楊琳琳 辛潔萍 張姝妍 王 鑫 譚景勻 王 璇 程水清 文 佳 徐新房 李向日

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制研究中心/中藥品質(zhì)評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,102488)

烏梅為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實(shí),具有斂肺,澀腸,生津,驅(qū)蛔的功效[1],主產(chǎn)于四川、福建、云南等[2]。其化學(xué)成分包括枸櫞酸等有機(jī)酸類成分等[3],具有抑菌、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種藥理作用[4]。

烏梅的凈制最早出現(xiàn)在漢代《傷寒論》中[5]。研究表明烏梅肉中枸櫞酸的含量明顯高于烏梅[6]。王貴林和張昊[7]比較烏梅、烏梅肉、烏梅核對豚鼠離體膽囊平滑肌作用后發(fā)現(xiàn)烏梅肉對膽囊的松弛作用較強(qiáng)。為保證臨床用藥安全有效,需要研究凈制對烏梅質(zhì)量的影響。

烏梅肉臨床應(yīng)用廣泛，如《傷寒論》中經(jīng)典名方烏梅丸，方中大量使用烏梅肉為君藥[8]。中藥的質(zhì)量是影響臨床用藥的關(guān)鍵[9]?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版收載了烏梅、烏梅肉和烏梅炭3種飲片規(guī)格，其中，烏梅肉項(xiàng)僅對炮制方法進(jìn)行了規(guī)定，其他質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)缺失。在地方炮制規(guī)范中，僅《山東省中藥飲片炮制規(guī)范·2012版》[10]對烏梅肉有較詳細(xì)的測定，但未規(guī)定含量測定項(xiàng)。標(biāo)準(zhǔn)中烏梅肉部分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)缺失、地方炮制規(guī)范限度指標(biāo)是否合理等問題嚴(yán)重影響烏梅肉的質(zhì)量控制，亟須規(guī)范烏梅肉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以保證臨床烏梅肉飲片質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 檢測器2489(型號:UV/Vis Detector)、進(jìn)樣器(型號:Alliance 2695),高效液相色譜儀(沃特世公司,美國,型號:Waters-e2695)、色譜柱(Agilent公司,美國,型號:Agilent Zorbax SB-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm),顯微鏡(奧林巴斯公司,日本,型號:BX51),FW100高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司,型號:DFT-100),十萬分之一電子天平(賽多利斯儀器系統(tǒng)公司,德國,型號:SARTORIUS BS110S),電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司,型號:FA1104),電熱鼓風(fēng)干燥箱(常州諾基儀器有限公司,型號:DHG-9070A)、超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司,型號:SB25-12DTDN),數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,型號:KQ-600DE)。

1.2 試藥 乙腈[色譜級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,批號:387L-25962U]、磷酸[色譜級,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,批號:218128]、磷酸二氫銨(分析純,北京化工廠,批號:20110111)、枸櫞酸對照品(含量99.7%,中國食品藥品檢定研究院,批號:100396-202104)、熊果酸對照品(含量99.9%,中國食品藥品檢定研究院,批號:110742-201823)、烏梅對照藥材(中國食品藥品檢定研究院,批號:121208-201707)、娃哈哈礦泉水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司,批號:3121GH)。

1.3 樣品信息 12批烏梅樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定,均為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)。21批烏梅肉,其中12批為烏梅樣品蒸制所得各批次烏梅肉;其余9批來源于亳州市滬譙藥業(yè)有限公司和亳州中藥材市場,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定為薔薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)的果肉。樣品信息見表1。

表1 烏梅肉樣品信息及外觀性狀

2 方法與結(jié)果

2.1 烏梅2種凈制方法的比較研究

2.1.1 蒸制時(shí)間的考察 取WM0101 250 g,置于蒸鍋內(nèi)平鋪一層,查看不同蒸制時(shí)間烏梅的軟化程度。蒸制20 min時(shí),樣品基本軟化,但隨著剝?nèi)鈺r(shí)間的推移,未凈制的樣品開始發(fā)硬,不易剝?nèi)?30 min時(shí)所得軟化藥材易于剝?nèi)?到40 min時(shí),部分樣品果肉成泥狀,軟化過度。故實(shí)驗(yàn)采用了蒸制30 min進(jìn)行軟化。

2.1.2 潤制時(shí)間的考察 取WM0101 250 g,用潤濕的紗布包裹好,平鋪一層放于搪瓷盤內(nèi)潤制,并隨時(shí)查看烏梅的潤制程度,確定潤制時(shí)間。烏梅潤制時(shí)間較長,6 h時(shí)仍無法剝?nèi)?故潤制時(shí)間定為潤制過夜,所得樣品易于剝?nèi)?無破爛。

2.1.3 凈制 蒸法:取WM0101、WM0102、WM0103各250 g,置于蒸鍋內(nèi)平鋪一層,蒸制30 min,取出,趁軟剝?nèi)?置50 ℃烘箱內(nèi)烘干,即得。見圖1。產(chǎn)率見表2。潤法:取WM0101、WM0102、WM0103各250 g,用潤濕的紗布包裹好,平鋪一層放于搪瓷盤內(nèi)至潤透,取出,剝?nèi)?置50 ℃烘箱內(nèi)烘干,即得。見圖1。產(chǎn)率見表2。

圖1 烏梅肉

表2 烏梅肉2種凈制方法的比較(%)

2.1.4 水分 依照《中華人民共和國藥典(四部)》2020年版通則水分測定法第二法測定。見表2。

2.1.5 浸出物 依照《中華人民共和國藥典(四部)》2020年版通則水溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法測定。見表2。

2.1.6 枸櫞酸含量測定

2.1.6.1 提取次數(shù)的考察 取WM0101-R,依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項(xiàng)下供試品溶液制備方法,制備提取1次、2次的供試品溶液,依照高效液相色譜法測定。烏梅肉中枸櫞酸提取次數(shù)的考察結(jié)果見表3。

表3 烏梅肉中枸櫞酸提取次數(shù)(%)

結(jié)果表明第1次提取所得枸櫞酸含量小于第1次提取所得枸櫞酸含量的5%,說明提取完全。

2.1.6.2 枸櫞酸含量測定 依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項(xiàng)下高效液相色譜法測定。枸櫞酸高效液相色譜圖、蒸烏梅肉色譜圖見和潤烏梅肉高效液相色譜圖見圖2。枸櫞酸含量測定結(jié)果見表2。烏梅肉樣品色譜峰面積與枸櫞酸對照品的面積比為1～1.5∶1,因此《中華人民共和國藥典》所載烏梅枸櫞酸檢測方法可用于烏梅肉中枸櫞酸的檢測。

圖2 烏梅肉樣品和對照品高效液相色譜圖

2.2 凈制對烏梅質(zhì)量的影響

2.2.1 烏梅樣品的凈制 蒸法:取凈烏梅,置于蒸鍋內(nèi),蒸制30 min取出,趁軟剝?nèi)?置50 ℃烘箱內(nèi)烘干,即得。見圖3。烏梅不同部位產(chǎn)率見表4。

圖3 烏梅、烏梅核及烏梅肉樣品

表4 烏梅不同部位的產(chǎn)率(%)

2.2.2 水分 依照《中華人民共和國藥典(四部)》2020年版通則水分測定法第二法測定。烏梅各部位水分見表5。

表5 烏梅不同部位浸出物及枸櫞酸含量測定結(jié)果(%)

2.2.3 浸出物 依照2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》通則水溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法測定。烏梅各部位浸出物結(jié)果見表5。

2.2.4 枸櫞酸含量測定 依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項(xiàng)下高效液相色譜法測定。烏梅各部位高效液相色譜圖見圖4,枸櫞酸含量見表5。

圖4 烏梅不同部位高效液相色譜圖

本實(shí)驗(yàn)采用蒸法對烏梅進(jìn)行軟化,剝?nèi)?各部位占比見圖5。烏梅肉的平均占比為35.9%,烏梅核的平均占比為56.8%。因此,為保證臨床用藥劑量的準(zhǔn)確性,去核是非常有必要的。與烏梅飲片比較,烏梅肉和烏梅核在浸出物以及枸櫞酸的含量上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與烏梅核比較,烏梅肉在浸出物以及枸櫞酸的含量上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。因此凈制去核是非常有必要的。見圖6。

圖5 烏梅肉產(chǎn)率

圖6 烏梅不同部位浸出物與枸櫞酸含量測定結(jié)果

2.3 烏梅肉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

2.3.1 性狀 對烏梅肉的色澤、氣味、質(zhì)地進(jìn)行描述、記錄。21批烏梅肉的性狀描述見表1,烏梅肉外表皮黑色或灰色,內(nèi)部紅棕色,無核。味酸。

2.3.2 鑒別

2.3.2.1 顯微鑒別 取烏梅肉粉末(過二號篩),水合氯醛裝片后在顯微鏡下觀察。烏梅肉的顯微鑒定結(jié)果見圖7。非腺毛,單細(xì)胞,呈彎曲或鉤狀,包腔內(nèi)含黃棕色物。果皮表皮細(xì)胞淡黃棕色,多角形,壁稍厚,部分有非腺毛或毛茸脫落后的痕跡。石細(xì)胞淡綠色或棕黃色,胞腔內(nèi)含黃棕色物。纖維單個(gè)或成束,壁黃色,呈梭形。含螺紋導(dǎo)管、具緣紋孔導(dǎo)管。

圖7 烏梅肉顯微鑒定

2.3.2.2 薄層鑒別 取烏梅肉粉末2 g,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,加乙醚振搖提取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,殘?jiān)檬兔?30～60 ℃)浸泡2次,每次15 mL(浸泡約2 min),傾去石油醚,殘?jiān)訜o水乙醇2 mL使溶解,作為供試品溶液。另取烏梅對照藥材5 g,同法制成對照藥材溶液。再取熊果酸對照品,加無水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn),吸取上述3種溶液各1～2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

烏梅肉薄層鑒別結(jié)果見圖8,在供試品色譜中,在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色斑點(diǎn)。

圖8 烏梅肉薄層鑒別

2.3.3 水分 依照2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》通則水分測定法第二法測定。21批烏梅肉的水分測定結(jié)果見表6。12批自制烏梅肉的平均水分為10.7%,9批市售烏梅肉的平均水分為12.0%,21批烏梅肉水分的平均含量為11.3%,標(biāo)準(zhǔn)差1.9%。其中WMR0109為異常值。去除異常值后,20批烏梅肉的平均水分含量為11.0%,標(biāo)準(zhǔn)差為1.4%。在20批水分平均值的基礎(chǔ)上加上其2倍的標(biāo)準(zhǔn)差,作為水分的限度標(biāo)準(zhǔn),故將水分的標(biāo)準(zhǔn)擬定為:不得過13.0%。

表6 烏梅肉水分、浸出物、枸櫞酸含量測定結(jié)果(%)

2.3.4 浸出物 依照2020年版《中華人民共和國藥典(四部)》通則水溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法測定。21批烏梅肉的浸出物測定結(jié)果見表6。12批自制烏梅肉的平均浸出物為72.5%,9批市售烏梅肉的平均浸出物為71.3%,21批烏梅肉的平均浸出物含量為72.0%,標(biāo)準(zhǔn)差為3.4%。在21批浸出物平均值的基礎(chǔ)上減去其2倍的標(biāo)準(zhǔn)差,作為浸出物的限度標(biāo)準(zhǔn),故將浸出物的限度標(biāo)準(zhǔn)擬定為:【浸出物】照水溶性浸出物測定法(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測定,不得少于65.0%。

2.3.5 枸櫞酸含量測定 依照《中華人民共和國藥典》2020年版烏梅【含量測定】項(xiàng)下高效液相色譜法測定。21批烏梅肉的枸櫞酸含量測定結(jié)果見表6。12批自制烏梅肉的平均枸櫞酸含量為33.1%,9批市售烏梅肉的枸櫞酸含量為34.8%,21批烏梅肉枸櫞酸平均含量為33.8%,標(biāo)準(zhǔn)差為4.5%。在21批枸櫞酸含量的平均值的基礎(chǔ)上減去其2倍的標(biāo)準(zhǔn)差,故將枸櫞酸的含量限度標(biāo)準(zhǔn)擬定為:【含量測定】同藥材,含枸櫞酸(C6H8O7)不得少于25.0%。

2.3.6 小結(jié)

傳統(tǒng)的性狀鑒定方法具有直觀、快速的特點(diǎn)。烏梅肉是由烏梅去核而得,其外表皮黑色或灰色,內(nèi)部紅棕色,無核。味酸。

在烏梅肉的顯微鑒別中,非腺毛單細(xì)胞,呈彎曲狀或作鉤狀,胞腔內(nèi)含黃棕色物。石細(xì)胞淡綠色或棕黃色,胞腔內(nèi)含黃棕色物。纖維單個(gè)或成束,壁黃色,呈梭形。含螺紋導(dǎo)管、具緣紋孔導(dǎo)管。果皮表皮細(xì)胞淡黃棕色,表面觀類多角形,壁稍厚,非腺毛或毛茸脫落后的痕跡多見。其中石細(xì)胞、纖維、導(dǎo)管和表皮細(xì)胞在顯微鏡下觀察到的數(shù)量較少,多數(shù)為非腺毛。

在薄層鑒別中,烏梅肉與烏梅對照藥材色譜和熊果酸對照品在薄層色譜的相應(yīng)的位置上,顯相同顏色斑點(diǎn),這與烏梅藥材的鑒別方法一致,但考慮到烏梅肉中熊果酸的含量高于烏梅,故在取樣量上進(jìn)行了減少,以免供試品濃度過高,造成拖尾。

水分是中藥飲片在儲存過程保證質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。水分過高,霉菌新陳代謝的作用增強(qiáng),生長繁殖加快,易引起中藥飲片的蟲蛀、霉變。浸出物測定對于控制中藥材和飲片質(zhì)量具有重要意義,尤其是對于有效成分不明確或者多類成分均具有藥效作用的中藥。對烏梅肉水溶性浸出物采用熱浸法測定,要求是不得少于40.0%。本實(shí)驗(yàn)測得除去異常值WMR0109之外的20批烏梅肉水分的平均含量為11.0%,符合《中華人民共和國藥典》飲片水分通常不得過13.0%的要求,WMR0109的水分結(jié)果為17.2%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過烏梅肉均值,該水分下烏梅肉極易發(fā)霉變質(zhì),去除異常值可以更好更貼合實(shí)際制定烏梅肉飲片標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到生產(chǎn)的實(shí)際情況,烏梅肉水分不得過13.0%。本實(shí)驗(yàn)測得21批烏梅肉的水溶性浸出物平均值為72.0%,考慮到生產(chǎn)的實(shí)際情況,將烏梅肉浸出物照水溶性浸出物測定法(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測定,不得少于65.0%。提高了烏梅肉水溶性浸出物的限度要求,以便更好控制烏梅肉質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)測得21批烏梅肉枸櫞酸含量為33.8%?？紤]到生產(chǎn)的實(shí)際情況,認(rèn)為烏梅肉含枸櫞酸(C6H8O7)不得少于25.0%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對烏梅蒸和潤的軟化時(shí)間進(jìn)行考察。最后確定蒸法蒸制30 min,潤法潤制過夜,對烏梅樣品進(jìn)行凈制得到烏梅肉。從產(chǎn)率、浸出物以及枸櫞酸含量等方面,比較了2020年版《中華人民共和國藥典》中收載烏梅肉蒸制、潤制2種凈制方法的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn):二者并無顯著性差異。在凈制時(shí)間上,蒸法所用時(shí)間遠(yuǎn)短于潤法,且潤法軟化時(shí)會存在部分飲片表面質(zhì)地較硬,水分不易滲透的現(xiàn)象;凈制后的烘干采用50 ℃低溫烘干[11],在烘干時(shí)間上,蒸法與潤法沒有差別,故本實(shí)驗(yàn)未將烘干時(shí)間納入考察范圍。因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)選擇了蒸法對烏梅進(jìn)行凈制。

烏梅凈制可以去除非藥用部位,提高枸櫞酸及浸出物含量。通過對烏梅的核和肉2個(gè)部位的浸出物以及枸櫞酸含量的比較,發(fā)現(xiàn)二者存在極顯著性差異,且烏梅樣品大小不一,果核的占比不同,為了保證臨床用藥的準(zhǔn)確性,凈制是非常有必要的。對于凈制對烏梅質(zhì)量的影響研究,本實(shí)驗(yàn)僅基于浸出物及枸櫞酸含量進(jìn)行研究,未對凈制過程中可能出現(xiàn)的其他化學(xué)成分傳遞與轉(zhuǎn)化規(guī)律進(jìn)行研究,課題組后續(xù)將通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究不同凈制方法對烏梅化學(xué)成分的影響。在2020年版《中華人民共和國藥典》烏梅【含量測定】項(xiàng)下,所用粉末為最粗粉,即過一號篩,而實(shí)驗(yàn)中所得一號篩粉末顆粒較大,尤其烏梅核占比較大,容易造成取樣不均勻,測定數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確,故實(shí)驗(yàn)時(shí)采用二號篩粉末進(jìn)行測定,建議《中華人民共和國藥典》烏梅【含量測定】項(xiàng)進(jìn)行相應(yīng)修改。

烏梅肉為斂肺澀腸常用藥[12-15],臨床應(yīng)用廣泛,需求量大。其質(zhì)量是影響臨床療效的關(guān)鍵,本實(shí)驗(yàn)通過提高烏梅肉的水分、浸出物標(biāo)準(zhǔn)要求及增加含量測定限度,對烏梅肉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善,以期對市場上烏梅肉的質(zhì)量進(jìn)行控制,更好地保證臨床療效。烏梅肉較烏梅藥效物質(zhì)含量明顯升高,更利于臨床療效的發(fā)揮,但市場上烏梅肉飲片并不廣泛流通,建議引起飲片生產(chǎn)企業(yè)和中醫(yī)臨床的重視,保證烏梅肉飲片的臨床供應(yīng),提高中醫(yī)臨床療效。

利益沖突聲明:無。