劉煜　李鳴　吳永貴　楊瓊

摘要 目的：探討薯蕷健脾益智合劑對(duì)血管性癡呆（VaD）大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響以及相關(guān)作用機(jī)制。方法：采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（2－VO）法建立VaD大鼠模型，將120只大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組，每組30只。治療組予以10 mL/（kg·d）薯蕷健脾益智合劑灌胃，正常組、假手術(shù)組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，持續(xù)8周。觀(guān)察大鼠一般狀態(tài)，并于造模后第7天及造模后治療4、8周分別進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)，蘇木精－伊紅（HE）染色觀(guān)察海馬神經(jīng)元組織學(xué)改變，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色觀(guān)察海馬神經(jīng)元凋亡情況，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)絲分裂原活化蛋白激酶K2（MEKK2）、絲分裂原活化蛋白激酶K3（MEKK3）和絲裂原激活蛋白激酶5（MEK5）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）表達(dá)的變化，蛋白免疫印跡法檢測(cè)MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的蛋白表達(dá)。結(jié)果：與正常組及假手術(shù)組比較，模型組行為學(xué)表現(xiàn)差異顯著，變性神經(jīng)元增加，神經(jīng)元凋亡率增加（P＜0.01），MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的表達(dá)減少；與模型組比較，治療組行為學(xué)表現(xiàn)改善，變性神經(jīng)元減少，神經(jīng)元凋亡率降低（P＜0.05或P＜0.01），MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5表達(dá)增加。結(jié)論：薯蕷健脾益智合劑可能通過(guò)上調(diào)ERK5信號(hào)通路，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)海馬神經(jīng)元的修復(fù)進(jìn)而治療VaD。

關(guān)鍵詞 血管性癡呆；薯蕷健脾益智合劑；神經(jīng)元凋亡；絲裂原激活蛋白激酶5，ERK5；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.012

Effect of Modified Shuyu Pill on Hippocampal Neuron Apoptosis in Vascular Dementia Rats Based on ERK5 Signaling Pathway

LIU Yu， LI Ming， WU Yonggui， YANG Qiong

Hubei Province Hospital of TCM， Wuhan 430061， Hubei， China

Corresponding Author LI Ming， E－mail： 385579@qq.com

Abstract Objective：To investigate the effect of modified Shuyu Pill on hippocampal neuron apoptosis in rats with vascular dementia（VaD）.Methods：The modified bilateral common carotid artery ligation（2－VO） was used to establish the VaD rat model.One hundred and twenty rats were randomly divided into normal group，control group，model group，and treatment group，with 30 rats in each group.The treatment group was given 10 mL/（kg·d） modified Shuyu Pill by intragastric administration.The normal group，control group，and model group were given the same volume of normal saline.The intervention lasted for 8 weeks.Behavior detection were performed at the 7th day after modeling，and 4 and 8 weeks，vespectively after treatment.Histological changes of hippocampal neurons were observed by hematoxylin－eosin（HE） staining.The apoptosis of hippocampal neurons was observed by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）－mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.The expression of mitogen－activated protein kinase K2（MEKK2），mitogen－activated protein kinase K3（MEKK3），mitogen－activated protein kinase 5（MEK5），and extracellular signal－regulated kinase 5（ERK5） were detected by immunohistochemistry.The protein expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 were detected by Western Blot.Results：Compared with the normal group and control group，the behavior of the model group was significantly different，the degeneration of neurons increased，the apoptosis rate of neurons increased（P＜0.01），and the expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 decreased.Compared with the model group，the behavioral performance of the treatment group improved，the degeneration of neurons reduced，the apoptosis rate of neurons decreased（P＜0.05 or P＜0.01），and the expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 significantly increased.Conclusion：Modified Shuyu Pill may inhibit the apoptosis of hippocampal neurons and promote the repair of hippocampal neurons to treat VaD by up－regulating ERK5 signaling pathway.

Keywords vascular dementia; modified Shuyu Pill; neuron apoptosis; extracellular signal－regulated kinase 5， ERK5; experimental study

隨著人口老齡化問(wèn)題加劇，癡呆癥的患病率預(yù)計(jì)將在未來(lái)幾十年內(nèi)不斷增加［1］。血管性癡呆（vascular dementia，VaD）占癡呆病例的15%，是僅次于阿爾茨海默?。ˋD）的常見(jiàn)癡呆癥，主要因腦缺血損傷，而表現(xiàn)出認(rèn)知障礙與行為損害的進(jìn)行性下降［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，15%～30%的病人在腦卒中發(fā)生幾個(gè)月后發(fā)展為癡呆，并且有20%～25%的病人發(fā)展為遲發(fā)性癡呆［3］。正是由于大腦的復(fù)雜協(xié)調(diào)，同時(shí)存在其他腦損傷原因，VaD病人認(rèn)知功能的改變包含注意力、信息處理和執(zhí)行功能的損傷等可能具有可逆性［4］。但針對(duì)VaD的治療缺乏特異性，很少有藥物被批準(zhǔn)專(zhuān)門(mén)用于預(yù)防或治療VaD。因此，與AD相似，VaD的治療策略包括使用膽堿酯酶抑制劑和美金剛等，以及心理支持治療。中醫(yī)藥不僅能緩解VaD病人的臨床癥狀，還可以預(yù)防VaD的發(fā)生。在前期研究中已發(fā)現(xiàn)，薯蕷健脾益智合劑能明顯改善VaD病人臨床評(píng)分量表［5］，減少神經(jīng)元凋亡，修復(fù)海馬神經(jīng)元，改善記憶功能減退［6］，但其具體機(jī)制仍不清楚。因此，本研究采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（2－VO）法［7］建立VaD大鼠模型，觀(guān)察大鼠行為學(xué)、海馬病理改變以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)的變化，進(jìn)而分析薯蕷健脾益智合劑改善VaD海馬神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)Wistar大鼠120只，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015－0018，雄性，體質(zhì)量（250±20）g。于SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物保護(hù)指導(dǎo)原則進(jìn)行動(dòng)物研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及實(shí)驗(yàn)流程均經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

薯蕷健脾益智合劑，由湖北省中醫(yī)院藥劑科制備（批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20150027，批號(hào)：20160913），組方：山藥30 g，熟地黃24 g，制何首烏24 g，黨參20 g，白芍20 g，當(dāng)歸20 g，遠(yuǎn)志12 g，石菖蒲14 g，川芎10 g，炒白術(shù)18 g，茯苓18 g，杜仲12 g，枸杞子18 g，五味子10 g。將方藥浸泡0.5 h后水煎3次，過(guò)濾合并，經(jīng)物理方法將合并后的水煎劑濃縮至每毫升含原生藥量1.0 g，經(jīng)120 ℃、400 kPa條件下消毒25 min，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、甲醇均購(gòu)自武漢谷歌生物有限公司（貨號(hào)分別為R20259、R21295、S30288）；兔多抗絲分裂原活化蛋白激酶K2（MEKK2）、鼠單抗絲分裂原活化蛋白激酶K3（MEKK3）、兔多抗絲裂原激活蛋白激酶5（MEK5）、鼠單抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司（貨號(hào)分別為19607S、60291－1－Ig、18464S、19677－1－AP）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記兔抗大鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司（貨號(hào)分別為BA1058、BA1054）等。

MT－200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Neofuge 15R（Thermo公司）；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（德國(guó)美康公司，型號(hào)：HM355 S型）；Bio－plex電泳儀（Bio－Rad公司）；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）等。

1.4 模型制備

采用改良2－VO法制備VaD大鼠模型，乙醚吸入麻醉后，于手術(shù)臺(tái)上固定，在頸部正中偏左切開(kāi)皮膚，逐層鈍性分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈，依次結(jié)扎頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端，用剪刀從中間剪斷后進(jìn)行縫合。1周后對(duì)右側(cè)頸總動(dòng)脈實(shí)施手術(shù)，方法同上。整個(gè)手術(shù)過(guò)程中進(jìn)行電加熱，以維持大鼠體溫，保證生存。造模7 d后，用水迷宮檢測(cè)大鼠探索平臺(tái)的時(shí)間和通過(guò)平臺(tái)的次數(shù)，與未造模大鼠相比，探索時(shí)間明顯延長(zhǎng)，通過(guò)次數(shù)顯著減少，顯示造模成功。

1.5 動(dòng)物分組及給藥方法

將120只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組和治療組，每組30只。正常組不予造模，正常飼養(yǎng)；假手術(shù)組作為對(duì)照，于頸部切開(kāi)皮膚，分離出頸總動(dòng)脈，既不結(jié)扎也不剪斷，暴露5 min后直接縫合皮膚；模型組和治療組均采用改良2－VO法進(jìn)行模型制備。造模后第7天開(kāi)始，根據(jù)前期給藥劑量相關(guān)研究［8］，薯蕷健脾益智合劑成人（體重60 kg）推薦劑量為1.6 g/kg，按成人臨床推薦劑量與人鼠換算公式，予以等劑量折算，即大鼠給藥劑量＝人給藥劑量×換算系數(shù)＝1.6 g/（kg·d）×6.3≈10 g/（kg·d），可得治療組予以薯蕷健脾益智合劑煎劑10 g/（kg·d）灌胃，按照大鼠體質(zhì)量及薯蕷健脾益智合劑水煎劑濃縮濃度，治療組給予薯蕷健脾益智合劑10 mL/（kg·d）灌胃，正常組、模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，持續(xù)8周。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

各組大鼠行斷頸處死，取大鼠海馬組織，一部分放入4%多聚甲醛溶液中，常溫或者4 ℃保存，另一部分放入1.5 mL滅菌的EP管中，并快速置入－80 ℃超低溫冰箱，以備待測(cè)。

1.6.1 一般情況與行為學(xué)檢測(cè)

從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始每天觀(guān)察大鼠的形態(tài)、皮毛色澤、排泄物、精神情緒變化、活動(dòng)程度以及飲食進(jìn)水狀況水平。

Morris水迷宮測(cè)試包含空間探索實(shí)驗(yàn)和定位航行實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)能力（逃避潛伏期）。將池分為4個(gè)象限，放置圓形平臺(tái)在水池第3象限，每次根據(jù)第1象限、第2象限、第3象限、第4象限的順序?qū)⒋笫蠓湃氤刂?，記錄大鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間，持續(xù)5 d?？臻g探索實(shí)驗(yàn)，是在第6天撤離平臺(tái)，大鼠從第2象限放入，觀(guān)察90 s內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和在第3象限停留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)利用逃避潛伏期、通過(guò)平臺(tái)的次數(shù)、目標(biāo)象限停留百分比評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)和記憶的能力。各組大鼠造模后1周（治療前）、藥物干預(yù)后第4周和第8周進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)。

1.6.2 蘇木精－伊紅（HE）染色法評(píng)估海馬形態(tài)變化

各組大鼠斷頸處死后迅速取海馬組織，中性固定液固定，石蠟包埋，切片（0.4 μm），二甲苯、乙醇梯度脫蠟并用蘇木精、伊紅染液染色，最后依次進(jìn)行脫水、透明、封片，然后經(jīng)37 ℃烤箱烘干置于切片盒中，常溫保存，并使用顯微鏡和成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.6.3 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法評(píng)估海馬神經(jīng)元凋亡水平

DNA核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）生物素末端標(biāo)記法切口。按Bowringmann公司（德國(guó)）凋亡原位檢測(cè)試劑盒程序。二甲苯脫蠟石蠟切片，37 ℃，20 mg/L蛋白酶K消化30 min，PBS洗滌3次，TUNEL反應(yīng)液滴加，37 ℃，60 min，PBS震洗后洗滌加入轉(zhuǎn)烷基苯酚（AP），37 ℃，60 min，最后加入顯色底物滴加5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸鹽（BCIP）/硝基四氮唑藍(lán)（NBT），10 min終止反應(yīng)，脫水，透明，封片，分析。結(jié)合CMIAS系列病理圖像分析系統(tǒng)（4.0）凋亡分析模塊，量化海馬凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.6.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5表達(dá)水平

取大鼠海馬組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，然后脫蠟和水化、抗原修復(fù)、消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色、復(fù)染、脫水、透明和封片。每組取10張切片，隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野，運(yùn)用Image－Pro Plus 6.0軟件對(duì)MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5的表達(dá)進(jìn)行累計(jì)光密度分析，計(jì)算平均光密度值。

1.6.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠海馬MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5蛋白表達(dá)水平

取大鼠海馬組織，提取蛋白，將制備的蛋白樣品通過(guò)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、染色、一抗孵育、二抗孵育，顯色后，應(yīng)用全自動(dòng)熒光與可見(jiàn)光凝膠成像分析系統(tǒng)曝光。以β－actin作為內(nèi)參，運(yùn)用分析軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行檢測(cè)，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。首先對(duì)定量資料進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)

造模前，各組大鼠一般情況正常，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，皮膚黏膜光滑紅潤(rùn)，皮毛發(fā)亮有光澤，鼻頭眼角無(wú)分泌物，耳廓色澤淡粉，糞便成形，干稀適中。正常組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一般情況均無(wú)明顯變化。假手術(shù)組于術(shù)后3 d內(nèi)出現(xiàn)輕度的毛發(fā)臟亂和枯黃不順、精神萎靡，其余一般情況良好。經(jīng)正常飼養(yǎng)后，一般情況逐漸基本恢復(fù)，與正常組比較差異不明顯。模型組大鼠于造模后，開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)臟亂和枯黃不順、懶動(dòng)時(shí)常倦臥、厭食厭水、眼裂減小、唇甲紫暗、腹部脹滿(mǎn)、四肢逐漸消瘦甚至逐漸死亡。予以藥物灌胃后，與模型組比較，治療組一般情況有明顯改善。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 各組不同時(shí)間逃避潛伏期比較

造模后第7天（治療前），模型組和治療組逃避潛伏期較正常組、假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后治療4、8周，治療組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.2.2 各組不同時(shí)間跨越平臺(tái)次數(shù)比較

治療前，模型組和治療組跨越平臺(tái)次數(shù)較正常組、假手術(shù)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療組在造模后治療4、8周跨越平臺(tái)次數(shù)較治療前明顯增加（P＜0.05）；造模后治療8周，治療組跨越平臺(tái)次數(shù)較模型組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.3 海馬神經(jīng)元病理學(xué)結(jié)果

海馬HE染色后顯示，與正常組相比，模型組大鼠錐體細(xì)胞排列稀疏不規(guī)則，細(xì)胞間距變寬，細(xì)胞核體積變小，染色加深，核仁欠清，部分細(xì)胞壞死。與模型組比較，治療組大鼠海馬錐體排列整齊，細(xì)胞稍緊密，形態(tài)輪廓清晰，核仁清晰。詳見(jiàn)圖1。

2.4 TUNEL染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡結(jié)果

治療前，模型組、治療組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率較正常組、假手術(shù)組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在造模后治療4、8周，治療組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見(jiàn)圖2、圖3、表3。

2.5 海馬組織中MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的表達(dá)

2.5.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在造模后治療4周，治療組海馬神經(jīng)元中MEKK2、MEK5陽(yáng)性細(xì)胞光密度值較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。在造模后治療8周，模型組海馬神經(jīng)元中MEKK3陽(yáng)性細(xì)胞光密度值較假手術(shù)組明顯降低，治療組海馬神經(jīng)元中MEK5陽(yáng)性細(xì)胞光密度值較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖4、表4、表5。

2.5.2 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在造模后治療4周，模型組海馬神經(jīng)元中MEK5蛋白表達(dá)較正常組、假手術(shù)組明顯減少，治療組MEK5蛋白表達(dá)則較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在造模后治療8周，與假手術(shù)組比較，模型組海馬神經(jīng)元中MEKK3蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少，治療組MEKK3蛋白則較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖5、表6、表7。

3 討 論

VaD是以認(rèn)知和行為缺陷，并伴有相關(guān)神經(jīng)血管損傷體征為特征的神經(jīng)退行性病癥［9－10］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅著老年人的身心健康，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)報(bào)道，這些認(rèn)知損傷主要由慢性腦灌注不足繼發(fā)神經(jīng)退行性變、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥［11－12］。因此，本研究以神經(jīng)細(xì)胞凋亡為切入點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)研究。

研究證明，薯蕷健脾益智合劑能有效抑制海馬神經(jīng)元凋亡，從而緩解VaD認(rèn)知功能障礙［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)改良2－VO法造模后的大鼠存在明顯的認(rèn)知障礙，包括較長(zhǎng)的逃避潛伏期和較短的目標(biāo)象限時(shí)間，以及不同程度的毛色臟亂枯暗、唇甲紫暗、精神萎靡、睡眠增多等一般狀態(tài)，證實(shí)2－VO法制作VaD模型的可行性。薯蕷健脾益智合劑能減輕2－VO誘導(dǎo)的行為學(xué)改變、海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變，減少海馬神經(jīng)元凋亡，最終改善認(rèn)知功能。說(shuō)明薯蕷健脾益智合劑能有效保護(hù)VaD模型認(rèn)知功能。

本研究結(jié)果顯示，模型組海馬神經(jīng)元凋亡率均高于正常組，且MEKK2、MEKK3、MEK5和ERK5表達(dá)下降，由此可見(jiàn)，大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡與ERK5信號(hào)傳導(dǎo)等因子的減少有關(guān)。有研究表明，ERK5可在海馬與嗅球成年神經(jīng)發(fā)生［13］。ERK5對(duì)氧化應(yīng)激敏感，并調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激組織中的細(xì)胞凋亡和炎癥，尤其是心腦血管系統(tǒng)中的細(xì)胞凋亡和炎癥［14］，且ERK5信號(hào)級(jí)聯(lián)對(duì)正常心腦血管發(fā)育和血管完整性至關(guān)重要［15－16］。此外，體外實(shí)驗(yàn)研究表明，在正常內(nèi)皮細(xì)胞中，ERK5是防止凋亡、介導(dǎo)剪切應(yīng)力信號(hào)、調(diào)節(jié)缺氧和細(xì)胞遷移所必需的［17］。ERK5是MEK5已知的唯一靶點(diǎn)，因此為信號(hào)整合創(chuàng)造了一個(gè)獨(dú)特的軸［18］。反過(guò)來(lái)，上游MEKK2和MEKK3經(jīng)磷酸化后，MEK5的激活被觸發(fā)［19－20］。而ERK5介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)是由多種細(xì)胞外刺激引起的，包括氧化應(yīng)激、滲透應(yīng)激、缺氧缺血條件、促炎細(xì)胞因子［21］。因此，在腦缺血損傷期間激活ERK5可防止缺血大鼠海馬CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡［22］，與本研究結(jié)果相符。本研究結(jié)果提示，治療組ERK5信號(hào)傳導(dǎo)等因子水平明顯上調(diào)，顯示薯蕷健脾益智合劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK5信號(hào)傳導(dǎo)等因子的升高，起到抗凋亡的作用，進(jìn)而保護(hù)VaD大鼠神經(jīng)元。

薯蕷健脾益智合劑是由湖北省中醫(yī)院已故名醫(yī)呂繼端教授所創(chuàng)立，主要由經(jīng)典名方薯蕷丸化裁而來(lái)。全方由熟地黃、枸杞、杜仲、何首烏等具有補(bǔ)腎益腦、填精益髓、化痰祛瘀等功效的藥物組成，諸藥合用，使臟腑氣血得生，陰陽(yáng)得平，可從健脾益髓、開(kāi)竅益智等方面有效緩解認(rèn)知功能障礙。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)薯蕷健脾益智合劑中多種藥物存在有效藥理成分，芍藥中芍藥苷具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、保護(hù)神經(jīng)元的作用，能有效降低促凋亡因子，阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡［23－25］。石菖蒲揮發(fā)油亦可有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［26］，通過(guò)降低腦組織興奮性遞質(zhì)，從而改善癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力［27］。黨參中人參皂苷能提高學(xué)習(xí)和記憶功能，其機(jī)制可能與促進(jìn)腦組織蛋白有關(guān)［28］。由此可見(jiàn)，薯蕷健脾益智合劑可通過(guò)多種有效成分，多方面阻止并逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元凋亡，緩解臨床癥狀。

綜上所述，薯蕷健脾益智合劑能有效抑制VaD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，改善VaD大鼠的認(rèn)知功能障礙，其具體機(jī)制可能與升高ERK5相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡的作用相關(guān)。

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（收稿日期：2022－09－27）

（本文編輯郭懷?。?/p>

基金項(xiàng)目 國(guó)家中醫(yī)藥管理局基金項(xiàng)目（No.JY/CACM002－2019）；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No.2015CFA089）

通訊作者 李鳴，E－mail：385579@qq.com

引用信息 劉煜，李鳴，吳永貴，等.基于ERK5信號(hào)通路探討薯蕷健脾益智合劑對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（1）：68－74.