩者質(zhì)量濃度分別為0.993、0.83 mg/mL 的貯備液，精密吸取適量，置于同一量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL 分別含兩者496.5、24.9 μg）。

2.3.2.2 供試品溶液制備 取本品 （批號(hào)221001） 約0.3 g，精密稱定，置于磨口錐形瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺30 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率180 W，頻率53 kHz） 提取45 min，放冷，N，N-二甲基甲酰胺補(bǔ)足減失的質(zhì)量，吸取1 mL 上清液，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.3.2.3 色譜條件 參考文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道，QS-C18Plus 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相甲醇-水（75 ∶25）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)289 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2.4 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品（N，N-二甲基甲酰胺） 溶液適量，在“2.3.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.3.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液（含靛藍(lán)496.5 μg/mL、靛玉紅24.9 μg/mL） 0.5、1、1.5、2 mL，置于量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，在“2.3.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得方程分別為Y＝3 225.5X＋663 373 （r＝0.998 7）、Y＝2 899.9X＋2 232.3 （r＝0.999 9），分別在9.93 ～496、0.498 ～24.9 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.3.2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得靛藍(lán)、靛玉紅峰面積RSD 分別為0.3%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)221001） 6 份，按“2.3.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得靛藍(lán)、靛玉紅含量RSD 分別為1.8%、1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、4、8、16、24 h 在“2.3.2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得靛藍(lán)、靛玉紅含量RSD 分別為0.5%、1.7%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 GC 法測(cè)定龍腦含量

2.3.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取龍腦對(duì)照品適量，置于量瓶中，乙酸乙酯溶解，即得 （該成分質(zhì)量濃度為10.17 mg/mL）。

2.3.3.2 供試品溶液制備 精密稱取本品粉末0.3 g，置于10 mL 量瓶中，乙酸乙酯溶解，超聲處理，過濾，乙酸乙酯定容至刻度，即得。

2.3.3.3 色譜條件 DM-WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）； 進(jìn)樣體積1.0 μL； 分流比20 ∶1； 進(jìn)樣口溫度180 ℃； 載氣氮?dú)?，體積流量1.0 mL/min； 恒流模式； 柱溫140 ℃； 檢測(cè)器溫度250 ℃； 尾吹氣氮?dú)?氫氣-空氣（25 ∶30 ∶400）。

2.3.3.4 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品（乙酸乙酯） 溶液適量，在“2.3.3.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖2。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 龍腦GC 色譜圖

2.3.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液0.025、0.05、0.25、0.50、0.75、2.50 mL，置于5 mL 量瓶中，乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，定容，在“2.3.3.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)其質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝720.84X-10.01（r＝1.000 0），在0.10～10.17 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.3.3.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得龍腦峰面積RSD 為0.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號(hào)221001） 6 份，按“2.3.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得龍腦峰面積RSD 為1.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、24 h 在“2.3.3.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得龍腦峰面積RSD 為2.4%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 粉末加入順序 按表1 順序加入組方藥材粉末，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見圖3。由此可知，順序A 綜合評(píng)分最低，表明混合最均勻。

表1 粉末加入順序

圖3 粉末加入順序?qū)C合評(píng)分的影響

2.4.2 混合轉(zhuǎn)速 混合轉(zhuǎn)速會(huì)對(duì)物料混合狀態(tài)及最終的混合均勻度產(chǎn)生影響［11］。采用等量遞增法，將組方藥材粉末分別在混合轉(zhuǎn)速25、30、35、40 r/min 下混合，每次20 min，平行5 份，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見圖4。由此可知，隨著混合轉(zhuǎn)速增加綜合評(píng)分先降后升，為35 r/min 時(shí)最低。

圖4 混合轉(zhuǎn)速對(duì)綜合評(píng)分的影響

2.4.3 混合時(shí)間 采用等量遞增法，將組方藥材粉末以35 r/min 混合轉(zhuǎn)速按順序A 混合3 次，每次混合時(shí)間分別為10、20、30、40 min，平行5 份，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見圖5。由此可知，隨著混合時(shí)間延長(zhǎng)綜合評(píng)分降低，在20 min后程度趨緩。

2.4.4 填充率 填充率會(huì)對(duì)混合均一性產(chǎn)生影響［11］。采用等量遞增法，將組方藥材粉末以35 r/min 混合轉(zhuǎn)速混合20 min，填充率分別為5%、10%、15%、20%、25%，平行5 份，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見圖6。由此可知，填充率增至20%后綜合評(píng)分升高，其原因可能是混合設(shè)備功率較小，動(dòng)力不足，導(dǎo)致填充率較低時(shí)混合桶中的物料未得到充分混合，從而出現(xiàn)不均勻的現(xiàn)象。

圖6 填充率對(duì)綜合評(píng)分的影響

2.4.5 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以混合時(shí)間（A）、混合轉(zhuǎn)速（B）、填充率（C） 為影響因素，色度值RSD 及靛藍(lán)＋靛玉紅、龍腦含量RSD 的綜合評(píng)分（Y） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平設(shè)計(jì)［12］，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得二次二項(xiàng)式方程為Y＝5.35-0.557 5A＋0.381 2B＋0.38C- 0.072 5AB- 0.957 5AC＋0.425 0BC-0.373 0A2-0.090 5B2-1.23C2（R2＝0.851 1），方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.05，具有高度顯著性； AdjR2為0.659 7，表明模型擬合程度良好； 失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型誤差較?。?因素A、AC、C2有顯著或極顯著影響（P＜0.05，P＜0.01）。響應(yīng)面分析見圖7。

表3 方差分析結(jié)果

圖7 各因素響應(yīng)面圖

2.4.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用Design-Expert 軟件，確定最優(yōu)工藝為混合時(shí)間20 min，混合轉(zhuǎn)速35 r/min，填充率10%?？紤]到工藝放大和生產(chǎn)成本，在上述優(yōu)化工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行4 批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4，可知隨著填充率增加綜合評(píng)分升高，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，增加填充率能大幅度節(jié)約生產(chǎn)成本，從而提高生產(chǎn)價(jià)值； 當(dāng)填充率從10%增加到20%時(shí)，靛藍(lán)＋靛玉紅、龍腦含量RSD 均在4%左右，可滿足產(chǎn)品合格要求［13］。綜上所述，雖然最優(yōu)水平組為1 號(hào)，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)可行性，也可適當(dāng)增加填充率。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝4）

2.5 散劑表征

2.5.1 物性參數(shù) 測(cè)定表4 各批樣品的休止角、卡爾指數(shù)、豪斯納比值、粒徑［14］，結(jié)果見表5。由此可知，各物性參數(shù)之間均無顯著差異（P＞0.05），表明該工藝穩(wěn)定可行。

表5 物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s）

表5 物性參數(shù)測(cè)定結(jié)果（±s）

試驗(yàn)號(hào)休止角/（°）卡爾指數(shù)豪斯納比值粒徑（d0.5）/μm粒徑（d0.9）/μm 1 41.30±0.010.451.8325.44±0.17128.37±3.73 2 41.00±0.030.461.8527.08±0.28128.75±1.56 3 42.00±00.481.9127.21±0.32129.12±3.21 4 41.00±00.471.8827.41±0.49130.30±4.67

2.5.2 微觀形貌 采用導(dǎo)電雙面膠將3 種工藝（物理混合法、直接混合法、等量遞增法混合） 所得樣品固定于電鏡載物臺(tái)上，通過濺射儀進(jìn)行表面噴金，在20 kV 加速電壓下以掃描電子顯微鏡（SEM） 觀察表面結(jié)構(gòu)及物料混合狀態(tài)，結(jié)果見圖8。由此可知，物理混合法、直接混合法所制備的樣品粉末分布不均勻，表面結(jié)構(gòu)不規(guī)整； 等量遞增法所制備的樣品粉末分布均勻，表面較光滑規(guī)整。

圖8 碧雪散SEM 圖

3 討論與結(jié)論

混合是制劑制備過程中非常重要的環(huán)節(jié)，其結(jié)果直接關(guān)系到制劑的外觀形態(tài)及內(nèi)在質(zhì)量，對(duì)多組分物質(zhì)含量均一性意義重大［15］。含量均勻度［16-17］是反映制劑安全、穩(wěn)定、可控、有效的重要指標(biāo)，直接影響其臨床效果，而色差值［18］是直接反映樣品混合均一性的指標(biāo)。隨著檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展與進(jìn)步，除化學(xué)成分含量外物理學(xué)參數(shù)也可作為混合均一性評(píng)價(jià)指標(biāo)，如文獻(xiàn)［19］ 采用色差計(jì)測(cè)定青黛、白礬細(xì)粉及細(xì)粉混合物和復(fù)合粒子色度值，作為混合均一性評(píng)價(jià)指標(biāo)； 文獻(xiàn)［20］ 選擇色度值作為小金丸質(zhì)量均一性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，碧雪散最優(yōu)混合工藝為混合時(shí)間20 min，混合轉(zhuǎn)速35 r/min，填充率10%，其混合均一性較好，再測(cè)定主要成分含量，可知藥效更穩(wěn)定，安全性更高［21］，接著從物性參數(shù)、微觀表征方面分析驗(yàn)證組之間的物性差異，結(jié)果無顯著差異。

散劑作為傳統(tǒng)劑型之一，臨床使用歷史悠久，療效也經(jīng)過時(shí)間檢驗(yàn)，但近來鮮有其制備工藝的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次從色差值、化學(xué)含量、物性參數(shù)、微觀表征多角度來對(duì)碧雪散制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，使其更具合理性同時(shí)增加了科學(xué)內(nèi)涵，同時(shí)可為關(guān)于其他中藥散劑的相關(guān)研究添磚加瓦。