吳婉悅 劉 毓 陳 凱 文 靜 馬春元 楊 瑩,*

1.貴陽市婦幼保健院罕見病中心內(nèi)分泌遺傳代謝科 (貴州 貴陽 550001)

2.貴州省職工醫(yī)院消化內(nèi)科 (貴州 貴陽 550025)

原發(fā)性小頭畸形(congenital microcephaly)又稱為真性小頭畸形或常染色體隱性遺傳小頭畸形，是以頭圍小、面部畸形和智力障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性的罕見遺傳性疾病[1]?；純旱闹巧讨等Q于原發(fā)性小頭畸形的嚴(yán)重程度，一般為正常人平均值的30%～80%。不同地區(qū)的原發(fā)性小頭畸形發(fā)病率不同，為1/30 000～1/250 000，在近親結(jié)婚的人群中普遍較高[2]。目前已發(fā)現(xiàn)29個基因位點與原發(fā)性小頭畸形有關(guān)。MCPH1是第1個被鑒定的原發(fā)性小頭畸形致病基因[3-4]。本研究擬對1例小頭畸形、精神運動及認知發(fā)育落后患兒進行臨床分析和基因檢測，以明確病因。

1 材料和方法

1.1 研究對象患兒，男，2歲8個月，因發(fā)現(xiàn)頭小、運動及認知發(fā)育落后2年多就診?；純?月齡時抬頭不穩(wěn)，4月齡時家長發(fā)現(xiàn)患兒頭較同齡兒小伴運動及認知發(fā)育落后，表現(xiàn)為4月齡時豎頸不穩(wěn)，喜歡打挺，不能逗笑，6月齡能翻身，8月齡雙手拇指內(nèi)收握拳，視物主動抓物差，不能換手，不能獨坐，1歲時不能坐穩(wěn)，不會發(fā)“爸爸媽媽”音，1歲10個月時會站立，2歲1個月會行走?，F(xiàn)會喊“爸爸媽媽”，不會說短句，會拿勺吃飯，能獨立上下樓梯，不會單腳跳，不會跑。無抽搐、不自主抖動，無頭痛、視物模糊，無尖叫、雙目凝視等不適。曾就診于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，診斷為“全面性發(fā)育遲緩、原發(fā)性小頭畸形”，現(xiàn)予持續(xù)康復(fù)治療中。患兒系第3胎第2產(chǎn)，孕38+5周，剖宮產(chǎn)，出生體重3.1 kg，出生后無窒息及搶救史。母親為高齡產(chǎn)婦(36歲)，孕早期有甲狀腺功能減退，予“左旋甲狀腺素片”口服，甲狀腺功能維持正常，現(xiàn)復(fù)查甲狀腺功能正常。第1胎因個人原因人工流產(chǎn)，第2胎5歲，姐姐，健康。父母體檢，非近親婚配，否認家族其他成員有類似病史。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 經(jīng)患兒父母簽署知情同意書后，采集先證者及其直系親屬(父親，母親，姐姐)靜脈血各2 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中(紫色)，4℃ 冷藏。本研究經(jīng)患兒監(jiān)護人知情同意，醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(CN31-1915/R)。

1.2.2 DNA抽提 采用FlexiGene DNA Kit(Qiagen, Germany)提取受試者血液樣本基因組DNA。

1.2.3 突變檢測 DNA樣品送北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗所檢測。采用IDT xGen Exome Research Panel V1.0 探針試劑盒(覆蓋人類基因組39 M)進行全外顯子捕獲，運用NovaSeq 6000平臺(Illumina,USA)進行測序，平均測序深度為100X，目標(biāo)序列測序覆蓋度≥99%。獲得fastq 格式原始數(shù)據(jù)后，使用工具BWA(v0.7.15)將測序序列比對到人類參考基因組(Homo sapiens GRCh37)。參考1000G，dbSNP，ESP6500，ExAC等數(shù)據(jù)庫注釋患者變異在人群當(dāng)中的頻率。使用GATK (v4) 分析 SNV(單核苷酸變異)和InDel(小的插入缺失變異)。使用 CODEX，XHMM(v1.0), EXOMEDEPTH,CLINCNV 和 KSCNV(康旭，北京)分析CNV(拷貝數(shù)變異)，根據(jù)患兒的臨床表征尋找可疑致病性變異在HGMD Pro、PubMed和ClinVar數(shù)據(jù)庫中檢索變異的相關(guān)報道。采用Polyphen_2(Polymorphism Phenotyping v2)、SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)、Mutation Taster預(yù)測變異的致病性。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南[8]對變異進行致病性評級。針對符合患兒表征的致病變異，使用ABI 3730測序系統(tǒng)(ABI,USA)在家系中驗證。

2 結(jié) 果

2.1 患兒一般臨床資料分析特殊面容：小頭畸形、下頜稍小、高腭弓、眼眥稍上斜，見圖1。體格檢查：體質(zhì)量9.7 kg[低于同年齡、同性別、同地區(qū)幼兒平均體質(zhì)量2個標(biāo)準(zhǔn)差(＜－2 sd)]，身高83.2 cm[低于同年齡、同性別、同地區(qū)幼兒平均身高2個標(biāo)準(zhǔn)差(＜－2 sd)]，頭圍46.0 cm[低于同年齡、同性別、同地區(qū)幼兒平均頭圍2個標(biāo)準(zhǔn)差(＜－2 sd)]，Tanner分期G1PH1，雙上肢肌力正常，雙下肢肌力Ⅳ級。雙下肢肌張力增高，緊張或哭吵時有角弓反張樣表現(xiàn)，左膝關(guān)節(jié)有彈響。膝反射：左側(cè)++、右側(cè)++。腹壁反射引出，巴氏征(－)、克氏征(－)、布氏征(－)。頭顱電子計算機斷層掃描(computed tomography，CT)示腦白質(zhì)密度稍減低，雙側(cè)額葉腦溝、基底節(jié)區(qū)高密度。頭顱磁共振成像、頭顱磁共振彌散加權(quán)成像正常，腦電圖正常。Gesell發(fā)育診斷量表：個人社交相當(dāng)于16.9周(發(fā)育商development quotient，DQ 48.4分)，適應(yīng)性相當(dāng)于16周(DQ 45.8分)，粗大運動相當(dāng)于16周(DQ 45.8分)，精細運動相當(dāng)于12.0周(DQ 34.4分)語言能力相當(dāng)于10.7周(DQ 30.7分)。兒童運動發(fā)育評估量表(粗大運動功能評估 Gross Motor Function Measure，GMFM)：患兒粗大運動相當(dāng)于4月齡水平，建議加強粗大運動功能訓(xùn)練。兒童運動發(fā)育評估量表(精細運動能力評定表 Fine motorfunction measure, FMFM))：患兒精細運動功能發(fā)育水平較同齡兒落后，相當(dāng)于3月齡水平，建議加強精細運動功能訓(xùn)練。

圖1 患兒特殊面容、圖2 全外顯子測序與Sanger測序結(jié)。圖2A:先證者c.2312C＞G雜合突變在父親基因組中未檢測到；圖2B:先證者c.445G＞A雜合突變在父親基因組中驗證；圖2C:先證者c.2312C＞G雜合突變在母親基因組中驗證，姐姐基因組未驗證；圖2D:先證者c.445G＞A雜合突變在母親和姐姐基因組中均未驗證。

2.2 突變檢測及驗證結(jié)果全外顯子測序(WES)結(jié)果顯示，在先癥者MCPH1基因第6外顯子上發(fā)現(xiàn)錯義突變c.445G＞A，該突變會使纈氨酸被異亮氨酸替換(Val149Lle)；第13外顯子上發(fā)現(xiàn)另一錯義突變c.2312C＞G，同樣會導(dǎo)致脯氨酸被精氨酸替換(Pro771Arg)。對先證者及其父母和姐姐進行Sanger 驗證，結(jié)果見表1及圖2。先證者父親攜帶MCPH1基因c.445G＞A變異，未檢測到c.2312C＞G。母親則攜帶MCPH1基因c.2312C＞G變異，未檢測到c.445G＞A；2個變異姐姐均未檢測到。至此，推測先證者MCPH1基因上發(fā)現(xiàn)的2個錯義突變(c.445G＞A，c.2312C＞G)可能分別源自父親和母親，遺傳模式如圖3所示。

表1 突變檢測

圖3 家系圖譜。圖4 MCPH1基因編碼序列結(jié)構(gòu)示意圖。圖5 MCPH1 在大腦皮層發(fā)育中對神經(jīng)祖細胞的調(diào)控示意圖。

2.3 變異位點致病性分析檢索HGMD Pro、PubMed和ClinVar數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)MCPH1基因c.445G＞A和c.2312C＞G變異的報道(PM1)。ExAC數(shù)據(jù)庫和千人基因組數(shù)據(jù)庫中未見MCPH1基因c.445G＞A變異和c.2312C＞G變異被收錄(PM2)。根據(jù)OMIM數(shù)據(jù)庫描述，先證者表型高度符合MCPH1基因變異引起的MCPH(PP4)。采用Polyphen_2、SIFT、Mutation Taster預(yù)測變異致病性在線軟件預(yù)測MCPH1基因c.445G＞A變異為良性(BH4)，MCPH1基因c.2312C＞G變異為有害(PP3)。根據(jù)ACMG指南，綜合判斷MCPH1基因c.445G＞A為可能致病變異(PM1+PM2+PP4+BP4)，MCPH1基因c.2312C＞G亦為可能致病變(PM1+PM2+PP4+PP3)。

3 討 論

小頭畸形分為原發(fā)性小頭畸形和繼發(fā)性小頭畸形。原發(fā)性小頭畸形疾病是一種罕見的神經(jīng)分裂異常引起的腦發(fā)育疾病，病人主要臨床特征為頭圍減小并伴隨不同程度的智力衰退，疾病分型較多，OMIM數(shù)據(jù)庫收錄原發(fā)性小頭畸形共29個分型，其中原發(fā)性小頭畸形(1 型 )屬于常染色體隱性遺傳(AR，OMIM: 251200)，占比約19%。該疾病的致病基因是MCPH1(8p23.1)[3-4]。MCPH1基因編碼的MCPH1蛋白是一種神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)疾病的相關(guān)蛋白，與細胞分裂有關(guān)，常見于神經(jīng)系統(tǒng)中。當(dāng)MCPH1基因突變，編碼蛋白受阻，干擾中心體或紡錘體的正常形成，影響細胞周期及 DNA損傷修復(fù)等過程，進而影響神經(jīng)前體細胞的增殖、分化和凋亡等過程，最終導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少并形成偏小的大腦[5-8]。

MCPH1基因含14個外顯子(圖4)，其編碼蛋白含有3個BRCT結(jié)構(gòu)域，N端含有1個BRCT結(jié)構(gòu)域，C端含有2個串聯(lián)BRCT結(jié)構(gòu)域，分別為BRCT2和BRCT3，第8外顯子編碼的376-485個氨基酸形成的結(jié)構(gòu)域可以與凝縮蛋白II相互作用[7,9]。MCPH1通過結(jié)合不同的因子在細胞周期和DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用。MCPH1基因調(diào)節(jié)大腦大小，在胚胎大腦發(fā)育過程中用于調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞分裂模式相關(guān)的許多細胞功能。由于神經(jīng)干細胞的過早分化(圖五，紅點表示)和自我更新分裂的減少(圖五，綠點表示)以及功能受損導(dǎo)致神經(jīng)元生成不足(圖5，深紫色點表示)，受影響的個體會出現(xiàn)小頭畸形[8,10](圖5)。本例報告患兒基因致病證據(jù)不充分，生物信息學(xué)蛋白質(zhì)功能預(yù)測MCPH1基因c.445G＞A變異為良性，MCPH1基因c.2312C＞G變異為有害。但與患兒臨床表型高度符合，故考慮除MCPH1基因(8p23.1)區(qū)域突變可導(dǎo)致原發(fā)性小頭畸形疾病，是否存在影響功能內(nèi)含子區(qū)域的突變，還需進一步驗證。