羅旭東，李昕蓉，李成義*，齊 鵬，梁婷婷，劉書斌，強正澤，何軍剛，李 旭，魏小成，馮曉莉，2，王明偉

（1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2.敦煌醫(yī)學與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

紅芪為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrysHand.-Mazz.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血等功效［1］，在調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗衰老等方面具有較好的藥理作用［2-5］。

產(chǎn)地加工是中藥材生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，搓條作為紅芪產(chǎn)地加工體系中的關(guān)鍵步驟，是該藥材品質(zhì)及商品形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。前期報道，加工時間、程度對藥材質(zhì)量的影響較大［6-7］，產(chǎn)地加工不僅促使藥材干燥進程，而且伴隨著化學成分變化，如同類成分之間的相互轉(zhuǎn)化及其含量的消長等［8］。

課題組前期發(fā)現(xiàn)，搓條、未搓條紅芪在性狀特征、一級紋理及皮孔、淀粉粒、木栓細胞、指紋圖譜相似度等方面存在一定差異［9-10］，但缺少成分、質(zhì)量差異方面的系統(tǒng)研究。因此，本實驗探討紅芪搓條前后主要次級代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，以期完善該藥材質(zhì)量控制方法，為其生產(chǎn)過程優(yōu)化提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器和試劑 API 5500 三重四級桿LC-MS/MS 質(zhì)譜系統(tǒng)（美國AB SCIEX 公司）； LC-30AD 超高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）； BT25S 型電子分析天平（十萬分之一）、BT124S 型電子分析天平（萬分之一） ［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； DK-98-ⅡA 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）； YRE-301 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）。腺苷 （批號N24D11W135689）、甜菜堿（批號DJ0615YA13）、毛蕊異黃酮苷（批號R31A10F96530）、毛蕊異黃酮 （批號 Y24N9Y75652）、芒柄花苷 （ 批號P03A10F84910）、芒柄花素（批號H06S9Z69494）、美迪紫檀素（批號Y12M11H112983）、染料木素（ 批號 H30A9Z69019）、γ-氨基丁酸 （ 批號Z08A8H33553）、木犀草素（批號O14HB197800）、甘草素 （批號Z20J8X40265）、異甘草素 （批號H03D9Z76567）、香草酸（批號H11J9Z65318）、阿魏酸（批號L03A9D57744） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈、甲酸均購自賽默飛世爾科技（中國） 有限公司。

1.2 藥材 新鮮紅芪于2021 年11 月采自隴南市武都區(qū)（北緯33°27′44.92″，東經(jīng)105°4′18.44″，高度1 876.00 m），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學李成義教授鑒定為正品，洗凈泥沙，去除雜質(zhì)，分為搓條組（編號CT1 ～CT14） 和未搓條組 （編號WCT1 ～WCT14），未搓條組晾曬至干，而搓條組按照課題組前期優(yōu)化工藝處理（紅芪自然晾曬至含水量為52% ～59%時進行搓條，時間9 min，次數(shù)2 次），晾曬至干，粉碎，過4 號篩，見圖1。

圖1 紅芪圖片F(xiàn)ig.1 Images of Hedysari Radix

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備 精密稱取搓條、未搓條藥材各3 g，加甲醇30 mL，80 ℃水浴提取1 h，過濾，濾液濃縮定容至10 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、異甘草素、香草酸、阿魏酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL 分別含上述成分31.25、15.63、6.25、3.13、15.63、0.78、2.50、6.25、6.25、15.63、12.50、62.50、6.25、2.50 μg 的貯備液，甲醇依次稀釋成系列質(zhì)量濃度，即得，避光保存于4 ℃冰箱中。

2.3 內(nèi)標溶液制備 精密稱取鹽酸吡格列酮對照品2.00 mg，置于2 mL 量瓶中，甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL 的母液，量取適量，甲醇稀釋至2 ng/mL，即得。

2.4 色譜條件 Waters CORTES C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）； 流動相0.2%甲酸（A） -甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，5% ～90%B； 5 ～7.5 min，90%B； 7.5 ～8 min，90% ～5% B； 8 ～13 min，5%B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫40 ℃；進樣量2 μL。色譜圖見圖2。

圖2 各成分色譜圖Fig.2 Chromatograms of various constituents

2.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正負離子掃描； 多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM） 模式； 霧化氣溫度500 ℃； 碰撞氣壓力8 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 霧化氣壓力50 psi； 輔助氣壓力50 psi； 氣簾氣壓力30 psi； 噴霧電壓4 500 eV （負離子）、5 500 eV（正離子），其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項下對照品溶液適量，0.22 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，并以S/N≥3 為檢測限，S/N≥10 為定量限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.2 精密度試驗 取“2.2” 項下對照品溶液適量，在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定6 次，測得芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、異甘草素、香草酸、阿魏酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜堿峰面積RSD 分別為1.65%、1.67%、1.86%、2.14%、2.07%、2.13%、1.56%、2.05%、1.13%、2.19%、0.98%、1.98%、1.80%、1.93%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取6 份藥材（CT-1） 適量，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4”“2.5” 項條件下進樣測定，測得芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、異甘草素、香草酸、阿魏酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜堿含量RSD 分別為 2.69%、2.90%、2.80%、2.78%、2.66%、1.32%、2.55%、2.39%、1.66%、2.63%、2.90%、2.85%、2.96%、2.59%，表明該方法重復性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 取藥材（CT-1） 適量，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定，測得芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、異甘草素、香草酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜堿含量RSD 分別為2.91%、2.45%、2.75%、2.35%、2.69%、2.97%、2.93%、2.89%、2.90%、2.80%、2.69%、2.85%、2.96%、2.10%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取藥材（CT-1）1.5 g，分別按50%、100%、150%水平精密加入對照品溶液，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、美迪紫檀素、染料木素、木犀草素、甘草素、異甘草素、香草酸、γ-氨基丁酸、腺苷、甜菜堿平均加樣回收率分別為98.14%、98.28%、97.78%、97.42%、98.60%、98.70%、99.25%、98.33%、98.38%、98.75%、98.05%、99.98%、98.66%、98.17%，RSD 分別為2.71%、2.04%、1.73%、1.99%、2.10%、2.36%、2.81%、2.08%、2.68%、2.64%、2.13%、1.54%、2.29%、2.01%。

2.6.6 樣品含量測定 精密稱定搓條、未搓條藥材粉末各14 批，每批3.0 g，按“2.1” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” “2.5” 項條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。由此可知，2 種藥材粉末中γ-氨基丁酸含量均最高，木犀草素含量均最低。

2.7 化學模式識別

2.7.1 獨立樣本t檢驗 表4 顯示，搓條前后芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、香草酸、γ-氨基丁酸含量均有極顯著差異 （P＜0.01），美迪紫檀素、染料木素、甘草素、腺苷含量均有顯著差異（P＜0.05），而木犀草素、異甘草素、阿魏酸、甜菜堿含量均無顯著差異 （P＞0.05）。

表4 獨立樣本t 檢驗結(jié)果Tab.4 Results for independent samples t tests

2.7.2 聚類分析 以各成分含量為變量，導入Ometaboanalyst 網(wǎng)頁，差異 Ward 連接法結(jié)合Euclidean 距離進行分析，結(jié)果見圖3。由此可知，各批藥材聚為2 類，WCT1～WCT14 為一類，CT1～CT14 為一類，表明搓條、未搓條藥材可得到較好的區(qū)分，并且其所含成分的含量存在差異。

圖3 藥材聚類熱圖Fig.3 Cluster heatmap for medicinal materials

2.7.3 主成分分析（PCA） 以各成分含量為變量，導入Ometaboanalyst 網(wǎng)頁進行分析，結(jié)果見圖4。由此可知，搓條、未搓條藥材各自聚為一類，與“2.7.2” 項下結(jié)果一致，表明搓條對藥材所含成分的總體特征構(gòu)成了明顯影響。

圖4 藥材PCA 得分圖Fig.4 PCA score plot for medicinal materials

2.7.4 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA） 在PCA 分析基礎(chǔ)上進行有監(jiān)督模式的OPLS-DA 分析，結(jié)果見圖5。由此可知，累積解釋能力參數(shù)（R2X） 為0.658，累積解釋能力參數(shù)（R2Y） 為0.928，模型預測能力參數(shù)（Q2） 為0.879，均大于0.5，表明模型穩(wěn)定可靠，預測能力強，可用于區(qū)分搓條、未搓條藥材，與“2.7.2” “2.7.3” 項下結(jié)果一致。

圖5 藥材OPLS-DA 得分圖Fig.5 OPLS-DA score plot for medicinal materials

變量重要性 （VIP） 投影圖見圖6，以VIP值＞1.0 為標準篩選差異性成分，共得到6 種，分別為毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、γ-氨基丁酸、香草酸、毛蕊異黃酮、芒柄花苷，其中搓條藥材中芒柄花素、γ-氨基丁酸、毛蕊異黃酮平均含量高于未搓條藥材中（P＜0.01），毛蕊異黃酮苷、香草酸、芒柄花苷平均含量低于未搓條藥材（P＜0.01），見圖7。

圖6 藥材VIP 投影圖Fig.6 VIP projection plot for medicinal materials

圖7 各差異性成分含量箱形圖Fig.7 Box diagrams for contents of various differential components

3 討論與結(jié)論

本實驗選擇不同色譜柱［Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Waters CORTES C18（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） ］、流動相（水-乙腈/甲醇、0.1% /0.2% 乙酸銨-乙腈/甲醇、0.1% /0.2%甲酸-乙腈/甲醇），從敏感性、分離度、峰保留時間、峰形、消除基質(zhì)效應(yīng)等方面進行考察，最終確定為Waters CORTES C18色譜柱（50 mm× 4.6 mm，2.7 μm）、0.2% 甲酸-甲醇。

研究表明，搓條可增加紅芪內(nèi)部水分向外擴散速率，加快藥材干燥，改善藥材性狀，皮緊實而細膩，全身較直，質(zhì)地堅硬，致密，不易折斷； 芒柄花素、毛蕊異黃酮、甘草素、γ-氨基丁酸含量升高，芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷、香草酸含量降低，推測可能是在機械力作用下異黃酮苷類成分轉(zhuǎn)化成異黃酮苷元類成分，其機制包括①搓條過程中在機械力作用下紅芪溫度升高，促進相關(guān)異黃酮合成酶活性發(fā)生變化［8，11］，誘導新代謝物產(chǎn)生、次生代謝物含量升高或降低等抗脫水機制［12-13］； ②芒柄花素等異黃酮類成分生物合成途徑有關(guān)蛋白發(fā)生變化，力學信號到達機械力離子通道Piezo1，后者傳導多種生化信號，引起次生代謝產(chǎn)物改變［14-15］；③機械力經(jīng)過傳導，引起芒柄花素合成途徑上關(guān)鍵異黃酮合酶基因等表達或沉默，使得次生代謝產(chǎn)物含量發(fā)生變化［9，16-17］； ④搓條施加于藥材后產(chǎn)生“機械力化學效應(yīng)”［18-21］，促使細胞結(jié)構(gòu)的改變及膜系統(tǒng)的破壞［22-23］，斷開了細胞壁聚合物的分子間、分子內(nèi)連接［24］，使次生代謝產(chǎn)物含量發(fā)生變化。今后，課題組將對此作深入研究。

綜上所述，本實驗考察紅芪搓條前后主要次級代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，初步闡釋該工藝在藥材品質(zhì)形成過程中的重要作用，再基于多指標成分含量測定結(jié)合化學計量學分析來評價其合理性和科學性，可為其他根及根莖類藥材的搓條提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。